張澤萍 胡歡 左國(guó)營(yíng)

摘 要：為考察中草藥抗菌物質(zhì)基礎(chǔ)篩選出活性提取物，該研究通過(guò)80%乙醇冷浸和95%乙醇回流提取制備23種中草藥的提取物，采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)量抑菌圈直徑，用微量液體培養(yǎng)基倍比稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal/fungicidal concentration，MBC/MFC），并測(cè)定了提取物對(duì)臨床4種常見(jiàn)病原菌體外抗菌活性。結(jié)果表明：紫珠草、千斤拔、黃龍尾等9種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌活性，其MIC/MBC值除個(gè)別菌是12.5 mg·mL-1外，其他都在0.09～3.12 mg·mL-1之間;千斤拔、大紅袍、過(guò)江龍等5種中草藥對(duì)銅綠假單胞菌有較強(qiáng)抑菌活性，其MIC/MBC值在3.12～12.5 mg·mL-1之間;紫珠草、千里光、石楠等13種中草藥對(duì)大腸埃希菌有較強(qiáng)的抑菌活性，其MIC/MBC值在0.09～6.25 mg·mL-1之間;八角對(duì)白色念珠菌有較強(qiáng)抑菌活性，其MIC/MFC值在0.78～12.5 mg·mL-1之間。23種中草藥的抗細(xì)菌活性較好，尤其是千斤拔、大紅袍、過(guò)江龍、八角、黃藥子對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌都具有較好的抑菌活性，具有廣譜抗菌活性;但對(duì)真菌抑菌效果不明顯，僅有八角對(duì)白色念珠菌有抑菌活性。此外，提取溶劑濃度、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)中草藥的提取率和活性均有影響，冷提稍優(yōu)于熱提。

關(guān)鍵詞：中草藥， 金黃色葡萄球菌， 銅綠假單胞菌， 大腸埃希菌， 白色念珠菌， 體外抗菌

中圖分類號(hào)：Q946， R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）04-0499-12

Abstract：In order to investigate the antimicrobial material base of Chinese herbal medicine and screen the active extracts， 80% ethanol cold soaking and 95% ethanol reflux extraction were used to prepare the extracts from 23 traditional Chinese herbs. The agardiffusion method was used to measure the inhibition zonediameters（IZDs）， the minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal / fungicidal concentration（MBC/MFC） were measured by the microdilution method todetermine the in vitro antimicrobial activity of the extracts against four common clinical pathogenic microoranisms. The results showed that some of the 23 ethanol extracts had strong inhibitory effects， among which nine species like Callicarpa macrophylla， Flemingia philippinensis and Agrimonia pilosa extracts showed stronger inhibition against Staphylococcus aureus. The ranges of MICs/MBCs were between 0.09 and 3.12 mg·mL-1， except for a small number of strains with the MIC/MBC at 12.5 mg·mL-1. The extracts from five species like Flemingia philippinensis， Campylotropis hirtella， and Entada phyaseoloides showed stronger inhibition against Pseudomonas aeruginosa， the ranges of MICs/MBCs were between 3.12 and 12.5 mg·mL-1. The extracts from thirteen species like Callicarpa macrophylla， Senecio scandens and Piper wallichii showed stronger inhibition against Escherichia coli， the ranges of MICs/MBCs were between 0.09 and 6.25 mg·mL-1. The extracts from Illicium verum showed stronger inhibition against Candida albicans， the ranges of MICs/MFCs were between 0.78 and 12.5 mg·mL-1. Generally， the ethanol extracts from 23 traditional Chinese herbs showed good antibacterial activities， especially Flemingia philippinensis， Campylotropis hirtella， Entada phaseoloides， Illicium verum and Dioscorea bulbifera showed a broad spectrum of antibacterial activities against Staphylococus aureus， Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Their fungicidal effect was weak， only Illicium verum showed inhibitory effect on Candida albicans. In addition， extraction temperature， time and solvent concentration affected the extraction rate and the activity of extracteddrugs， with hot extraction slightly better than cold extraction.

Key words：traditional Chinese herbal medicine， Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa， Candida albicans， in vitro antimicrobial

自1943年青霉素應(yīng)用于臨床以來(lái)，抗生素對(duì)保障人類健康起到了重大作用?，F(xiàn)在，抗生素的種類已達(dá)幾千種，臨床上常用的亦有幾百種之多。我國(guó)是全球最大的抗生素生產(chǎn)國(guó)和使用國(guó)，年產(chǎn)抗生素原料藥約21萬(wàn)t，每年人均消費(fèi)抗生素量為138 g，是美國(guó)人均水平的10倍多（岳華和王育偉，2011）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年直接或間接死于濫用抗生素的有約8萬(wàn)人，是世界上抗生素濫用問(wèn)題最嚴(yán)重的國(guó)家之一（李福長(zhǎng)和劉梨平，2014）?？股氐膹V泛使用除了帶給人類健康外，也出現(xiàn)了耐藥性問(wèn)題、不良反應(yīng)等越來(lái)越嚴(yán)重的危害，尤其是抗生素耐藥問(wèn)題已經(jīng)成為全球醫(yī)學(xué)界的難題，是一個(gè)迫切需要解決的問(wèn)題;中藥是我國(guó)寶貴的資源，在治療感染性疾病方面有著悠久的歷史，其成分復(fù)雜、靶點(diǎn)多、抗菌譜廣，作用于抗菌的各個(gè)環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，能延緩甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥，對(duì)于抗菌有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。以此為契機(jī)，從中藥材中尋找有效、低毒的抗菌藥物，研究中藥抗耐藥菌的作用，開發(fā)利用中藥對(duì)解決細(xì)菌耐藥性這一難題，不失為一種新的有效途徑。

中草藥在體外抗菌活性方面的篩選，國(guó)外文獻(xiàn)相關(guān)報(bào)道比較多，比如，評(píng)價(jià)50種中草藥抗幽門螺旋桿菌的活性（Ma et al.， 2010）、從中草藥中尋找抗腸道病毒71的活性分子（Wang et al.， 2016）和大西洋摩洛哥大海藻提取物抑菌活性的篩選（El Wahidi et al.， 2015），涉及各科屬的中草藥和多種病原微生物;從篩選的結(jié)果來(lái)看，許多中草藥具有顯著而廣譜的抗菌活性，且中草藥對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌活性強(qiáng)于革蘭氏陰性菌和真菌。

根據(jù)課題組前期工作，發(fā)現(xiàn)含有特殊結(jié)構(gòu)如異戊烯基的黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抑菌活性。為尋找具有該類抗菌活性成分的各科屬植物，我們結(jié)合植物化學(xué)分類學(xué)考察，圍繞中草藥乙醇提取物對(duì)臨床常見(jiàn)的4種致病菌，即金黃色葡萄球菌（SA， Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（PA， Pseudomonas aeruginosa）、大腸埃希菌（EC， Escherichia coli）、白色念珠菌（CA， Candida albicans）的標(biāo)準(zhǔn)菌。對(duì)10株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA）、10株銅綠假單胞菌耐藥菌和8株白色念珠菌耐藥菌進(jìn)行了體外抗菌活性研究，選定23種云南省常見(jiàn)的中草藥，制備其醇提取物、篩選其對(duì)該4種常見(jiàn)致病菌的體外抗菌活性，尋找抑菌活性較好的中草藥，為后續(xù)研究其活性單體化合物，開發(fā)有效的抗多重耐藥菌的中藥制劑緩解細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，提供一定的參考。

1 材料

1.1 菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌（ATCC25913、ATCC25923、ATCC29213）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、大腸埃希菌（ATCC25922）、白色念珠菌（ATCCY0109、ATCCSC5314）均購(gòu)自昆明中國(guó)藥品生物制品檢定所。耐藥菌株：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA 15、MRSA 23、MRSA 40、MRSA 82、MRSA 98、MRSA 166、MRSA 181、MRSA 187、MRSA 202、MRSA 747）、銅綠假單胞菌耐藥株（PA 11、PA 109、PA 129、PA 238、PA 238、PA 250、PA 283、PA 294、PA 307、PA 314、PA 319）、白色念珠菌耐藥菌（CA 100、CA 152、CA 592、CA 632、CA 649、CA 953、CA 956、CA 819），均由成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥學(xué)部臨床微生物實(shí)驗(yàn)室從本院臨床重癥感染患者標(biāo)本中分離得到，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基和藥敏紙片：M-H（Mueller-Hinton）瓊脂和肉湯培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20131021、20130314）、沙保羅氏瓊脂（杭州濱和微生物試劑有限公司，批號(hào)為150112）、液體沙氏培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20160217），抗菌藥物藥敏紙片（由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）。實(shí)驗(yàn)所用中草藥（均購(gòu)自昆明螺螄灣中藥材市場(chǎng)）（表1）。

試劑：二甲基亞砜（DMSO，分析純利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司，批號(hào)為20151009），藥用乙醇（昆明福海達(dá)化玻璃有限公司）。

2 方法

2.1 中藥浸膏的制備

將23種中草藥打成粗粉，采用冷浸和熱回流的方法，每種藥材稱取兩份，每一份40 g。冷浸：先用80%乙醇浸泡3次，即第一次7d，第二次4～5d，第三次3～4d;再用八層紗布過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃回收溶劑，合并浸膏，得到冷提取物。熱回流：先用95%乙醇回流提取3次，即第一次2 h，第二次1 h，第三次1 h;再八層紗布過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃回收溶劑，合并浸膏，得到熱提取物。浸膏于常溫下保存，備用。

2.2 藥液和菌液的制備

藥液：稱取50 mg的藥物浸膏于（2 mL）EP管中，加入10%DMSO作為助溶劑，超聲震蕩使藥物溶解，在超凈工作臺(tái)里加入滅菌生理鹽水，配成濃度為50 mg·mL-1藥液。菌液：將菌株接種于瓊脂培養(yǎng)基上，細(xì)菌用M-H瓊脂培養(yǎng)基，真菌用沙保羅氏瓊脂，置于35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h，采用0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁芘渲眉?xì)菌濃度為1.5×108 CFU·mL-1，真菌用細(xì)胞計(jì)數(shù)板配成1.0×106 CFU·mL-1，用于做藥物敏感性和瓊脂擴(kuò)散法測(cè)量抑菌圈。細(xì)菌300倍稀釋成5×105 CFU·mL-1，真菌100倍稀釋成1.0×104 CFU·mL-1，用于最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC/MFC）的測(cè)定。

2.3 體外抑菌活性的測(cè)定

2.3.1 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈 首先用打孔器將瓊脂平板打上6 mm的孔備用，每個(gè)平板均勻打上5個(gè)孔;然后用棉簽沾取細(xì)菌濃度為1.5×108 CFU·mL -1的菌液均勻涂布于M-H瓊脂平板，真菌菌液濃度為1.0×106 CFU·mL-1，涂布于沙保羅氏瓊脂平板上;最后于每孔加入50 μL濃度50 mg·mL-1藥液，藥液不得溢出孔外。瓊脂平板放入35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h，用卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，做3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。根據(jù)藥理學(xué)試驗(yàn)方法判斷：抑菌圈<10 mm為耐藥和無(wú)抑菌作用;10 mm為輕度敏感;11～15 mm為中度敏感;≥16 mm為高度敏感。SA、PA和CA 3種菌藥敏測(cè)試結(jié)果詳見(jiàn)表2、表3和表4，抗生素的抑菌圈以臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)（Clinical and Labora-tory Standards Institute， CLSI）作為標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2 MIC和MBC/MFC的測(cè)定 采用微量液體培養(yǎng)基倍比稀釋法，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)（唐金鳳等，2016）。

3 結(jié)果與分析

3.1 中草藥提取率和抑菌圈

用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈，23種乙醇冷/熱提的提取物對(duì)7株標(biāo)準(zhǔn)菌的抑菌圈如表5所示。（1）對(duì)3株標(biāo)準(zhǔn)SA，千斤拔的抑菌圈菌≥16 mm表現(xiàn)為高度敏感，紫珠草、黃龍尾、大紅袍、過(guò)江龍、黃藥子、澤漆、小葉藤黃的抑菌圈在10～16 mm之間表現(xiàn)為中輕度敏感。（2）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)EC，紫珠草、千斤拔、大紅袍、過(guò)江龍、黃藥子、小葉藤黃的抑菌圈≥16 mm表現(xiàn)為高度敏感，千里光、石楠、黃龍尾、淫羊藿、合歡皮、澤漆、蛇床子、獨(dú)活的抑菌圈在11～16 mm之間表現(xiàn)為中度敏感。（3）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PA，過(guò)江龍和黃藥子的抑菌圈在10～12 mm間表現(xiàn)為輕中度敏感。（4）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)CA，均表現(xiàn)為耐藥。

3.2 MIC和MBC/MFC的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)對(duì)抑菌圈測(cè)定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)菌MIC和MBC/MFC測(cè)定結(jié)果的篩選，選取抑菌圈較大和對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌抑菌效果較明顯的中草藥測(cè)定其對(duì)耐藥菌的抑菌活性。（1）有9種中草藥對(duì)SA有較強(qiáng)的抑菌活性，分別是紫珠草、千斤拔、黃龍尾、大紅袍、過(guò)江龍、八角、黃藥子、澤漆、小葉藤黃，其對(duì)3株標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC25913、ATCC25923、ATCC29213）的MIC/MBC值在0.09～3.12 mg·mL-1之間（表6）。對(duì)10株MRSA的MIC/MBC值除個(gè)別菌是12.5 mg·mL-1外，其余都在0.09～3.12 mg·mL-1之間（表7）。（2）有5種中草藥對(duì)PA有很強(qiáng)抑菌活性，分別是千斤拔、大紅袍、過(guò)江龍、八角、黃藥子，對(duì)1株標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC27853）的MIC/MBC值在3.12～12.5 mg·mL-1之間（表6）。對(duì)10株耐藥菌的MIC/MBC值在3.12～12.5 mg·mL-1之間（表8）。（3）有13種中藥材對(duì)EC有很強(qiáng)的抑菌活性，分別是紫珠草、千里光、石南藤、千斤拔、黃龍尾、大紅袍、淫羊藿、過(guò)江龍、八角、黃藥子、澤漆、獨(dú)活、小葉藤黃，其對(duì)1株標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCC25922）MIC/MBC值在0.09～6.25 mg·mL-1之間（表6）。（4）八角對(duì)CA有很強(qiáng)抑菌活性，對(duì)2株標(biāo)準(zhǔn)菌（ATCCY0109、ATCCSC5314）MIC/MFC值在3.12～6.25 mg·mL-1之間（表6）。對(duì)8株耐藥菌的MIC/MFC值在0.78～12.5 mg·mL-1之間（表9）。

4 討論

綜合篩選結(jié)果顯示，本次研究活性較好的中草藥主要集中在豆科、木蘭科、紫金?？坪褪硎毧疲谒幚碜饔梅矫?，具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒和抗腫瘤的中草藥抗菌活性較好，其中八角（木蘭科）對(duì)四種菌均有較好的抑制作用，千斤拔（豆科）、過(guò)江龍（豆科）、大紅袍（紫金?？疲?、黃藥子（薯蕷科）對(duì)SA、PA和EC均有較好的抑菌活性，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有活性，顯示了廣譜的抗菌活性。從植物化學(xué)分類學(xué)來(lái)看，同一科屬的中草藥往往具有相似結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和抗菌活性，所以今后篩選抗菌中草藥可以從這幾個(gè)科屬中進(jìn)一步尋找，為以后的中草藥體外抗菌作用的篩選提供植物學(xué)參考。

文獻(xiàn)表明八角抗菌活性主要是其揮發(fā)油和萜類成分，其對(duì)霉菌的抑菌效果明顯優(yōu)于細(xì)菌（黃麗貞等，2015），有文獻(xiàn)報(bào)道八角揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗菌活性，如文獻(xiàn)（Saraswathy et al.，2010）所示其總揮發(fā)油對(duì)SA有較強(qiáng)抑菌活性，抑菌圈為14 mm，與本研究抑菌圈11 mm均表現(xiàn)為中度抑制。同時(shí)，八角揮發(fā)油也作為作為食源性細(xì)菌的群體感應(yīng)和生物膜形成抑制劑對(duì)SA和PA均有較強(qiáng)抑制活性（Rahman et al.，2017），與本研究相一致。大量文獻(xiàn)表明，對(duì)千斤拔的研究?jī)H僅停留在化學(xué)成分的提取分離，以及簡(jiǎn)單的抗菌實(shí)驗(yàn)（王明煜，2008），該文章中醇提取物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌SA、EC、PA、CA的MIC分別是60、500、250、500 mg·mL-1，本文與之比較，MIC均較低，原因可能是所用標(biāo)準(zhǔn)菌株、提取溶劑濃度以及所用藥材產(chǎn)地不一樣，但是對(duì)革蘭陰性和陽(yáng)性菌均有抑制作用;本研究所用大紅袍為紫金?？浦参镨F仔的根，主要化學(xué)成分是鞣質(zhì)、黃酮。有關(guān)鐵仔（Myrsinea fricana）化學(xué)成分和抗菌活性的研究報(bào)道很少，Lu et al.（2007）從鐵仔的莖中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的黃酮類化合物，其中myrsininone B化合物具很強(qiáng)的抗菌活性，所以推測(cè)大紅袍中具有抗菌活性的可能是其黃酮成分，Ahmad et al.（2016）研究了鐵仔不同提取部位對(duì)MRSA的抗菌活性，其中乙醇提取部位對(duì)60%MRSA具有高度抑菌活性，本研究對(duì)所測(cè)10株MASA均有較強(qiáng)的抑菌活性（MIC 0.09～0.39 mg·mL-1），兩者研究相一致對(duì)MRSA均有較好的抑菌活性;有關(guān)山豆根的報(bào)道較多，其中對(duì)其抗菌成分的研究較多，粗提物的研究較少，大量文獻(xiàn)表明其抗菌成分主要為生物堿與黃酮（姚裕群等，2016）。山豆根水煎液對(duì)CA有強(qiáng)的抑菌作用，醇提物對(duì)EC和SA的最小抑菌濃度為 31.25 mg·mL-1，山豆根總堿對(duì)EC、SA均有較強(qiáng)的抑制作用。本研究與其比較，采用了瓊脂擴(kuò)散法，SA和EC對(duì)山豆根95%乙醇熱提取物分別表現(xiàn)為耐藥和輕度敏感。微量液體培養(yǎng)基倍比稀釋法測(cè)定其對(duì)SA 的MIC為0.78～12.5 mg·mL-1之間，對(duì)EC 的MIC為0.78 mg·mL-1，表現(xiàn)出差異的原因可能是實(shí)驗(yàn)方法、提取溶劑乙醇的濃度和中草藥產(chǎn)地等不一樣， 本研究目前 僅僅局限在粗提物的活性測(cè)定，今后的研究應(yīng)該以抗菌活性為導(dǎo)向，探討山豆根的活性成分。

有個(gè)別中草藥在測(cè)定抑菌圈時(shí)抑菌圈<10 mm顯示無(wú)抑菌活性，但是MIC和MBC/MFC測(cè)定結(jié)果卻顯示有抑菌活性，原因是抑菌圈是一個(gè)半定量的測(cè)定方法，在實(shí)驗(yàn)所測(cè)濃度為50 mg·mL-1的條件下無(wú)明顯的抑菌圈，表明抑菌效果不明顯，但是并不代表無(wú)抑菌活性。實(shí)驗(yàn)所用耐藥菌株均由本院臨床重癥患者分離得到，如表2、表3、表4藥敏測(cè)試結(jié)果所示確定為多重耐藥菌。此外，本研究采用了冷提和熱提兩種方法對(duì)23種中草藥提取率和活性的進(jìn)行了對(duì)比，數(shù)據(jù)顯示冷提的提取率和活性都稍優(yōu)于熱提，原因可能是熱提溫度較高會(huì)破壞提取物中某些活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)，影響抑菌活性。此外，提取溶劑濃度和提取時(shí)間也是兩個(gè)重要的因素，80%的乙醇濃度比較適中，提取范圍較廣，可以提取到中草藥中低極性和高極性的化學(xué)成分，所以提取率較高，造成中草藥的提取率和活性不一致的具體原因有待深入研究。

總的來(lái)說(shuō)，本研究的中草藥與以往研究者在測(cè)定抑菌活性方面存在差異受多種因素的影響，需要注意的是粗提物抗菌活性顯著受所測(cè)菌種類型、提取溶劑的濃度、提取時(shí)間以及中草藥產(chǎn)地和測(cè)試方法的影響，并且以上幾種中草藥的活性成分均未見(jiàn)與抗生素聯(lián)合使用的報(bào)道。結(jié)合篩選結(jié)果和前人工作，推測(cè)千斤拔具有的抗菌活性可能與其異戊烯基黃酮類成分有關(guān)，所以本課題將進(jìn)一步從千斤拔的有效黃酮成分的分離及其與抗生素聯(lián)合作用方面進(jìn)行深入研究。

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