袁芳 宋凱杰 蔡熙彤 楊澤東 王兵 蘭小中

摘 要：為建立西藏虎頭蘭（Cymbidium tracyanum）的高效快速繁殖體系，該研究以野生西藏虎頭蘭種子為外植體，通過分析不同基本培養(yǎng)基和植物激素配比對原球莖誘導、增殖和分化的影響，以及光照時間和培養(yǎng)溫度對試管苗生長的影響，篩選出適宜西藏虎頭蘭植株高效再生的條件。結果表明：適宜西藏虎頭蘭生長的基本培養(yǎng)基為1/2 MS;種子萌發(fā)和原球莖誘導的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA，培養(yǎng)50d后，有95.00%的種子發(fā)育成原球莖;原球莖增殖的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+2.0 mg·L-1 NAA，培養(yǎng)30d，增殖倍數(shù)為4.25;原球莖的最適分化培養(yǎng)基為1/2 MS+2.0 mg·L-1 NAA+60 g·L-1土豆泥+0.5 g·L-1活性炭，培養(yǎng)10d，不定芽發(fā)生率為98.33%，培養(yǎng)40d，幼苗生根率為94.67%;試管苗在溫度20 ℃、光照時間12 h·d-1、光照強度2 000 lx的條件下培養(yǎng)，苗長勢好，葉片生理性焦尖發(fā)生率僅為3.33%;以腐殖土作為栽培基質(zhì)，試管苗的移栽成活率為97.78%。該研究結果為保護西藏虎頭蘭野生資源和工廠化育苗提供了科學依據(jù)和技術支持。

關鍵詞：西藏虎頭蘭， 種子， 原球莖， 組織培養(yǎng)， 植株再生

中圖分類號：Q943.1， Q813.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）04-0482-08

Abstract：In order to establish a highly efficient plant regeneration system， Cymbidium tracyanum was selected as explant to screen out the conditions to regenerate with highly efficiency， by evaluating the effects of basic medium and hormone combination on the plant regeneration of C. tracyanum， and the effects of illumination time and culture temperature on the growth of plantlets were also studied. The results were as follows：The optimum basic medium for C. tracyanum growth was 1/2 MS. The optimal medium for protocorm induction was 1/2 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA， 95.00% of the seedsdeveloped into the protocorms after cultured for 50d. The optimal medium for protocorm proliferation was 1/2 MS+2.0 mg·L-1 NAA， the maximum proliferation multiple of protocorm reached 4.25 after cultured for 30d. The optimal medium for protocormdifferentiation was 1/2 MS+2.0 mg·L-1 NAA+60 g·L-1 mashed potato+0.5 g·L-1acticarbon， the induction rate of indefinite bud was 98.33% after cultured for 10d， the rooting rate was 94.67% after cultured for 40d. In the process of plantlets subculture， temperature of 20 ℃ ， illumination time of 12 h·d-1 and illumination intensity of? 2 000 lx were suited for the growth of plantlets， the physiological scorch rate of leaf tip was 3.33%. Using humus as cultivation substrate， the transplanting survival rate of plantlets was 97.78%. This study provides an effective way for keeping good varieties of features and rapid propagation of C. tracyanum， at the same time， helps to solve some theoretical problems in factory production of C. tracyanum.

Key words：Cymbidium tracyanum， seed， protocorm， tissue culture， plant regeneration

西藏虎頭蘭（Cymbidium tracyanum）是蘭科蘭屬附生型多年生草本植物，在中國主要分布于貴州西南部、云南西南部至東南部和西藏東南部（中國植物志編委會，1999）。西藏虎頭蘭的葉長碧綠，花姿粗曠，豪放壯麗，花香清淑，又名沉香虎頭蘭，適宜做盆栽或切花，具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值（李慧敏，2014;李枝林等，2005;王蓮輝等，2009;藍玉甜等，2010;陳和明等，2015）。野生西藏虎頭蘭的種子在自然條件下極難萌發(fā)，主要靠分株繁殖，資源再生緩慢，受到瀕危野生動植物國際貿(mào)易公約（CITES）的保護，被《中國物種紅色名錄》（植物部分）和《國家重點保護野生植物名錄》（第二批討論稿）列為Ⅰ級保護植物（中國科學院植物研究所，2013;劉思思等，2015;王喜龍，2018）。

國內(nèi)外以西藏虎頭蘭為研究材料的報道甚少，現(xiàn)有的研究主要集中在對環(huán)境脅迫的響應機制（匡美齡和張石寶，2015;Li & Zhang，2016;Li et al.， 2018）和組織培養(yǎng)研究（李枝林等，2005;王蓮輝等，2009;藍玉甜等，2010;陳和明等，2015）方面。雖然國內(nèi)學者以西藏虎頭蘭的種子為外植體開展了一些組培快繁研究，但仍然存在原球莖誘導和增殖分化率不高、幼苗弱、組培周期不穩(wěn)定等現(xiàn)象。因此，本研究利用種子誘導產(chǎn)生原球莖，通過對原球莖增殖以及再生條件的研究，旨在建立西藏虎頭蘭高效快速繁殖體系，為保護其野生資源及種苗生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為野生西藏虎頭蘭未開裂的成熟蒴果（圖1：A，B），采自西藏自治區(qū)林芝市墨脫縣。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒與接種 用洗潔精清洗蒴果表面，用解剖刀輕輕刮去表面臟物，自來水沖洗1 h。在超凈工作臺上將蒴果用75%乙醇消毒5 min，無菌水沖洗3次，再放入0.1%的HgCl2溶液中消毒15 min，無菌水沖洗3次，并用無菌水浸泡蒴果30 min;消毒過程中不斷輕輕搖動燒杯以便消毒劑和蒴果充分接觸。將消毒完畢的蒴果置于無菌濾紙上吸干表面的水分，用解剖刀將蒴果縱向劈開，使種子可以倒出，用鑷子夾住蒴果，將種子輕輕抖落在原球莖誘導培養(yǎng)基上。

1.2.2 原球莖的誘導 分別以1/2 MS和MS為基本培養(yǎng)基，添加不同配比的6-BA和NAA，配制成14種不同的原球莖誘導培養(yǎng)基（表1）。每種培養(yǎng)基接種6瓶種子，每兩周向組培瓶中注入相同配方的液體培養(yǎng)基3 mL，用以保持瓶內(nèi)的水分和養(yǎng)分。觀察和記錄種子萌發(fā)、原球莖誘導和生長情況，篩選出最適合的基本培養(yǎng)基和原球莖誘導培養(yǎng)基。

1.2.3 原球莖的增殖培養(yǎng) 在1.2.2篩選出的最適基本培養(yǎng)基的基礎上，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的NAA配制成原球莖增殖培養(yǎng)基，并以最佳原球莖誘導培養(yǎng)基為對照（表2）。選取生長良好的原球莖，接種于試驗培養(yǎng)基中，每個處理接種6瓶，每瓶接種50個原球莖。30d后觀察和記錄原球莖的增殖效果，統(tǒng)計原球莖增殖倍數(shù)。原球莖增殖倍數(shù)（倍）=（增殖后原球莖數(shù)-接種原球莖數(shù)）/接種原球莖數(shù)（邱玥等，2010;姚紹嫦等，2012）。

1.2.4 原球莖的分化培養(yǎng) 在最佳原球莖增殖培養(yǎng)基中單獨或一起添加60 g·L-1土豆泥和0.5 g·L-1活性炭，配制成不同的原球莖分化培養(yǎng)基，并以最佳原球莖增殖培養(yǎng)基為對照（表3）。以原球莖增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d后、生長良好的原球莖為材料，接種于試驗培養(yǎng)基中，每個處理接種6瓶，每瓶接種50個原球莖。分化培養(yǎng)第10天統(tǒng)計原球莖不定芽發(fā)生率，第40天統(tǒng)計生根率，并觀察記錄幼苗的生長狀態(tài)。

不定芽發(fā)生率=產(chǎn)生不定芽原球莖數(shù)（芽高≥0.5 cm）/接種原球莖數(shù)×100%;

生根率=生根幼苗數(shù)（苗高、根長≥2 cm）/接種原球莖數(shù)×100%。

以上培養(yǎng)基均添加6.5 g·L-1瓊脂、25 g·L-1蔗糖，pH 5.8。培養(yǎng)條件：溫度（25 ± 2）℃、光照時間16 h·d-1、光照強度2 000 lx。

1.2.5 試管苗生長發(fā)育環(huán)境因子的篩選 選取長勢較好、苗高1 cm左右、無生理性焦尖的帶根試管苗，接種在最佳原球莖分化培養(yǎng)基中，置于溫度（25 ± 2）℃，光照強度2 000 lx，光照時間分別為8、12、16和20 h·d-1的條件下，培養(yǎng)30d后觀察和記錄試管苗的生長情況（表4）。在最適光照時間篩選的基礎上，將試管苗分別置于溫度為15、20、25和30 ℃的條件下，培養(yǎng)30d后觀察和記錄試管苗的生長情況（表5）。每個光照時間和溫度處理接種試管苗20株（1瓶，每瓶含50 mL培養(yǎng)基），重復3次。

生理性焦尖率=生理性焦尖苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

1.2.6 煉苗移栽 選取根系發(fā)達、苗高約為10 cm的壯苗，開蓋并置于自然光下煉苗3d，之后取出幼苗，小心洗凈殘余培養(yǎng)基后進行移栽。栽培基質(zhì)共設置5個處理，分別為（Ⅰ）農(nóng)田土、（Ⅱ）腐殖土、（Ⅲ）農(nóng)田土∶腐殖土=1∶1（混合土）、（Ⅳ）腐殖土∶蛭石∶珍珠巖=8∶1∶1和（Ⅴ）混合土∶蛭石∶珍珠巖=8∶1∶1。移栽前將不同栽培基質(zhì)澆透水，移栽后再一次澆透水，每個處理30株苗，重復3次。在溫室中保溫保濕 [溫度為（20 ± 2）℃，濕度為70%～80%]培養(yǎng)20d后，觀察移栽苗的生長情況及移栽成活率（圖2）。移栽成活率=萎蔫死亡苗數(shù)/總苗數(shù)×100%。

1.2.7 統(tǒng)計分析 所得的數(shù)據(jù)采用 Excel 和SPSS 19.0 軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 種子誘導產(chǎn)生原球莖

在以1/2 MS和MS為基本培養(yǎng)基、添加不同配比的6-BA和NAA所配制成的14種不同的原球莖誘導培養(yǎng)基中（表1），不同配方對西藏虎頭蘭種子原球莖的誘導效果明顯不同。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基中的原球莖誘導和生長速度較快，其中又以A5培養(yǎng)基的誘導效果最佳，種子經(jīng)過（36.83±0.90）d培養(yǎng)，大部分種子開始膨大，呈淺黃色，繼續(xù)培養(yǎng)14d左右，有95.00%的種子發(fā)育成原球莖，原球莖呈黃綠色或深綠色，顆粒狀膨大，生長快（圖1：C）。以MS為基本培養(yǎng)基，種子萌發(fā)較慢，原球莖誘導率較低。6-BA和NAA對西藏虎頭蘭種子萌發(fā)和原球莖誘導均有一定的效果。0.5 mg·L-1 NAA可以促進種子萌發(fā)，縮短萌發(fā)時間。1.0 mg·L-1 6-BA促進原球莖的形成和生長，但是當6-BA的質(zhì)量濃度達到2.0 mg·L-1時，則會抑制原球莖的生長，使大部分原球莖褐化死亡。將1.0 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA配合使用，可顯著縮短種子萌發(fā)時間和提高原球莖的誘導率，且原球莖長勢旺盛。不添加6-BA和NAA的1/2 MS和MS培養(yǎng)基，種子萌發(fā)時間分別為（66.17±0.55）d和（86.17±0.69）d，繼續(xù)培養(yǎng)3～4個月后，原球莖變?yōu)辄S綠色或深綠色，誘導率僅為10.00%，生長緩慢。因此，誘導西藏虎頭蘭種子萌發(fā)并形成原球莖的適合培養(yǎng)基應為A5（1/2 MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1）。

2.2 原球莖的增殖培養(yǎng)

將A5培養(yǎng)基中生長良好的綠色原球莖，接種到以1/2 MS為基本培養(yǎng)基、添加不同質(zhì)量濃度NAA的原球莖增殖培養(yǎng)基中，并以最佳原球莖誘導培養(yǎng)基A5為對照（表2）。觀測發(fā)現(xiàn)，當NAA的質(zhì)量濃度在0.5～2.0 mg·L-1時，隨著NAA質(zhì)量濃度的提高，原球莖增殖的越多，長勢越好。當NAA

為2.0 mg·L-1時，原球莖的增殖倍數(shù)最高，達到（4.25±0.05）倍，原球莖呈黃綠色或深綠色，大部分呈球形和圓錐形，少部分呈梭形，圓錐形的原球莖為一端有突起，梭形的原球莖為兩端有突起，大多數(shù)的原球莖多個聚生在一起，呈桑椹狀（圖1：D）。當NAA的質(zhì)量濃度大于2.0 mg·L-1時，對原球莖的增殖有抑制作用。原球莖在作為對照的A5培養(yǎng)基上的增殖倍數(shù)為（2.03±0.10）倍，原球莖形成的突起較少。因此，西藏虎頭蘭最佳的原球莖增殖培養(yǎng)基應為B4（1/2 MS+NAA 2.0 mg·L-1）。

2.3 原球莖的分化培養(yǎng)

原球莖增殖培養(yǎng)30d后，選取有突起的黃綠色和深綠色原球莖，接種到添加了土豆泥和活性碳的原球莖最適增殖培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 2.0 mg·L-1上進行分化培養(yǎng) （表3）。接種時， 對聚生在一起的原球莖只記錄個數(shù)，不進行切割。培養(yǎng)結果發(fā)現(xiàn)，添加60.0 g·L-1土豆泥，可顯著提高原球莖不定芽的誘導率和生根率，且幼苗長勢旺盛;同時添加0.5 g·L-1的活性炭，即可顯著降低幼苗基部的褐化程度， 又在不定芽誘導和根系生長方面

有明顯促進作用。原球莖在C2培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d左右，就能分化出芽和根，長勢整齊，不定芽發(fā)生率達到（98.33±1.37）%，同時又有新的原球莖產(chǎn)生，均呈深綠色，原球莖緊密的聚生在一起，有白色絨毛狀假根產(chǎn)生（圖1：E）;培養(yǎng)至40d，幼苗的生根率達到（94.67±2.21）%，根系發(fā)達，大部分苗高超過2 cm（圖1：F）。因此，西藏虎頭蘭原球莖適合的分化培養(yǎng)基為C2（1/2 MS+NAA 2.0 mg·L-1+土豆泥60 g·L-1+活性碳0.5 g·L-1）。

2.4 不同光照時間和溫度對試管苗生長的影響

原球莖分化成苗后，在繼代培養(yǎng)過程中西藏虎頭蘭出現(xiàn)葉片生理性焦尖。將長勢良好的幼苗接種在原球莖分化培養(yǎng)基1/2 MS+NAA 2.0 mg·L-1+土豆泥60 g·L-1+活性碳0.5 g·L-1上，置于不同光照時間和培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)（表4，表5）。結果發(fā)現(xiàn)，不同光照時間對西藏虎頭蘭幼苗長勢和生理性焦尖發(fā)生率有顯著影響。光照時間越長，幼苗焦尖越嚴重，光照時間短，幼苗生長緩慢、細弱。當光照時間為12 h·d-1時，雖然焦尖率為（28.33±2.36）%，但是幼苗粗壯，生長速度快。因此，12 h·d-1為西藏虎頭蘭試管苗培養(yǎng)的最佳光照時間。當光照時間固定為12 h·d-1，設定不同的培養(yǎng)溫度對西藏虎頭蘭分化苗進行培養(yǎng)（表5），結果發(fā)現(xiàn)，不同的培養(yǎng)溫度對幼苗長勢和生理性焦尖發(fā)生率有顯著影響。培養(yǎng)溫度為15 ℃時，幼苗沒有出現(xiàn)焦尖，但是長勢弱;為20 ℃時，幼苗長勢非常旺盛，只有極少數(shù)的葉片出現(xiàn)焦尖（圖1：G）;25～30 ℃時，隨著溫度的逐漸升高，幼苗焦尖越嚴重。因此，20 ℃為西藏虎頭蘭試管苗培養(yǎng)的最佳溫度。

綜上分析，西藏虎頭蘭試管苗繼代分化培養(yǎng)過程中，最適光照時間為12 h·d-1，最適培養(yǎng)溫度為20 ℃。

2.5 試管苗的移栽

當西藏虎頭蘭帶根試管苗的株高約10 cm時（圖1：H），可進行煉苗移栽。觀測發(fā)現(xiàn)，不同栽培基質(zhì)對西藏虎頭蘭幼苗的移栽成活率有一定影響（圖2）;含有腐殖土的栽培基質(zhì)比農(nóng)田土更有利于西藏虎頭蘭幼苗的生長;以腐殖土作為栽培基質(zhì)的移栽成活率最高，達到（97.78±1.57）%，且植株健壯，長勢良好（圖1：I）。因此，西藏虎頭蘭試管生根苗的最佳移栽基質(zhì)為腐殖土（Ⅱ）。

3 討論與結論

西藏虎頭蘭是一種具有很高觀賞價值和經(jīng)濟價值的蘭科蘭屬植物。目前，關于西藏虎頭蘭組織培養(yǎng)的研究較少。李枝林等（2005）在1/2 MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA促進西藏虎頭蘭種子萌發(fā)，KT和NAA誘導形成原球莖，再利用6-BA和NAA促進原球莖分化。王蓮輝等（2009）認為西藏虎頭蘭種子在1/2 MS+100 mL·L-1土豆和MS+100 mL·L-1土豆的培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)率均達到90%以上，且MS基本培養(yǎng)基比1/2 MS基本培養(yǎng)基更有利于種子萌發(fā)及原球莖的增殖分化;6-BA和NAA可促進原球莖增殖分化，但是隨著6-BA濃度的增加，植株有弱化的趨勢;無根苗在1/2 MS+0.2 mg·L-1 IBA培養(yǎng)基上的生根率在95%以上。藍玉甜等（2010）將西藏虎頭蘭種子接種在1.0 g·L-1 花寶1號+1.0 g·L-1 花寶2號+1.0 mg·L-1 6-BA+10%香蕉汁+2%蘋果汁+20 g·L-1 蔗糖+6.0 g·L-1 瓊脂+1.0 g·L-1 活性炭的培養(yǎng)基上，種子萌發(fā)率為90%～98%;原球莖分化最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 NAA+5%香蕉汁+2%蘋果汁，芽分化率為89%;1/2 MS+1.0 mg·L-1 NAA+5%香蕉汁適合壯苗生根。陳和明等（2015）發(fā)現(xiàn)，MS基本培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L-1 NAA、100 g·L-1土豆和1.0 g·L-1活性炭適宜西藏虎頭蘭種子萌發(fā)和小苗增殖，添加1.0 mg·L-1 NAA、100 g·L-1香蕉和1.0 g·L-1活性炭適宜小苗壯苗生根。上述這些研究以西藏虎頭蘭種子為外植體，誘導種子萌發(fā)和原球莖的增殖分化，所提供的數(shù)據(jù)和結果不盡相同，未能對西藏虎頭蘭組培快繁過程提供比較系統(tǒng)、詳細及完整的技術資料。

本研究從種子萌發(fā)、原球莖的誘導、增殖分化、試管苗生長發(fā)育環(huán)境因子的篩選及移栽等方面對西藏虎頭蘭進行了較為系統(tǒng)和全面的組培快繁研究，建立了西藏虎頭蘭高效植株再生體系。本研究結果表明，1/2 MS基本培養(yǎng)基較MS基本培養(yǎng)基更適合西藏虎頭蘭種子原球莖的誘導、增殖及分化。添加1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA，比不添加任何激素配比或單獨使用6-BA或NAA的原球莖誘導效果好，種子萌發(fā)所需時間較短，原球莖誘導及生長情況好。原球莖在1/2 MS+2.0 mg·L-1 NAA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d就可實現(xiàn)4.25倍的增殖，再添加60 g·L-1土豆泥+0.5 g·L-1活性炭可以有效促進增殖后的原球莖分化出不定芽和根。從種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖到獲得苗高約2 cm的帶根試管苗只需4～5個月，原球莖誘導率和分化率均在95%以上;試管苗在溫度20 ℃、光照時間12 h·d-1、光照強度2 000 lx的條件下繼代培養(yǎng)約2個月，苗高在10 cm左右，植株粗壯，長勢旺盛。本研究與前人的研究結果（李枝林等，2005;王蓮輝等，2009;藍玉甜等，2010;陳和明等，2015）相比較，簡化了西藏虎頭蘭組培快繁過程中的培養(yǎng)基配方和程序，獲得了較高的原球莖誘導率和分化率，縮短了組培周期，節(jié)約了組培成本。

在西藏虎頭蘭試管苗繼代培養(yǎng)過程中遇到生理性焦尖現(xiàn)象，有時整瓶試管苗有一半以上的葉片呈黑色焦尖，嚴重影響了植株的正常生長和觀賞價值。濕度太低/高、光照太強和高溫等因素會引起葉片生理性焦尖（王志紅，2003;吳亞光，2003）。組織培養(yǎng)室空間和組培瓶內(nèi)環(huán)境相對密閉，通常使用的溫度（25 ± 2）℃、光照時間16 h·d-1、光照強度2 000 lx的培養(yǎng)條件不適合西藏虎頭蘭試管苗的繼代培養(yǎng)。蘭屬植物大多數(shù)種類生長在適度蔭蔽的環(huán)境中，但附生型的西藏虎頭蘭能在短時間陽光直射的環(huán)境下良好生長（匡美齡和張石寶，2015）。因此，本研究對適合試管苗繼代生長的光照時間和培養(yǎng)溫度進行了篩選，在光照時間12 h·d-1、溫度20 ℃的條件下，只有極少數(shù)的葉片出現(xiàn)焦尖，焦尖發(fā)生率為3.33%。

本研究建立的西藏虎頭蘭植株高效再生體系，為西藏虎頭蘭的繁殖培育工作奠定了良好基礎，在野生資源保護與合理開發(fā)利用方面具有一定的參考價值。

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