張又瑋　覃艮艷　彭曉芳　彭俊　潘坤　周亞沙　彭清華

〔摘要〕 目的 觀察不同濃度密蒙花滴眼液對雄兔干眼淚腺組織中炎性細胞因子：細胞間黏附因子-1（intercellular cell adhesion molecule-1， ICAM-1）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白細胞介素-17（interleukin-17， IL-17）表達的影響，從而探討其療效。方法 將36只成年新西蘭雄兔隨機分為空白組（A），模型組（B），密蒙花滴眼液低（C）、中（D）、高（E）濃度組，睪酮組（F）組，每組6只。除A組外，其余各組均切除雙側睪丸及附睪，造模成功后，C、D、E組開始雙眼滴用滴眼液，F(xiàn)組注射丙酸睪酮注射液。術前及治療后第4周各組雄兔均測定1次淚膜破裂時間（tear break-up time， BUT）和淚液分泌功能（Schirmer Ⅰ test， SIT）。治療后第4周處死實驗用兔，并摘取其雙側淚腺，采用免疫組化的方法檢測ICAM-1、IL-6與IL-17的表達。結果 （1）SIT和BUT：B組自身前后對比，治療后第4周：B組與C、D、E、F組相比，E組與C、D組相比，F(xiàn)組與C、D、E組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）;

（2）ICAM-1、IL-6與IL-17電鏡下表達的結果：A、F組未見明顯表達;B組可以見到大量棕黃色顆粒存在細胞漿與細胞膜中;C、D、E組可見散在的表達;（3）治療后第4周，組間ICAM-1、IL-6與IL-17的表達相比較：B組與其余各組相比，E組與C、D組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論 密蒙花滴眼液具有擬雄激素的作用，可以抑制炎性細胞因子ICAM-1、IL-6與IL-17的表達，療效弱于雄激素。不同濃度的密蒙花滴眼液中，高濃度的療效最佳。

〔關鍵詞〕 密蒙花滴眼液;干眼;淚腺;炎性細胞因子

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.04.004

Effects of Butterflybush Flower Eye Drops on Expression of ICAM-1， IL-6 and IL-17 in the Lacrimal Gland Cells of Castrated Male Rabbits with Dry Eye Disease

ZHANG Youwei1， QIN Genyan2， PENG Xiaofang2， PENG Jun2， PAN Kun2， ZHOU Yasha2， PENG Qinghua2*

（1. Shijiazhuang Traditional Chinese Medicine Hospital， Shijiazhuang， Hebei 050000， China; 2. Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of different concentration of butterflybush flower eye drops on the expression of inflammatory factors： intercellular cell adhesion molecule-1 （ICAM-1）， interleukin-6 （IL-6） and interleukin-17 （IL-17） in the acrimal gland cells of castrated male rabbits with dry eye disease， then to discuss the curative effects. Methods A total of 36 male adult New Zealand rabbits into 6 groups， with 6 rabbits in each group： the blank group （A）， the model group （B）， the low concentration group （C）， the middle concentration group （D）， the high concentration group （E）， the testosterone group （F）. Except group A， all the other male rabbits were excised bilateral testicles and epididymis. After the modeling， group C， group D and group E began to use the relative concentration of butterflybush flower eye drops in the eyes. Group F was injected Testosterone Propionate Injection. All the male rabbits need to be determined break-up time （BUT） and tear secretion function （Schirmer I， SIT） before the operation and the 4th week after the treatment. All the experimental rabbits were killed and the lacrimal gland of the both eyes were extracted the 4th week after the treatment. Immunohistochemical method was used to detect the expression of ICAM-1， IL-6 and IL-17. Results （1） SIT and BUT： for self-comparison in the group B， the 28th day after treatment， comparison between the group B， and group C， D， E， F， comparison between group E， and group C， D， comparison between group F， and group C， D F， the differences were statistically significant （P<0.05）; （2） The results of the expression of ICAM-1， IL-6 and IL-17 under electron microscope： There was no obvious expression in group A and group F; A large number of brown and yellow granules were found in the cytoplasm and cell membrane in group B; There was sparse expression in group C， group D and group E; （3） The comparison of ICAM-1， IL-6 and IL-17 between groups in the 4th week after the treatment： for comparison between group B and other groups， and comparison between group E and group C， D， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Butterflybush flower eye drops have the similar effects of androgen， and can inhibit the expression of inflammatory cytokines ICAM-1， IL-6 and IL-17， and the effect is weaker than that of androgen. Among the different concentrations of eye drops， the high concentration is the best.

〔Keywords〕 butterflybush flower eye drops; dry eye disease; lacrimal gland; inflammatory factors.

作為近年來眼科研究的難點、熱點與重點，干眼已成為最常見的、發(fā)病率很高的眼表疾病，在美國的流行病學調(diào)查中數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病率在不同的年齡階段為7%～14.6%[1]，由于我國的環(huán)境衛(wèi)生狀況等與美國相比仍有差距，有些地區(qū)發(fā)病率可達到59.1%[2]，導師所在的課題組曾對密蒙花總黃酮進行了數(shù)項臨床研究和實驗研究[3-7]，證實密蒙花總黃酮具有擬雄激素作用，能有效調(diào)控淚腺細胞局部炎癥反應和細胞凋亡。本文運用將其優(yōu)化后研制的密蒙花滴眼液（主要成分為密蒙花總黃酮和總苯丙素），對去勢所致干眼雄兔進行干預和治療，觀察密蒙花滴眼液對ICAM-1、IL-6、IL-17在淚腺細胞中的表達的影響，為干眼提供新的更有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

成年健康雄性新西蘭長耳白兔36只，體質量（1.7±0.1） kg，質量檢驗合格（合格證編號：43608300000454），由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。實驗前檢查所有雄兔雙眼眼部情況良好，排除全身其他病變。

1.2? 藥品

密蒙花滴眼液（主要成分為密蒙花總黃酮）：由湖南中醫(yī)藥大學藥劑學教研室制備，密蒙花滴眼液規(guī)格：低濃度為1 mg/mL，中濃度為1.5 mg/mL，高濃度為3 mg/mL;丙酸睪酮注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，規(guī)格：1 mL∶25 mg）;20%烏拉坦（湖南福滋堂生物公司）;注射用青霉素鈉（廣州白云山天心制藥股份有限公司）;氯化鈉注射液（江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司，規(guī)格：500 mL∶4.5 g）;水合氯醛分析純（天津市科密歐化學試劑有限公司）;滅菌注射用水（上海長征富民金山制藥有限公司）;Schirmer試驗濾紙、熒光素鈉眼科檢測試紙（天津晶明新技術開發(fā)有限公司）。

1.3? 主要試劑

Harris蘇木素、伊紅、3%過氧乙酸、逆轉錄試劑盒（promegaA3500）、羊抗兔ICAM-1抗體（規(guī)格：200 μg/mL）均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供;4%多聚甲醛（湖南中醫(yī)藥大學病理實驗室）;無水乙醇、異丙醇、氯仿（上?；瘜W試劑公司）;兔抗大鼠IL-6抗體（規(guī)格：200 μg/mL）、兔抗大鼠IL-17抗體、過氧化物酶標記鏈酶白卵素（street avidin-biotin complex， SABC）免疫組織化學試劑盒、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine， DAB）顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4? 主要儀器

YZ5H型裂隙燈顯微鏡、YZ11D型直接檢眼鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司產(chǎn)品）;Leica RM2125RTS型石蠟切片機、B1 Digital數(shù)碼顯微鏡、Image Pro Plus 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)等均由湖南中醫(yī)藥大學實驗室提供。

1.5? 方法

1.5.1? 動物分組? 將36只成年健康雄兔按照隨機排列表法分為6組，每組6只，分別為：空白組、模型組、密蒙花滴眼液低濃度組（1 mg/mL，簡稱低濃度組）、密蒙花滴眼液中濃度組（1.5 mg/mL，簡稱中濃度組）、密蒙花滴眼液高濃度組（3 mg/mL，簡稱高濃度組）、睪酮組。

1.5.2? 干眼模型的建立? 造模前1 d，將全部實驗用兔稱體質量，并在全麻下行SchirmerⅠ試驗（SchirmerⅠtest， SIT）和淚膜破裂時間（tear break-up time， BUT）SIT試驗：按照說明書用法，沿濾紙條的標記線折疊，長度短的一端放置于下瞼結膜囊中外1/3處，有刻度的一端置于下瞼外側，閉雙眼，5 min后取出濾紙條，平放2 min后觀察并記錄濾紙條濕潤的刻度;BUT測定：在下瞼結膜囊內(nèi)輕放入熒光素鈉試紙，3 s后取出，調(diào)好裂隙燈顯微鏡的鉆藍光，觀察淚膜破裂時間并記錄。除空白組外，其余所有雄兔術前8 h禁食禁飲，參照《眼科實驗動物學》[8-9]行雙側睪丸及附睪切除術。造模后第4周與第8周測定模型兔SIT和BUT[10]，當SIT<10 mm/5 min，BUT<10 s時，則造模成功。

1.5.3? 給藥方法? 依據(jù)SIT與BUT結果，造模成功后，即術后第9周開始用藥?？瞻捉M和模型組不予以藥物;低、中、高濃度組;予以相應濃度的密蒙花滴眼液滴雙眼，3次/d;睪酮組：注射丙酸睪酮注射液，2 mg/kg，每3天注射1次。所有實驗用兔均每周稱重1次，高濃度組重新根據(jù)體質量計算丙酸睪酮注射液的注射量，避免因雄兔體質量的增加對實驗結果產(chǎn)生影響。實驗過程中，中濃度組和睪酮組分別死亡1只雄兔。

1.5.4? 取材與指標檢測? 時間為用藥治療4周結束后，具體過程如下：空氣注射處死全部動物，即刻摘除雙眼淚腺組織，進行石蠟包埋與切片。免疫組化染色后，在200倍光學顯微鏡下觀察淚腺組織中ICAM-1、IL-6、IL-17的染色情況并拍照，采用Image-pro Plus 6.0計算平均光密度值，用于定量表達免疫組化陽性反應程度。

1.6? 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理。以“x±s”表示計量資料，用單因素方差分析的方法來進行多組之間的比較，用LSD檢驗進行組間的兩兩比較，用配對樣本t檢驗來比較治療前后。當P<0.05時，差異有統(tǒng)計學意義;當P<0.01時，差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? SIT與BUT的結果

造模前與用藥后，模型組自身前后對比以及與空白組相比，SIT與BUT數(shù)值明顯降低（P<0.01）;用藥后：與模型組相比，密蒙花滴眼液低、中、高濃度組、丙酸睪酮組SIT與BUT數(shù)值明顯升高（P<0.01）;密蒙花滴眼液低、中、高濃度組與睪酮組相比，低濃度組SIT與BUT值明顯降低（P<0.01），中、高濃度組SIT與BUT值升高（P<0.05）;密蒙花滴眼液低、中濃度組與密蒙花滴眼液高濃度組相比，SIT與BUT數(shù)值降低（P<0.05或P<0.01）。結果見表1和表2。

2.2? 各組雄兔淚腺細胞中ICAM-1、IL-6與IL-17 表達的電鏡觀察結果

空白組與丙酸睪酮組：淚腺組織結構清晰，未見ICAM-1、IL-6與IL-17的明顯表達;模型組：淚腺組織結構欠清晰，可見細胞膜和細胞漿中有大量的棕黃色顆粒，即ICAM-1、IL-6與IL-17的表達;密蒙花滴眼液低、中、高濃度組：淚腺組織結構清晰，可見ICAM-1、IL-6與IL-17在細胞膜、細胞漿中的散在表達，見圖1-3（圖中黑色箭頭標注出ICAM-1、IL-6、IL-17的表達）。

2.3? 用藥后對比各組雄兔間淚腺細胞中ICAM-1、IL-6、IL-17表達的結果

模型組與空白組相比，平均光密度值明顯增高（P<0.01）;各個用藥組與模型組相比，平均光密度值明顯下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與高濃度組相比，低、中濃度組平均光密度值升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與睪酮組相比，其余用藥組平均光密度值升高（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。結果見表3。

3 討論

干眼的最新定義強調(diào)了多因素能導致干眼，它具有淚膜穩(wěn)態(tài)的喪失并伴有眼表癥狀的特征，淚液高滲性、淚膜不穩(wěn)定、眼表炎癥與損傷和神經(jīng)感覺異常等都能引起干眼。干眼在眼表疾病中發(fā)病率最高，患者眼干、眼癢、眼痛、視物模糊、畏光流淚、視疲勞、有燒灼感[11]，當繼發(fā)感染時，有可能形成角膜新生血管或角膜潰瘍性穿孔，甚至導致失明[12-13]。醫(yī)學家們不斷探索干眼的發(fā)病機制與治療方案[14]。諸多實驗研究及臨床研究均證明T細胞介導的炎癥反應是干眼發(fā)生與發(fā)展的重要機制[15-16]。

炎性細胞因子ICAM-1、IL-6與IL-17在干眼炎癥反應過程中發(fā)揮著關鍵的作用。ICAM-1是免疫球蛋白家族的一份子，它可以介導包括白細胞在內(nèi)的多種免疫細胞的移行，能夠識別和黏附細胞基質[17]，參與免疫炎癥反應、組織的分化發(fā)育等多個過程[18]。IL-6是促炎性炎性細胞因子的一員，它可以加速巨噬細胞成熟的進程，使B淋巴細胞的免疫活性上升，參與免疫的調(diào)節(jié)，在感染反應和外傷環(huán)境的激發(fā)下可以促使炎癥反應的激化。在白細胞介素的廣大家族中，IL-17被發(fā)現(xiàn)的比較晚，它是由CD4+T淋巴細胞分泌，可以誘發(fā)包括干眼在內(nèi)的多種免疫系統(tǒng)疾病[19]，研究表明，IL-17可以破壞角膜上皮細胞的屏障[20]，可以促進趨化因子，釋放多種炎性介質[21]，參與多種機體的炎癥反應過程。

干眼在中醫(yī)學中歸屬于“白澀癥”的范疇[22]。密蒙花具有養(yǎng)肝明目，疏風清熱，退翳的功效，用于多淚羞明，目赤腫痛，眼生翳膜，肝虛目暗，視物昏花等癥[23]。目前已經(jīng)從密蒙花中分離出包括黃酮類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油等多種化學成分。雄激素水平的降低導致的淚腺調(diào)節(jié)作用失衡是引發(fā)干眼的重要原因之一，從密蒙花中提取出的黃酮類化合物屬于植物性激素，它有著與雄激素相似的化學結構：雜環(huán)多酚類化合物，因此，其可以發(fā)揮擬雄激素的作用[24]，治療因雄激素水平降低導致的包括干眼在內(nèi)的多種疾病[25-26]。

本實驗通過去勢的方法建立雄兔干眼淚腺模型，并用低、中、高不同濃度的密蒙花滴眼液進行干預，證明密蒙花滴眼液具有擬雄激素作用，降低ICAM-1、IL-6與IL-17在雄兔干眼淚腺組織中的表達，減輕淚腺的炎癥反應，并且高濃度療效最佳，為干眼的治療提供了新的思路與方法。

參考文獻

[1] LEMP M A， BAUDOUIN C， BAUM J， et al. The definition and classification of dry eye disease： report of the defintion and classification subcommittee of the international dry eye workshop（2007）[J]. Ocular Surface，2007，5（2）：75-92.

[2] LIU N N，? LIU L，? LI J， et al. Prevalence of and risk factors for dry eye symptom in mainland china： a systematic review and meta-analysis[J]. Journal of Ophthalmology，2014：1-8.

[3] 陳佳文，彭清華，姚小磊，等.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼癥淚腺組織中白細胞介素-1β表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2011，

31（9）：16-18，30.

[4] 李海中，彭清華，王? 芬，等.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠角膜組織Fas、FasL表達的影響[J].眼科新進展，2013，33（12）：1110-1114.

[5] 李海中，彭清華，王? 芬，等.密蒙花總黃酮對去勢雄鼠干眼病血清睪酮水平的影響[J].國際眼科雜志，2013，13（11）：2174-2178.

[6] 姚小磊，彭清華，彭? 俊，等.密蒙花總黃酮對去勢導致干眼癥雄鼠血清LH的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2013，33（7）：8-12.

[7] 王? 芬.密蒙花總黃酮含藥血漿對干眼癥細胞模型Bax mRNA及Bcl-2 mRNA表達的影響[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2011.

[8] 魏世輝，王志軍.眼科實驗動物學[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2010： 94.

[9] 馬軼群，王傳富，劉美光.去勢雄兔干眼病模型角膜上皮細胞凋亡及相關基因表達的研究[J].眼科研究，2004，22（3）：86-289.

[10] 張? 梅，陳家祺，劉祖國.干眼癥檢查的進展[J].眼科研究，2001，

19（2）：184-187.

[11] 曲洪強，高子清，洪? 晶.小牛血去蛋白提取物眼用凝膠及玻璃酸鈉滴眼液治療相關干眼癥應用[J].中國實用眼科雜志，2013，31（6）： 692-696.

[12] LIU Z， SUN X， CHENET W， et al. New perspectives on dry eye definition and diagnosis： a consensus report by the asia dry eye society[J]. The Ocular Surface，2017，15（1）： 65-76.

[13] 中華醫(yī)學會眼科學分會角膜病學組.干眼臨床診療規(guī)范專家共識[R].中華眼科雜志，2013，49（1）：73-75.

[14] 梅? 歡，金龍山，金? 花，等.IL-17在干眼發(fā)病中的作用及相關機制的研究進展[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2017，33（28）：7-8，11.

[15] 李? 淼，張? 林.大鼠淚液缺乏型干眼癥眼表組織中IL-6和TNF-α的表達[J].國際眼科雜志，2010，7（10）：1281-1283.

[16] PFLUGFELDER S C， JONES D， JI Z， et al. Altered cytokine balance in the tear fluid and conjunctiva of patients with sjogrns syndrome keratoconjunctivitis sicca[J]. Current Eye Research， 1999，19： 201-211.

[17] GOTTRAND G， COURAU T， THOMAS VASLIN V， et al. Regulatory T-cell development and function are impaired in mice lacking membrane expression of full length interecellular adhesion molecule-1[J]. Immunology， 2015， 146（4）： 657-670.

[18] 陳? 鑫.ICAM-1在年齡相關性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細胞中的表達及意義[J].中華全科醫(yī)學，2015，13（12）：1950-1951.

[19] ZHANG X， DE PAIVA C S， PFLUGFELDER S C. Desiccating stress promotion of Th-17 differentiation by ocular surface tissues through a dendritic cell-mediated pathway[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science，2010，51（6）： 3083-3091.

[20] BERINGER A， NOACK M， MIOSSEC P. Commenyary： IL-17 Chronic inflammation： from discovery to targeting[J]. Frontiers in Pharmacology，2016，22（3）： 230-241.

[21] CHEN Y， CHAUHAN S， MARMALIDOU A， et al. Interleukine-23， but not interleukine-2， promotes the generation of memorv Th17 Cells in dry eye disease[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science，2016，57（12）： 337.

[22] 李? 娜，方雨葳，彭? 華.彭華教授診治白澀癥的經(jīng)驗[J].國醫(yī)論壇，2016，31（3）：27-28.

[23] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：329.

[24] 彭清華，姚小磊，吳權龍，等.密蒙花提取物對去勢雄兔干眼癥的預防作用[J].中華眼科雜志，2008，44（11）：1011-1019.

[25] MOYAD M A. Complementary therapies for reducing the risk of osteoporosis in patients receiving luteinizing hormone releasing hormone treatment/orchiec-tomy for prostate cancer[J]. Uroloiry， 2002，59（4）： 34-40.

[26] NIFLI A P， BOSSON-KOUAME A， PAPADOPOULOU N， et al. Monomeric and oligomeric flavanols are agonist of membrane receptors[J]. Experimental Cell Research， 2005，309（2）： 329-339.