馬維娟 楊忠思 馮秋霞 王云

[摘要]目的調(diào)查青島地區(qū)HBV DNA陽性獻(xiàn)血者病毒載量和血清學(xué)特征，并分析其HBV基因型。方法無償獻(xiàn)血樣本HBsAg-/HBV-DNA+32例，HBsAg+/HBV-DNA+7例，行高精度病毒載量檢測和補(bǔ)充血清學(xué)試驗，并通過S區(qū)擴(kuò)增測序結(jié)合多對型特異性引物巢式PCR法分析HBV基因型。結(jié)果32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本中，HBcAb+30例（93.75%），HBV DNA定量陰性17例，定量陽性15例;測序分型確定基因型4例為B型，其中1例發(fā)現(xiàn)兩處突變，分別為126位蘇氨酸/異亮氨酸（T/I）突變?yōu)楸彼幔ˋ）、175位亮氨酸（L）突變?yōu)榻z氨酸（S）。7例HBsAg+/HBV-DNA+樣本HBV DNA均定量陽性，確定基因型2例為B型，3例為C型。結(jié)論大部分HBsAg-/HBV-DNA+獻(xiàn)血者的HBcAb為陽性，HBV DNA呈低濃度，感染的HBV主要基因型為B型和C型。

[關(guān)鍵詞]供血者;乙型肝炎病毒;血清學(xué)試驗;遺傳學(xué)

[中圖分類號]R446.6[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2019）03-0338-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the viral load， serological characteristics， and hepatitis B virus （HBV） genotype of HBV DNA-positive donors in Qingdao， China. MethodsA total of 32 HBsAg-/HBV-DNA+ blood samples and 7 HBsAg+/HBV-DNA+ samples were selected. High-precision viral load measurement and supplementary serological test were performed， and S-region sequencing combined with specific-primer nested PCR was used to analyze HBV genotype. ResultsAmong the 32 HBsAg-/HBV-DNA+ samples， 30 （93.75%） were HBcAb+; 15 had negative HBV DNA， and 17 had positive HBV DNA; sequencing and genotyping showed that 4 samples had genotype B， among which 1 was found to have two mutations， i.e.， 126 threonine/isoleucine （T/I） to alanine （A） and 175 leucine （L） to serine （S）. All 7 HBsAg+/HBV-DNA+ samples were positive for HBV DNA， among which 2 had genotype B and 3 had genotype C. ConclusionMost of the HBsAg-/HBV-DNA+ donors are positive for HBcAb， with a low concentration of HBV DNA， and genotypes B and C are the main genotypes for HBV infection.

[KEY WORDS]blood donors; hepatitis B virus; serologic tests; genetics

HBV是經(jīng)輸血傳播疾病的病原體，乙肝表面抗原（HBsAg）是WHO認(rèn)定的判斷HBV感染的關(guān)鍵指標(biāo)[1-2]。目前，我國采供血機(jī)構(gòu)主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）方法對獻(xiàn)血者血液進(jìn)行檢測，但由于HBV的復(fù)制特點(diǎn)以及疫苗和抗病毒治療的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致HBsAg突變率高，獻(xiàn)血者血液HBsAg檢測陰性卻存在低水平HBV DNA[3]。我國部分地區(qū)流行的HBV基因型主要為C型和B型，其次為D、E和A型[4-5]。但青島地區(qū)無償獻(xiàn)血者的HBV基因型分布未見報道。本文研究旨在了解青島地區(qū)HBsAg-/HBV-DNA+獻(xiàn)血者的病毒載量和血清學(xué)狀況，調(diào)查本地區(qū)HBV基因型和S基因突變情況，以期為青島地區(qū)HBV的認(rèn)知和防控提供地域性的指導(dǎo)性意見。

1材料與方法

1.1血液樣本

根據(jù)青島市中心血站常規(guī)血液篩查模式，共篩選出無償獻(xiàn)血樣本39例納入實驗，樣本血清量均為3 mL以上，無明顯溶血和脂血。其中HBsAg-/HBV-DNA+樣本32例，HBsAg+/HBV-DNA+樣本7例。

1.2主要儀器

蓋立復(fù)Procleix TIGRIS核酸檢測系統(tǒng)（西班牙蓋立復(fù)公司）;Roche COBAS S201AmpliPre全自動核酸提取系統(tǒng)，Gene-Amp PCR system 9700型（美國ABI公司生產(chǎn)），CTM核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)，雅培Architect i2000SR化學(xué)發(fā)光分析儀，CG1-96型PCR儀（澳大利亞corbett公司），wide mini-sub cell GT電泳儀（美國Bio-Rad公司），Thermo LEGEND Micro 17型離心機(jī)，SORVALL Biofuge stratos 型離心機(jī)，ImageQuant350凝膠成像系統(tǒng)（美國GE公司生產(chǎn)）。

1.3主要試劑

AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV定量檢測試劑（第二代），雅培ARCHITECT HBsAg檢測試劑盒，雅培ARCHITECT HBsAg確認(rèn)試劑盒（中和實驗），雅培ARCHITECT HBeAg檢測試劑盒，雅培ARCHITECT anti-HBe檢測試劑盒，雅培ARCHITECT anti-HBc檢測試劑盒，DNA聚合酶：KOD FX（TOYOBO），2×Taq PCR Master Mix（含染料）預(yù)混體系（天根公司），Expand High Fidelity PCR System（Roche Applied Science），血清/血漿病毒DNA提取試劑盒為QIAamp DNA blood mini kit （Qiagen， Hilden， Germany）。

1.4研究方法

常規(guī)篩查采用2次ELISA、1次NAT的篩查模式，各試劑均經(jīng)中國藥品生物制品鑒定所鑒定批間合格并嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。對血清學(xué)任一試劑呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本采用原試劑作雙孔檢驗（原血樣1孔，血袋小辮樣1孔），復(fù)檢1孔或2孔陽性者判為陽性。兩個核酸檢測平臺中，羅氏Cobas S201核酸檢測系統(tǒng)結(jié)果以CT值表示，Procleix Tigris核酸檢測系統(tǒng)（Grifol）結(jié)果以S/CO表示。

1.4.1高精度病毒載量檢測采用AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV定量檢測試劑進(jìn)行HBV DNA病毒載量檢測，每份標(biāo)本取1 mL，使用COBAS AmpliPrep儀器進(jìn)行自動樣品制備，使用COBAS TaqMan分析儀進(jìn)行自動擴(kuò)增和檢測。

1.4.2補(bǔ)充血清學(xué)試驗采用雅培微粒子化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行HBsAg、乙肝表面抗體（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗體（HBeAb）、核心抗體（HBcAb）檢測。采用HBV HBsAg確認(rèn)試劑盒（中和法）進(jìn)行HBsAg確認(rèn)檢測。

1.4.3HBV病毒DNA的提取應(yīng)用QIAamp DNA blood mini kit進(jìn)行DNA提取，提取的樣本量為200 μL，采用微量核酸含量測定儀測定DNA濃度，控制濃度為30～150 μg/L。

1.4.4PreS/S區(qū)基因的擴(kuò)增根據(jù)HBV PreS/S基因區(qū)域內(nèi)的保守序列設(shè)計半巢式PCR的引物S2812、S1194和B1051，引物由上海英俊公司合成。提取病毒核酸后PCR擴(kuò)增PreS/S區(qū)，擴(kuò)增時設(shè)置兩個陰性對照以避免出現(xiàn)假陽性，結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物，經(jīng)30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.4.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化及測序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化，應(yīng)用第二輪擴(kuò)增引物作為測序引物進(jìn)行雙向測序，用PreS/S區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物來設(shè)計中間引物雙向測通。將測序結(jié)果存在雜合的樣本進(jìn)行TA克隆，然后挑選單克隆進(jìn)行測序。測序交由上海英俊公司使用ABI 3730 Genetic Analyzer測序儀（Applied Biosystems 公司）完成。測序結(jié)果用CLUSTAL_X（version 1.83）軟件進(jìn)行序列比對，分析PreS區(qū)是否存在片段缺失以及T31C和T53C突變;分析S區(qū)是否存在與免疫逃逸、HBsAg檢測、anti-HBs和HBsAg結(jié)合能力改變相關(guān)的突變。

1.4.6HBV基因型和亞型系統(tǒng)發(fā)育分析分別應(yīng)用MEGA 4（43）、Neighbor-joining計算法繪制進(jìn)化樹，最適合模型采用MrModeltest 2.2（Nylander 2004）進(jìn)行似然比檢驗。在進(jìn)化模型檢驗的同時，還考慮了參數(shù)I和G，其中I是假設(shè)的不變位點(diǎn)的比例;G是Gamma分布;G+I指檢測數(shù)據(jù)集中有些位點(diǎn)是不變的，而可變位點(diǎn)的變異遵循Gamma分布速率模型。

2結(jié)果

2.1HBV DNA高精度病毒定量檢測

HBV DNA病毒載量檢測結(jié)果顯示，本文32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本中，17例樣本為陰性，15例定量陽性，其中8例樣本HBV DNA<20 kU/L，7例>20 kU/L;7例HBsAg+/HBV-DNA+樣本均定量陽性，1例樣本HBV DNA<20 kU/L，6例>20 kU/L。

2.2乙肝補(bǔ)充血清學(xué)試驗

本文32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本血清學(xué)檢測結(jié)果顯示，HBcAb+30例（93.75%），其中單獨(dú)HBcAb+ 者17例（53.13%），合并HBsAb+ 者7例（21.88%），HBsAg陽性者3例（9.38%）;而在7例HBsAg+/HBV-DNA+樣本中，HBsAg和HBcAb均陽性。見表2、3。

2.3HBV序列分析

經(jīng)核酸提取和擴(kuò)增，有9例樣本成功擴(kuò)增和測序，6例為B型，3例為C型，其中4例為HBsAg-/HBV-DNA+樣本，經(jīng)進(jìn)化樹分析均為B型，其中2例血清學(xué)指標(biāo)全陰性，1例HBsAb、HBcAb陽性，1例HBeAb陽性;5例為HBsAg+/HBV-DNA+樣本，經(jīng)進(jìn)化樹分析2例B型，3例C型。其中1例HBsAg-/HBV-DNA+樣本（8號）發(fā)現(xiàn)兩處突變，126位蘇氨酸/異亮氨酸（T/I）突變?yōu)楸彼幔ˋ），175位亮氨酸（L）突變?yōu)榻z氨酸（S）。見表4、圖1。

3討論

NAT能顯著縮短病毒檢測的窗口期，提高病毒的檢出率，降低輸血傳播病毒的殘余危險度[6-10]，2010年開始逐步應(yīng)用于國內(nèi)獻(xiàn)血者血液標(biāo)本的篩查，大大降低了經(jīng)輸血途徑傳播病毒的風(fēng)險。本文采用羅氏核酸檢測系統(tǒng)和Grifol嚴(yán)格篩查青島市無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，32例被確證為HBsAg-/HBV-DNA+，DNA精確病毒載量檢測顯示17例定量陰性，15例定量陽性，其中8例HBV DNA<20 kU/L，7例>20 kU/L;而7例HBsAg+/HBV-DNA+樣本均定量陽性。原因可能是：①定量檢測標(biāo)本經(jīng)過低溫冷凍保存，復(fù)融的方法和速度以及運(yùn)輸環(huán)節(jié)都可能影響病毒核酸的檢出;②現(xiàn)用的血液篩查系統(tǒng)是定性檢測系統(tǒng)，這與定量檢測系統(tǒng)的引物設(shè)計及檢測靈敏度不同，可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果不一致;③血漿中的病毒顆粒呈泊松分布，加樣的隨機(jī)性可能導(dǎo)致結(jié)果的不同;④病毒載量太低或者核酸檢測假陽性[11]。本文結(jié)果顯示，HBsAg-/HBV-DNA+樣本的病毒載量顯著低于HBsAg+/HBV-DNA+樣本，而HBsAg-/HBV-DNA+獻(xiàn)血人員的HBV DNA均呈低濃度，大部分感染者的病毒載量均小于20 kU/L甚至檢測不出。

本研究補(bǔ)充血清學(xué)試驗顯示，32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本中，HBsAg陽性3例（9.38%），說明現(xiàn)用ELISA試劑的靈敏度有待提高，或HBsAg區(qū)域的基因突變導(dǎo)致HBsAg的漏檢。除此之外，本文32例HBsAg-/HBV-DNA+樣本中，HBcAb+占93.75%，這部分獻(xiàn)血者處于感染窗口期或?qū)儆陔[匿性HBV感染，7例（21.88%）獻(xiàn)血者僅表現(xiàn)為HBsAb+，此類獻(xiàn)血者可能之前注射過疫苗但仍被病毒感染[12]。

根據(jù)HBV全基因組序列差異≥8%或S基因序列差異≥4%將HBV分為不同的基因型[13]，目前至少可以分為A～J等10種基因型，不同基因型的病毒復(fù)制以及逃逸宿主免疫力的能力不同，感染途徑和疾病進(jìn)程也有所差異，從而導(dǎo)致不同地區(qū)HBV感染率和基因型分布的差異，基因型分布呈一定的地域性[5，14]。我國的HBV基因型主要是B型和C型，另外有少量的A型、D型及I型。本研究39例樣本中，有9例成功進(jìn)行了測序分型，包括5例血清學(xué)陽性的標(biāo)本（2例B型，3例C型）和4例HBV DNA單獨(dú)陽性的標(biāo)本（4例B型）。4例HBV DNA單獨(dú)陽性的標(biāo)本中，有3例HBcAb陽性，因此判定屬于隱匿性HBV感染（OBI），剩下的1例樣本為HBcAb陰性，但抗HBs為陽性，也屬于OBI的定義。楊愛蓮等[15]研究發(fā)現(xiàn)，10例OBI和3例窗口期全部屬于B型;葉賢林等[16]報道OBI感染者也以B型為主。林紅等[17]進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，江蘇地區(qū)HBsAg-/HBV-DNA+獻(xiàn)血者的基因型以B型為主，其次是C型;而在乙肝血清學(xué)陽性的樣本中則B型、C型都有，是否提示B亞型的病毒更容易導(dǎo)致OBI？這可能還需要更大的樣本量來進(jìn)行驗證。國外有研究表明，不同基因型HBV感染后病人的臨

HBV S基因主要編碼HBsAg，包括T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的蛋白基因。HBsAg的第124～147位氨基酸被稱為a決定簇，是最常見的變異發(fā)生部位，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的HBsAb均可結(jié)合HBsAg并具有中和作用，是一種保護(hù)性抗體，其變異會使HBsAg的構(gòu)型改變，導(dǎo)致病毒抗原性和免疫原性改變[21]，接種疫苗后不會產(chǎn)生保護(hù)性抗體[22];同時，變異株也會造成常規(guī)檢測方法的漏檢。本文39例血樣本經(jīng)核酸提取和擴(kuò)增，有9例成功擴(kuò)增和測序，其中1例樣本126位T/I突變?yōu)锳，175位L突變?yōu)镾。編碼S基因的126位氨基酸突變可導(dǎo)致HBsAg的a決定簇發(fā)生改變，因此改變了抗原結(jié)構(gòu)而造成HBV的漏檢，此突變與乙肝疫苗逃逸相關(guān)，說明該獻(xiàn)血者接種過乙肝疫苗，但由于感染的這個突變株病毒具有可以逃避疫苗的保護(hù)作用的突變，因此導(dǎo)致其仍然感染了HBV，而175位氨基酸突變的意義目前還不明確。KOYANAGI等[23]研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸第129位天門冬氨酸和第145位丙氨酸的置換可以導(dǎo)致HBsAg檢測陰性，而X基因的突變可以對HBsAg的表達(dá)產(chǎn)生影響[24]，如果HBVa的決定簇及近鄰的位點(diǎn)發(fā)生變異，也會減弱抗體識別，從而導(dǎo)致常規(guī)試劑檢測陰性[25]。

雖然本文兩種方法的互補(bǔ)應(yīng)用大大降低了輸血者感染HBV的風(fēng)險，但由于部分HBV感染者的DNA水平非常低[26-29]，對現(xiàn)用核酸檢測系統(tǒng)的靈敏度提出了較高的要求，對輸血安全提出了挑戰(zhàn)[30]。日常檢測工作中，要加強(qiáng)檢測方法結(jié)果間的比較，對結(jié)果特殊的獻(xiàn)血者做進(jìn)一步的追蹤隨訪。青島地區(qū)HBV感染以B和C型為主，但由于樣本量較小，今后要擴(kuò)大研究范圍，對青島地區(qū)無償獻(xiàn)血者的HBV感染情況做更詳盡的調(diào)查研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）