王紀輝 侯娜 粱美

摘要：為揭示水分脅迫對竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC）生理指標(biāo)的影響，以及竹葉花椒耐旱機制，以1年生花椒實生苗為試驗材料，采用盆栽試驗，對水分脅迫后竹葉花椒幼苗的超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性、相對含水量、丙二醛含量、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律進行了研究。結(jié)果表明，干旱脅迫下竹葉花椒超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性保持良好，丙二醛含量緩慢增加，相對含水量和葉綠素含量逐漸下降，可溶性蛋白質(zhì)含量呈“V”型變化。相關(guān)性分析結(jié)果表明，部分指標(biāo)間表現(xiàn)出顯著正（負）相關(guān)，部分指標(biāo)間呈一定的相關(guān)性但不顯著。主成分分析結(jié)果表明，過氧化物酶活性、丙二醛含量、相對含水量、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量與竹葉花椒耐旱性關(guān)系密切，可作為評價其耐旱性的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：竹葉花椒;水分脅迫;生理響應(yīng)

中圖分類號： Q945.78

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0676-06

竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC）是蕓香科（ Rutaceae）花椒屬落葉小喬木，花椒中酰胺類物質(zhì)和揮發(fā)油含量豐富，因而麻香味十分濃郁，是受廣大消費者青睞的佐料[1]?；ń芬蚓哂袦刂猩⒑?、除濕、止痛等功能，又被納入傳統(tǒng)中藥材的行列，成為藥食兩用的重要植物[2]。近幾年來，花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分迅速，已成為中國西南、西北地區(qū)的重要經(jīng)濟樹種[3]。花芽分化是花椒產(chǎn)量高低的決定性因素，確保一定的花芽數(shù)量，是花椒高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ)[4]。但不良環(huán)境會減弱花椒花芽分化程度，造成花椒大幅度減產(chǎn)[5]。因此，研究水分脅迫對竹葉花椒生理指標(biāo)的影響，為初步闡明竹葉花椒耐旱機理，解決其目前面臨的干旱問題奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下作物超氧化物歧化酶（ SOD）協(xié)同過氧化物酶（POD）共同發(fā)揮作用，清除自由基[6]。干旱脅迫阻礙葉綠素合成，葉綠素分解速率大于合成速率，葉綠素含量整體上表現(xiàn)為下降趨勢;干旱脅迫導(dǎo)致植物細胞膜系統(tǒng)被破壞，膜脂發(fā)生過氧化，丙二醛（MDA）含量增加，相對含水量（RWC）逐漸下降，而可溶性蛋白質(zhì)（SP）合成速率大于分解速率，其含量整體上呈增加趨勢[7]。研究結(jié)果表明，水分脅迫在一定程度上能提高SOD和POD活性，加速膜脂過氧化，增加MDA含量，降低葉片相對含水量，刺激蛋白酶合成新的可溶性蛋白質(zhì)來適應(yīng)環(huán)境[8-10]。張寅媛等的研究結(jié)果表明，干旱脅迫能迫使景天科植物葉片相對含水量下降，細胞膜系統(tǒng)遭到破壞，MDA含量增加，脅迫初期SOD活性升高、后期下降，可溶性蛋白質(zhì)含量增加[11]。胡宏遠等研究發(fā)現(xiàn)，水分脅迫能抑制葉綠素合成，加速其分解，并降低凈光合速率[12]。干旱脅迫能阻礙作物光合作用，降低凈光合速率[13-14]。目前，有關(guān)竹葉花椒對水分脅迫的生理響應(yīng)方面的研究報道較少。本研究以1年生竹葉花椒幼苗葉片為試驗材料，揭示水分脅迫下竹葉花椒的生理響應(yīng)，旨在為竹葉花椒栽培、品種選擇以及耐旱性能等研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

竹葉花椒1年生實生苗取自貴州大學(xué)林學(xué)院苗圃基地，屬于延遲脫水耐旱類型。2016年2月在半拱形覆膜日光溫室中育苗。盆栽試驗于2017年2月在貴州大學(xué)林學(xué)院科研基地半拱形覆膜日光溫室中進行，取園土、腐殖質(zhì)、砂子按質(zhì)量比4：1：1混合，裝入高27 cm、直徑26 cm的塑料盆中，每盆裝土12 kg，土壤田間最大持水量為24.12%。每盆栽植l株，正常澆水，保持幼苗正常生長。移栽后2個月，移到遮雨棚中進行控水處理。設(shè)置4個水分梯度處理：對照（ CK），土壤含水量為田間最大持水量的70% -80%;輕度脅迫（Tl），土壤含水量為田間最大持水量的50% - 60%;中度脅迫（T2），土壤含水量為田間最大持水量的40% - 50%;重度脅迫（T3），土壤含水量為田間最大持水量的30% - 40%。每個處理10盆，3次重復(fù)。采用稱量法控水和補水，每天18：00稱量，補充當(dāng)天消耗的水分，使土壤含水量控制在設(shè)定范圍之內(nèi)。

1.2 測定指標(biāo)與方法

達到設(shè)定的水分梯度后，維持20 d。采集各處理植株上相同節(jié)位（從基部向上第3-5節(jié)）、相同部位發(fā)育成熟的葉片，帶回實驗室立即測定葉片相對含水量（RWC），其余樣品裝入密封袋，置于4℃冰箱中保存，3d內(nèi)完成所有指標(biāo)測定，每個指標(biāo)重復(fù)測定3次。

SOD活性采用氮藍四唑光還原法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，葉片相對含水量采用烘干法測定，葉綠素含量采用高俊鳳等的方法[15]測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin9.1軟件制圖，用SPSS19.0中的Duncan's進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫對竹葉花椒生理指標(biāo)的影響

由圖1可知，隨著水分脅迫加深，SOD活性先升高后下降，從對照到中度脅迫，SOD活性逐漸增大，之后下降且下降幅度較大。在中度脅迫（T2）下SOD活性達到最高值785.03 U/（g.h），在重度脅迫（T3）下SOD活性達到最低值481. 97U/（g.h），與對照相比分別增加和降低26.44%、22.38%。輕度脅迫（Tl）和T2處理之間無顯著差異，它們與CK、T3之間均存在顯著差異。隨水分脅迫加深，POD活性呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢。重度脅迫下POD活性達到762.75U/（g.min），與CK相比增加53.83%。隨著土壤水分含量的降低，MDA含量逐漸增加。脅迫初期MDA含量增加速率較快，隨著脅迫程度的增加，MDA含量增加趨勢有所減緩，重度脅迫下丙二醛含量為7. 48 μmol/g，與CK相比增加54.55%。在水分脅迫過程中，SOD、POD活性雖有所增大，但并不能完全清除細胞組織內(nèi)積累的自由基和過氧化物，因此在水分脅迫逐漸加大時MDA含量逐漸增加，但速率下降。

隨著水分脅迫程度逐漸增加，可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)增加趨勢（圖2）。從對照到輕度脅迫過程中，可溶性蛋白質(zhì)含量下降;從輕度脅迫到重度脅迫過程中，可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸增加，且增加幅度較大。其原因可能是在脅迫初期植物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)合成被抑制，隨著水分脅迫加劇進而誘導(dǎo)植物自身合成新的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)含量增加。在水分脅迫過程中，葉綠素含量逐漸降低。脅迫初期，葉綠素含量下降幅度較小，差異不顯著。重度脅迫下葉綠素含量顯著下降至1 mg/g以下，原因可能是水分脅迫加速了葉綠體的降解，并且進一步抑制了葉綠素合成酶的活性，導(dǎo)致葉綠素合成量下降?；ń分仓晔艿剿置{迫時，葉片相對含水量逐漸降低，對照花椒葉片相對含水量為80. 69%，T1、T2及T3處理葉片相對含水量分別為68.41%、66.43%、57.57%，與對照相比，葉片相對含水量分別下降17.95%，21.47%、40.16%，差異均達到顯著水平。

2.2 竹葉花椒生理指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由表1可知，不同處理對竹葉花椒葉綠素含量的影響達顯著水平，對其余5個生理指標(biāo)的影響達極顯著性水平。由表2可知，相對含水量（RWC）與POD活性、MDA含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.967*、-0.990*（ PBvymTSszst2fEocCW8rP5o73qgKrYqT6PdJiQ5E1jG8=

對竹葉花椒植株SOD活性、POD活性、MDA含量等6項生理指標(biāo)進行主成分分析。結(jié)果（表3）表明，特征值大于l的主成分有2個，這2個主成分的累積貢獻率達到95.784%。依據(jù)各生理指標(biāo)在主成分1及主成分2中載荷系數(shù)絕對值大小，判斷主成分包含的生理指標(biāo)。第一主成分在POD活性、MDA含量、相對含水量、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量5項指標(biāo)上有較大的載荷系數(shù)，因此該主成分與這5項指標(biāo)有較強的相關(guān)性：第二主成分在SOD活性上有較大的載荷系數(shù)，該主成分與SOD活性有較強的相關(guān)性（表4）?？梢?，POD活性、MDA含量、相對含水量、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量這5項生理指標(biāo)貢獻率最大，其綜合作用結(jié)果對竹葉花椒耐旱性的影響顯著，可作為評價其耐旱性指標(biāo)。胡曼筠等[16]對華中冬青相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、葉綠素含量及類胡蘿卜素含量8項生理指標(biāo)進行主成分分析，結(jié)果表明相對電導(dǎo)率、丙二醛含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶活性、葉綠素含量5項指標(biāo)與華中冬青抗逆性關(guān)系密切。這與本研究結(jié)果相似，但又有所不同，可能與植物種類不同有關(guān)。

3 討論

植物處于正常環(huán)境之中時，其細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，然而植物一旦受到不良環(huán)境侵害，這種動態(tài)平衡就會被破壞，自由基大量積累，細胞代謝紊亂，導(dǎo)致植物遭到傷害，而此時植物體內(nèi)會迅速啟動保護系統(tǒng)，保護酶活性被激發(fā)，催化新陳代謝產(chǎn)生的超氧陰離子自由基歧化為02和H202，進而緩解因不良環(huán)境脅迫而引起的細胞傷害[17-18]。本研究中，水分脅迫下SOD活性呈先升后降的趨勢變化，這與張翠梅等[19]以及賈鑫等[20]的研究結(jié)果一致。SOD活性的這種變化說明竹葉花椒體內(nèi)防御機制被刺激，抗性生理活動加快，SOD活性升高以應(yīng)對體內(nèi)超氧陰離子的增加以免細胞受損，脅迫后期可能是超出了SOD歧化能力，SOD活性下降;POD活性緩慢升高，這與劉世鵬等[21]在棗樹上的研究結(jié)果相似。說明干旱脅迫發(fā)生時，竹葉花椒通過及時提高抗氧化酶活性積極適應(yīng)外界環(huán)境變化，然而不同抗氧化酶的響應(yīng)速度不盡相同，SOD反應(yīng)迅速，其酶活性增加較快，而POD活性則是穩(wěn)步上升。干旱脅迫可破壞類囊體膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致竹葉花椒葉片產(chǎn)生更多自由基（02和H202），使膜脂中不飽和脂肪酸過氧化，MDA等過氧化物質(zhì)積累。張翠梅等[19]及潘昕等[22]的研究結(jié)果表明，水分脅迫能引起植物細胞膜破壞，導(dǎo)致MDA含量增加。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是植物適應(yīng)干旱脅迫的主要方式之一。大量研究結(jié)果顯示可溶性蛋白質(zhì)含量與植物抗旱性呈正相關(guān)關(guān)系。本研究中，可溶性蛋白含量在脅迫前期下降，在中度和重度脅迫下，其含量逐漸升高，這與張慶華等[9]研究結(jié)果存在差異。脅迫前期可溶性蛋白含量下降的原因可能是輕度干旱脅迫下蛋白質(zhì)的分解速率大于合成速率。中度和重度脅迫下可溶性蛋白質(zhì)含量增加意味著在干旱響應(yīng)中有新的蛋白質(zhì)合成[23]。

干旱脅迫不僅會對竹葉花椒生長產(chǎn)生不利影響，還會對光合色素造成損害.進而影響光合能力[24]。目前關(guān)于逆境脅迫下葉綠素含量變化的研究結(jié)果尚存在一定差異。本研究中隨水分脅迫加深，葉綠素含量逐漸降低，這與李陽等[25]研究結(jié)果有一定差異。葉綠素含量下降的原因可能是干旱脅迫下，在類囊體膜上產(chǎn)生較多的活性氧簇（ ROS），這些活性氧簇可破壞光合色素。

植物葉片中相對含水量是植物重要的耐旱性能指標(biāo)，在一定程度上反映葉片持水保水能力[23]。隨水分脅迫加深，竹葉花椒葉片相對含水量呈逐漸下降趨勢，且不同脅迫程度之間存在顯著差異，與張寅媛等[8]研究結(jié)果稍有差異，這可能與葉片結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。

綜上所述，水分脅迫下，竹葉花椒生理指標(biāo)表現(xiàn)出不同的生理響應(yīng)，不同脅迫程度之間呈現(xiàn)顯著差異。脅迫初期竹葉花椒通過提高SOD、POD活性增強植株耐旱性能，合成新的可溶性蛋白質(zhì)適應(yīng)外界環(huán)境變化。水分脅迫引發(fā)細胞膜系統(tǒng)發(fā)生膜脂過氧化，導(dǎo)致MDA含量增加，引起葉片相對含水量降低，破壞葉綠素分子結(jié)構(gòu)及葉綠體膜系統(tǒng)和光合反應(yīng)中心。

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（責(zé)任編輯：張震林）