趙龍飛 趙亮 狄佳春 陳旭升

摘要：本研究采用特異引物對(duì)陸地棉種質(zhì)系GGK-2的抗草甘膦基因進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示：GCK-2不僅擴(kuò)增出488 bp的GR 79基因的特征條帶，同時(shí)還擴(kuò)增出379 bp的GAT基因特征條帶。而后采用草甘膦對(duì)陸地棉與陸地棉雜交F2分離群體進(jìn)行浸種抗性鑒定，結(jié)果顯示CGK-2對(duì)草甘膦表現(xiàn)出良好抗性，其抗草甘膦性狀分離符合抗性株：非抗性株=3：1的質(zhì)量性狀分離規(guī)律，顯示抗草甘膦性狀是受孟德爾單顯性基因控制的質(zhì)量性狀。同時(shí)，利用陸地棉與陸地棉雜交F：群體對(duì)抗性基因GR79和GAT的分離進(jìn)行PCR檢測(cè)，顯示目的基因GR79和GAT導(dǎo)人棉花后，以共有的方式在棉花雜交后代穩(wěn)定地遺傳傳遞，共有比率高達(dá)97.9%。而后，采用海島棉與陸地棉雜交F2群體作為定位群體，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)外源基因進(jìn)行遺傳定位，結(jié)果顯示GR79和GAT2個(gè)基因均被定位于棉花第20號(hào)染色體上，并表現(xiàn)為連鎖遺傳，其遺傳距離為3.3 cM。在GR79基因位點(diǎn)一側(cè)有7個(gè)SSR分子標(biāo)記，與其最近的標(biāo)記為相距7.1 cM的NAU2579;在GAT基因位點(diǎn)一側(cè)也有7個(gè)SSR分子標(biāo)記，與其最近的標(biāo)記是相距3.9 cM的NAU3137。本研究為品系GGK-2在抗除草劑棉花育種中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： GGK-2;抗草甘膦基因;GR79;GAT;遺傳規(guī)律

中圖分類號(hào)： Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（ 2019） 03-0531-06

棉花是十分重要的經(jīng)濟(jì)作物，與國(guó)民生活以及國(guó)家的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)息息相關(guān)。中國(guó)棉花集約化生產(chǎn)水平相對(duì)落后，其中雜草對(duì)棉花的危害是導(dǎo)致棉花綜合生產(chǎn)效益較低的一個(gè)重要因素。雜草不僅與農(nóng)作物競(jìng)爭(zhēng)水、肥、光和空間等，而且容易滋生病蟲害，嚴(yán)重影響棉花個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育，造成棉花產(chǎn)量降低與品質(zhì)的下降[1]。草甘膦是世界公認(rèn)的優(yōu)良除草劑之一，其除草范圍廣，高效、低毒、無(wú)殘留，并且價(jià)格低廉，因此草甘膦尤其適合在作物大面積種植地區(qū)推廣使用。這就需要種植的作物對(duì)草甘膦具有抗性，這樣在使用草甘膦時(shí)不至于對(duì)作物造成藥害[2]。

當(dāng)今世界，作物生產(chǎn)逐漸向機(jī)械化和集約化方向發(fā)展。抗除草劑品種的培育將成為中國(guó)棉花機(jī)械化生產(chǎn)的一種迫切需求。棉花對(duì)草甘膦的抗性可通過(guò)以下2種主要途徑獲得：一是通過(guò)誘變或向棉株體內(nèi)導(dǎo)人對(duì)草甘膦不敏感的基因，進(jìn)而提高植物對(duì)草甘膦的耐受性。二是通過(guò)向棉株體內(nèi)導(dǎo)人草甘膦降解基因，在草甘膦發(fā)揮作用前將其降解，使棉株對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性。Comai等[3-4]在鼠傷寒門氏菌中篩選并分離出了抗草甘膦的突變基因aroA，并成功在大腸桿菌中獲得抗草甘膦特性的表達(dá)。Nida等[5]將在土壤農(nóng)桿菌變種CP4菌株中發(fā)現(xiàn)的莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶基因（ EPSPS），通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)移到棉花中，成功培育出具有抗草甘膦除草劑特性的棉花品種。中國(guó)在自主培育抗草甘膦棉花新種質(zhì)系方面已有不少研究報(bào)道[6-10]，特別在自主篩選與克隆抗草甘膦基因方面已取得長(zhǎng)足進(jìn)步[ll]。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所科研團(tuán)隊(duì)在草甘膦嚴(yán)重污染的土壤微生物中克隆到抗草甘膦新型EPSP合酶GR79及N-乙酰轉(zhuǎn)移酶GAT，并進(jìn)行植物偏愛性密碼子改造，構(gòu)建含GR79或GAT單基因和同時(shí)含有雙基因的植物表達(dá)載體，并將這2種基因同時(shí)導(dǎo)入到棉花中，獲得了雙抗草甘膦基因的棉花新種質(zhì)系，通過(guò)分子檢測(cè)和功能鑒定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因種質(zhì)系的抗草甘膦能力達(dá)生產(chǎn)用量的5倍以上[12-14]。

本試驗(yàn)利用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供的抗草甘膦棉花新品系GGK-2作為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)這一抗草甘膦棉花新品系進(jìn)行抗性基因的PCR鑒定和抗性遺傳分析，并對(duì)抗性基因進(jìn)行連鎖遺傳定位，旨在為國(guó)產(chǎn)抗除草劑棉花新材料育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

國(guó)產(chǎn)抗草甘膦陸地棉新種質(zhì)系GGK-2由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郭三堆研究員提供，勝利1號(hào)（V-1）為非抗草甘膦的海島棉品種，YK1107為非抗草甘膦的陸地棉種質(zhì)系。

以GGK-2為母本，配置雜交組合：GGK-2×YK1107、GGK-2xV-1。其F.代自交獲得F2代群體[GGK-2xYK1107] F2、[GGK-2xV-1] F2.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的PCR檢測(cè) 本試驗(yàn)所采用的特異引物是根據(jù)郭三堆等[12]公布的GR79和GAT基因序列自行合成。GR79特異性引物序列如下，其目標(biāo)條帶總長(zhǎng)488 bp;F：5’-GATGCGAGCACGGCCTG-CTACTT-3’： R：5’-ATGCGAATGTGCGGAACCTTG-AC-3’;GAT基因的特異性引物序列如下，其目標(biāo)條帶總長(zhǎng)為379 bp;F：5’-CCTATGAGTTGAGGCACC-GTATT-3’：R：5’-TGAGGTCCCACAGGAGGAGTGT-C-3’。

取GGK-2、V-1與YK1107的種子，提取DNA，方法參照匡猛等[15]的方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在恒壓90 V條件下，使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察目的基因片段。

1.2.2 草甘膦抗性的生物學(xué)鑒定 棉種對(duì)草甘膦的抗性鑒定參照陳旭升等報(bào)道的棉籽浸種鑒定法[16]。取GGK-2種子50粒，YK1107種子50粒，GGK-2xYK1107 F，種子100粒，將41%濃度的農(nóng)達(dá)試劑稀釋到0.3%，在150 ml錐形瓶中用稀釋后的農(nóng)達(dá)試液浸沒(méi)種子24 h，取出棉種做沙基發(fā)芽試驗(yàn)。然后放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，計(jì)數(shù)各群體對(duì)草甘膦的抗性苗與非抗性苗。

1.2.3 GR79和GAT基因的染色體定位取GGK-2xV-1 F2的種子提取DNA，方法同上。在F'分離群體中隨機(jī)選取含有目的基因GR79和GAT個(gè)體各10個(gè)，對(duì)應(yīng)不含有目標(biāo)基因的個(gè)體10個(gè)，分別建立GR79和GAT的近等基因池。然后利用我們前期篩選獲得的分布于棉花26對(duì)染色體上的234對(duì)SSR核心引物[17]，對(duì)雙親和近等基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選有多態(tài)性的引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10.0μl，反應(yīng)程序?yàn)?，GR79基因：94 cC預(yù)變性10 min;94℃變性15 s，63 ℃退火30 s，72 cC延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min;GAT基因：94 cC預(yù)變性10 min;94℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 cC延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在8.0%的非變性PAGE凝膠上電泳，電壓為恒壓220V，電泳緩沖液為lxTBE。電泳結(jié)束后，參照張軍等[18]的方法進(jìn)行銀染，在膠片觀察燈下篩選多態(tài)性引物。用獲得的多態(tài)性引物檢測(cè)F'代分離群體單株的標(biāo)記基因型，統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶，將與V-1帶型相同的個(gè)體基因型記為1，與GGK-2帶型相同的個(gè)體基因型記為2，共顯性雜合帶型的基因型記為3，條帶為空或無(wú)法辨識(shí)的記為0。采用Join Map4.0軟件進(jìn)行連鎖分析，以鎖定目標(biāo)引物以及目的染色體。然后合成目的染色體上的其他SSR引物對(duì)圖譜進(jìn)行加密，繪制連鎖遺傳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 GGK-2抗性基因的PCR鑒定

本試驗(yàn)依據(jù)GR79和GAT基因序列設(shè)計(jì)了2個(gè)基因的特異檢測(cè)引物，其PCR擴(kuò)增結(jié)果分別見圖1、圖2。兩圖中泳道1均為品系GGK-2，它不僅擴(kuò)增出GR79基因的特征條帶（大小488 bp），同時(shí)還擴(kuò)增出GAT基因379 bp大小的特征條帶。兩圖中的泳道2、泳道3分別為2個(gè)對(duì)照品系：V-1（海島棉）、YK1107（陸地棉），二者均不含GAT與GR79基因;因此都沒(méi)有擴(kuò)增出488 bp與379 bp大小的特征條帶。以上結(jié)果表明，外源抗性基因GR79和GAT已成功轉(zhuǎn)入品系GGK-2。

2.2 棉苗對(duì)草甘膦生物學(xué)抗性鑒定

用質(zhì)量濃度為0.3%的草甘膦浸種，在溫光培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d后取出棉苗，比較抗性苗與非抗性苗的表型差異（圖3）。由圖3可見，GGK-2棉苗發(fā)育正常，根系長(zhǎng)出許多須根，表現(xiàn)出對(duì)草甘膦的良好抗性;而同等條件下的對(duì)照品系YK1107的棉苗發(fā)育矮小，根部未見須根，幼苗長(zhǎng)勢(shì)差，并有發(fā)黑壞死的癥狀，對(duì)草甘膦表現(xiàn)為不抗。雜交F，分離群體的抗性苗與非抗性苗的發(fā)育情況見圖3C和圖3D。

統(tǒng)計(jì)2個(gè)親本與F2群體的抗性苗與非抗性苗數(shù)，其結(jié)果列于表1。由表1可見，GGK-2棉苗全部表現(xiàn)為抗性苗;YK1107全部表現(xiàn)為非抗性苗。通過(guò)卡方檢驗(yàn)，F(xiàn)2代分離群體抗性苗和非抗性苗的比例符合孟德爾經(jīng)典遺傳學(xué)的3：1分離比例，說(shuō)明GGK-2的抗草甘膦性狀是受單個(gè)孟德爾顯性基因控制的質(zhì)量性狀。

2.3 GR79和GAT基因在F2群體的分離特性

將GGK-2xYK1107 F，群體用于目的基因GR79和GAT在雜交分離后代遺傳表達(dá)特性的分析，通過(guò)對(duì)分離群體2個(gè)目的基因的PCR檢測(cè)，其分離情況見表2。由表2可知，GGK-2×YK1107 F2群體中GR79基因的顯性隱性個(gè)體通過(guò)卡方檢驗(yàn)符合3：1的分離比例;對(duì)GAT基因的檢測(cè)也是同樣的結(jié)果。這說(shuō)明，這2個(gè)目的基因都呈顯性表達(dá)特征，都符合單基因控制的質(zhì)量性狀遺傳規(guī)律;而且F2分離群體中的GR79基因與GAT基因呈現(xiàn)明顯的共有分離現(xiàn)象，總共檢測(cè)F2群體137顆種子個(gè)體，其中有94個(gè)個(gè)體表現(xiàn)為GR79與GAT基因的共有分離現(xiàn)象，只有2個(gè)個(gè)體未出現(xiàn)GR79和GAT的共有分離現(xiàn)象，共有比例高達(dá)97.9%。至于2個(gè)個(gè)體為什么未能出現(xiàn)GR79和GAT的共有分離現(xiàn)象，其內(nèi)在原因尚需進(jìn)一步研究探討。

2.4 GR79和GAT基因的染色體定位

相比于陸地棉與陸地棉雜交分離群體GGK-2xYK1107 F，，海島棉與陸地棉雜交群體GGK-2xV-1F，的凝膠電泳的多態(tài)性條帶更加豐富，故將GGK-2xV-1 F2群體用于目的基因的定位。通過(guò)對(duì)F2分離群體2個(gè)目的基因做PCR檢測(cè)，其分離情況見表3。表3中顯示：在海島棉與陸地棉雜交F2分離群體中，外源基因GR79和GAT均符合3：1的孟德爾分離規(guī)律，因此可以利用SSR分子標(biāo)記對(duì)它們進(jìn)行基因定位。

利用近等基因池篩選核心引物，率先獲得的連鎖標(biāo)記是NAU2579，這是一個(gè)位于棉花20號(hào)染色體上的SSR標(biāo)記。外源基因GR79和GAT初步定位的目標(biāo)染色體是相同的，2個(gè)基因均連鎖于棉花20號(hào)染色體上。而后查找棉花20號(hào)染色體上的其他連鎖分子標(biāo)記，以豐富其遺傳圖譜。最后通過(guò)JoinMap4.0進(jìn)行連鎖分析，獲得抗草甘膦基因GR79和GAT的染色體定位圖譜（圖4）。由圖4可以看出，GR79和GAT基因表現(xiàn)連鎖，兩者遺傳距離為3.3cM。共有14個(gè)SSR引物與這2個(gè)基因相連，在GR79 -側(cè)有7個(gè)SSR分子標(biāo)記，在GAT -側(cè)也有7個(gè)。與GAT相距最近的SSR標(biāo)記是相距3.9 cM的NAU3137，與GR79最近的分子標(biāo)記是相距7.1 cM的NAU2579。整個(gè)遺傳圖譜的遺傳距離為120.9cM。值得指出的是，GR79和GAT基因雖然表現(xiàn)連鎖，但因采用的定位群體較小，只有181個(gè)個(gè)體，因此獲得兩目的基因的連鎖遺傳距離較大。

3 討論

外源基因?qū)嗣藁〞?huì)產(chǎn)生不同的遺傳轉(zhuǎn)化事件，燕樹鋒等[IO]分析轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花的遺傳情況，曾檢測(cè)26個(gè)抗草甘膦棉花轉(zhuǎn)化事件，只有20個(gè)轉(zhuǎn)化事件分離符合3：1的分離規(guī)律，其他6個(gè)轉(zhuǎn)化事件出現(xiàn)了偏分離，不符合1對(duì)基因的分離規(guī)律，表明轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的整合和遺傳機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。本研究通過(guò)鑒定陸地棉抗草甘膦品系GGK-2外源基因類型以及抗草甘膦基因的遺傳方式發(fā)現(xiàn)，抗草甘膦性狀符合1對(duì)孟德爾顯性基因控制的質(zhì)量性狀遺傳規(guī)律。同時(shí)利用陸地棉與陸地棉雜交F，群體以及海島棉與陸地棉雜交F2群體，分別檢測(cè)基因GR79與GAT在雜交后代的分離，也均符合3：1的理論比例。前人研究結(jié)果表明，通過(guò)與某一染色體的多個(gè)SSR分子標(biāo)記的連鎖關(guān)聯(lián)分析，可實(shí)現(xiàn)外源基因的染色體定位[19-21]。本研究依據(jù)Guo等[22]、Zhao等[23]公布的四倍體棉花分子標(biāo)記遺傳圖譜，并利用自主篩選的分布在棉花26對(duì)染色體上的234對(duì)SSR核心引物，將基因GR79和GAT連鎖定位在棉花第20號(hào)染色體上。該定位結(jié)果相當(dāng)于多次SSR分子標(biāo)記連鎖重復(fù)驗(yàn)證，具有極高的可靠性。

對(duì)于棉花育種者來(lái)說(shuō)，鑒定轉(zhuǎn)基因種質(zhì)系外源基因類型并探明其雜交后代的遺傳規(guī)律，可以有效指導(dǎo)育種者依據(jù)育種目標(biāo)來(lái)配置不同的雜交組合，從而有目的地實(shí)現(xiàn)不同外源基因的互補(bǔ)與整合。本研究為國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)抗草甘膦基因棉花新種質(zhì)系GGK-2在育種中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

致謝： 本研究使用的抗草甘膦陸地棉品系GGK-2，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郭三堆研究員提供。在此謹(jǐn)表衷心感謝！

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