陳頤　鄭竹山　王建兵　陳若星　鄭志云　孫書斌　鄒聰明

摘? 要：為明確不同成熟度烤煙烘烤過程中游離氨基酸組分轉(zhuǎn)化規(guī)律，以烤煙品種K326為材料，對煙葉游離氨基酸組分含量及轉(zhuǎn)氨酶活性進(jìn)行了動態(tài)變化分析。結(jié)果表明，煙葉烘烤過程中，以谷氨酸等10種氨基酸含量和氨基酸總量變幅較大;不同成熟度煙葉中谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和天冬氨酸含量變化差異主要集中在變黃后期和定色前期，此時，適熟和過熟煙葉在烘烤中轉(zhuǎn)氨酶活性較高;與尚熟煙葉相比，適熟和過熟煙葉絲氨酸、組氨酸酸、精氨酸和賴氨酸含量從烘烤定色期開始，呈現(xiàn)下降的變化，表明煙葉成熟度對游離氨基酸轉(zhuǎn)化為美拉德產(chǎn)物有一定影響。由此，適當(dāng)提高煙葉成熟度，有助于煙葉游離氨基酸互相轉(zhuǎn)化和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成。

關(guān)鍵詞：烤煙;烘烤;成熟度;游離氨基酸;轉(zhuǎn)氨酶

中圖分類號：TS441????????? 文章編號：1007-5119（2019）03-0075-09????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.011

In order to explore the transformation process of free amino acids in tobacco leaves with different maturity during the flue-curing process， we used flue-cured tobacco K326 in studying the content of free amino acids and transaminase activities. During the curing process of tobacco leaves， the contents of 10 species of amino acids such as glutamic acid and the total amount of amino acids showed significant changes. The differences in the contents of glutamic acid， alanine， phenylalanine， proline and aspartic acid in different maturity tobacco leaves were mainly observed at the late yellowing stage and the early leaf-drying stage. During these two stages of curing， proper-mature and over-mature tobacco leaves had higher transaminase activity. Compared with immature tobacco leaves， the contents of serine， histidine， arginine and lysine in the proper-mature and over-mature tobacco leaves showed a decreasing change starting from the leaf-drying stage， indicating that the maturity of tobacco leaves has a certain influence on the conversion of free amino acids into Maillard products. Properly increase of the maturity of tobacco leaves contributes to the mutual conversion of free amino acids and the formation of Maillard reaction products.

Keywords： flue-cured tobacco; flue-curing; maturity; free amino acid; transaminase

游離氨基酸是指以游離狀態(tài)存在、未結(jié)合在蛋白質(zhì)分子中的氨基酸，是煙草中含量最為豐富的一類重要的化學(xué)組分，它們不僅具有重要的生理功能，能調(diào)控?zé)熑~內(nèi)的能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化，而且是煙葉香氣的主要來源之一。煙葉內(nèi)的游離氨基酸在成熟過程中，其含量和組分不斷發(fā)生變化，而這些變化直接影響著煙葉的感官品質(zhì)風(fēng)格特色。煙葉成熟度不同，其游離氨基酸組分含量差異很大。因此，從煙葉采摘成熟度出發(fā)，通過合理調(diào)控密集烘烤參數(shù)促進(jìn)煙葉內(nèi)游離氨基酸組分轉(zhuǎn)化，提高煙葉品質(zhì)是現(xiàn)代煙葉烘烤的重要目標(biāo)之一。目前，國內(nèi)外煙草研究工作者圍繞烘烤過程中煙葉游離氨基酸組分轉(zhuǎn)化規(guī)律開展了大量研究。王愛華等從優(yōu)化變黃期烘烤工藝入手研究了烘烤中煙葉游離氨基酸組分變化，結(jié)果表明變黃期階梯升溫烘烤工藝有利于蛋白質(zhì)的降解及苯丙氨酸和酪氨酸的積累;謝良文等從有害物質(zhì)氨和氫氰酸入手研究了與烘烤中游離氨基酸組分的關(guān)聯(lián)，得出氫氰酸和氨在烘烤變黃后期到定色中期變化幅度較大;蘇宇等從美拉德棕色化反應(yīng)角度入手研究了烘烤中還原糖與游離氨基酸組分含量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在煙葉細(xì)胞死亡以及呼吸作用已經(jīng)停止的條件下，氨基酸含量和還原糖含量仍然下降，說明氨基酸參與了非酶催化的美拉德反應(yīng)，形成了具有烤香的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。上述研究在煙葉烘烤游離氨基酸轉(zhuǎn)化機(jī)理上研究不夠全面。比如，烘烤中煙葉氨基酸的脫氨基作用研究甚少，絕大多數(shù)氨基酸脫氨基是出自轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，此反應(yīng)屬于“乒乓BiBi機(jī)制”，主要在轉(zhuǎn)氨酶作用下進(jìn)行。本研究采用以溫度為依據(jù)取樣和以時間為依據(jù)的取樣兩種試驗?zāi)Ｊ?，系統(tǒng)性研究不同成熟度煙葉密集烘烤中游離氨基酸組分含量、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶的動態(tài)變化，為闡明煙葉烘烤游離氨基酸轉(zhuǎn)化機(jī)理以及提高煙葉質(zhì)量奠定理論及試驗依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

試驗①于2017年12月至2018年4月在云南省德宏州盈江縣弄璋鎮(zhèn)（東經(jīng)97°52′，北緯24°36′，海拔816 m）進(jìn)行;試驗②于2018年4—9月于云南省玉溪市江川區(qū)九溪鎮(zhèn)（東經(jīng)102°38′，北緯24°18′，海拔1730 m）進(jìn)行，供試品種均為K326，由玉溪中煙種子有限責(zé)任公司提供。本試驗選取尚熟、適熟和過熟3種成熟度檔次在田間采收中部鮮煙葉樣品作為試驗分析材料（表1）。

1.2? 試驗設(shè)計

不同成熟度處理的煙葉采摘、編竿，確保煙葉部位均衡一致，在當(dāng)?shù)孛芗痉恐羞M(jìn)行烘烤。試驗①烘烤工藝主要依據(jù)德宏煙區(qū)主推烘烤模式進(jìn)行;試驗②烘烤工藝主要依據(jù)玉溪煙區(qū)主推烘烤模式進(jìn)行。密集烘烤過程中取樣設(shè)計如下：

①德宏烘烤以烘烤溫度為依據(jù)取樣：在整個烘烤過程中所有處理的關(guān)鍵恒溫點34 ℃、36 ℃、38 ℃、42 ℃、46 ℃、48 ℃、52 ℃、56 ℃、60 ℃進(jìn)行取樣，干冰保存，并放入?80℃低溫冰箱待用，加上烤前（背景值）共計取樣10次，各處理分別編成3竿煙同爐烘烤，每次每竿選取有代表性的葉片5片作為1次重復(fù)，每處理共15片。②玉溪烘烤以烘烤時間為依據(jù)取樣：在整個烘烤過程中所有處理每12小時取樣1次，干冰保存，并放入?80 ℃低溫冰箱待用，加上烤前（背景值）共計取樣13次，各處理分別編成3竿煙同爐烘烤，每次每竿選取有代表性的葉片5片作為1次重復(fù)，每處理共15片。

1.3? 測定方法

游離氨基酸組分含量：采用PITC柱前衍生化的HPLC技術(shù)測定。所用儀器Waters e2695高效液相色譜儀（美國waters公司）。游離氨基酸組分含量變化幅度的計算方法：每種氨基酸在相鄰兩次取樣間的變化幅度⊿按下式計算：

式中：表示任一溫度或時間樣品的氨基酸含量;表示下一次取樣樣品的氨基酸含量。谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic transaminase）活性、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase）活性：采用ELLISA法用谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶聯(lián)免疫分析測定試劑盒（武漢伊艾博科技有限公司）進(jìn)行測定。所用儀器為SpectraMax 190光吸收型酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），AC8洗板機(jī)（Thermo Labsystems）。

1.4? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)均采用EXCEL 2016和SPSS 22.0分析軟件進(jìn)行方差分析、計算和統(tǒng)計作圖表。

2? 結(jié)? 果

2.1? 烘烤過程中煙葉游離氨基酸組分描述性統(tǒng)計

由表2可以看出，烘烤過程中不同階段煙葉游離氨基酸組分差異很大，其中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、絲氨酸、脯氨酸、精氨酸、纈氨酸、賴氨酸和氨基酸總量變異系數(shù)超過60%，屬于重度變異，且標(biāo)準(zhǔn)差大于1，天冬氨酸、

谷氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和絲氨酸指標(biāo)的偏度和峰度小于?1或者大于1，樣本內(nèi)變異已經(jīng)不符合正態(tài)分布，表明天冬氨酸等10種氨基酸和氨基酸總量在烘烤過程中波動和變幅較大。

2.2? 烘烤過程中煙葉游離氨基酸組分含量變化

根據(jù)烘烤過程中煙葉游離氨基酸組分的描述性統(tǒng)計結(jié)果，選用波動和變幅較大的10種氨基酸進(jìn)行分析，由表3和表4可知，在密集烘烤過程中，不同成熟度煙葉游離氨基酸總量和組分含量的變化差異很大，其中尚熟煙葉游離氨基酸組分含量均增加，而適熟和過熟煙葉組分含量有增有減。依據(jù)烘烤過程中適熟和過熟煙葉游離氨基酸組分含量變化趨勢，可以分為4類：第1類游離氨基酸組分含量表現(xiàn)為“升高-下降-升高”;第2類游離氨基酸組分含量表現(xiàn)為“升高-下降”;第3類游離氨基酸組分含量表現(xiàn)為“下降-升高”;第4類游離氨基酸組分含量表現(xiàn)為一直下降。烘烤完成后，第1類游離氨基酸組分含量較烤前增加，而第2類、第3類和第4類游離氨基酸組分含量則較烤前減少。

第1、2類游離氨基酸，不同成熟度煙葉谷氨酸在烘烤時間72～96 h以及烘烤溫度42～48 ℃，脯氨酸在烘烤時間0～48 h以及烘烤溫度25～38 ℃，總氨基酸在烘烤時間24～84 h以及烘烤溫度36～46 ℃，組氨酸和絲氨酸在烘烤時間36～72 h以及烘烤溫度36～42 ℃，含量增加幅度均存在極顯著性差異（<0.01）。其中尚熟煙葉谷氨酸、脯氨酸、氨基酸總量、組氨酸和絲氨酸含量增幅較快。

第3類游離氨基酸，不同成熟度煙葉丙氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸在烘烤時間48～84 h以及烘烤溫度38～46 ℃，含量變化幅度均存在極顯著性差異（<0.01）。其中過熟和適熟煙葉丙氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸含量在烘烤過程中變黃后期（烘烤時間48～72 h和烘烤溫度38～42 ℃）降幅較大，而尚熟煙葉在烘烤定色前期（烘烤時間72～84 h和烘烤溫度42～46 ℃）增幅較大。

第4類游離氨基酸，不同成熟度煙葉天冬氨酸在烘烤時間48～72 h以及烘烤溫度38～42 ℃，賴氨酸和精氨酸在烘烤時間24～48 h以及烘烤溫度36～38 ℃，含量下降幅度均存在極顯著性差異（<0.01）。其中過熟和適熟煙葉天冬氨酸含量在烘烤過程中變黃后期（烘烤時間48～72 h和烘烤溫度38～42 ℃）降幅較大，而賴氨酸和精氨酸含量在烘烤變黃中期（烘烤時間24～48 h和烘烤溫度36～38 ℃）降幅較大。表明不同成熟度煙葉游離氨基酸組分變化差異主要集中在變黃期和定色前期（烘烤時間24～84 h和烘烤溫度36～46 ℃）。

2.3? 烘烤過程中煙葉轉(zhuǎn)氨酶活性的變化

由圖1、圖2和圖3可知，在密集烘烤過程中，各處理煙葉天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)“上升-下降”的變化。其中以時間為取樣依據(jù)的烘烤，波峰均出現(xiàn)在烘烤第72 h，酶活分別為703.57、811.54和174.55 ng/g;而以溫度為取樣依據(jù)的烘烤，波峰均出現(xiàn)在烘烤42 ℃，酶活力分別為584.63、686.06和160.43 ng/g。表明烘烤煙葉轉(zhuǎn)氨酶活性較高的時期主要表現(xiàn)在變黃后期和定色前期。不同成熟度煙葉天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性在烘烤時間60 h、72 h和84 h以及烘烤溫度38 ℃、42 ℃和46 ℃均存在極顯著性差異（<0.01），其中過熟和適熟煙葉轉(zhuǎn)氨酶活性均極顯著高于尚熟煙葉，表明過熟和適熟煙葉在烘烤變黃后期和定色前期更有利于游離氨基酸組分相互轉(zhuǎn)化。

3? 討? 論

烘烤中游離氨基酸的轉(zhuǎn)化利用相當(dāng)復(fù)雜，目前認(rèn)為主要有3種途徑：一種是脫氨基作用，又可以分為轉(zhuǎn)氨基作用和氧化脫氨基作用，前者將氨基酸脫下氨基轉(zhuǎn)移到α-酮酸上形成新的氨基酸，

后者將氨基酸分解轉(zhuǎn)變?yōu)榘睔夂挺?酮酸，第二種途徑是通過脫羧基作用，將氨基酸分解為CO和胺，第三種與還原糖發(fā)生非酶棕色化反應(yīng)生成美拉德產(chǎn)物，賦予煙氣香味，其中轉(zhuǎn)氨基作用和美拉德反應(yīng)在煙葉烘烤中為主要轉(zhuǎn)化方式。本試驗分別采用以溫度為依據(jù)取樣和以時間為依據(jù)取樣，系統(tǒng)研究了不同成熟度煙葉在烘烤過程中，氨基酸組分含量和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的動態(tài)變化，結(jié)果表明，以溫度為依據(jù)取樣和以時間為依據(jù)取樣所獲得的氨基酸組分含量

和相關(guān)轉(zhuǎn)氨酶活性的動態(tài)變化分析結(jié)果基本相似。這說明在烤煙品種、成熟度已知的條件下，無論是采取“時間取樣模式”，還是“溫度取樣模式”進(jìn)行煙葉內(nèi)氨基酸組分及酶活性的分析都可以獲得較好的研究結(jié)果。但在烘烤試驗取樣時，應(yīng)注意將溫度或時間與烘烤工藝的變黃期、定色期和干筋期相對應(yīng)。

謝良文等研究結(jié)果將烘烤過程中游離氨基酸組分含量變化分為4類，分別是“下降-上升”、“下降-平穩(wěn)”、“上升-下降”和“基本不變”4種變化形式。本研究在不同成熟度煙葉在烘烤過程中，共檢測出18種氨基酸，其中以谷氨酸、脯氨酸、組氨酸等10種氨基酸和氨基酸總量波動和變幅較大，也將其分為4類，其中第2類游離氨基酸組分絲氨酸和組氨酸含量表現(xiàn)為“升高-下降”，第4類游離氨基酸組分賴氨酸和精氨酸含量表現(xiàn)為一直下降，共同特點是從烘烤定色期（烘烤時間72 h和烘烤溫度42 ℃）開始，各類氨基酸出現(xiàn)顯著下降趨勢，這可能與還原糖發(fā)生非酶棕色化反應(yīng)生成美拉德產(chǎn)物有關(guān)，這與過偉民等研究結(jié)果相似。ASHOOR等^[22]依據(jù)美拉德反應(yīng)的程度將氨基酸的反應(yīng)活性劃分為高、中、低3檔，高活性的氨基酸多為堿性（組氨酸、賴氨酸和精氨酸），低活性氨基酸多為酸性，脯氨酸和絲氨酸屬于中等活性，其含量占總量的40%～70%，因此，在烘烤定色期和干筋期，高活性和中等活性氨基酸含量降幅越大，其美拉德反應(yīng)越劇烈。

轉(zhuǎn)氨酶是催化游離氨基酸組分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，其活性高低直接影響著L-氨基酸與α-酮酸的轉(zhuǎn)氨速率，一般轉(zhuǎn)氨反應(yīng)都是可逆的。本試驗結(jié)果表明，與尚熟煙葉相比，適熟和過熟煙葉在烘烤變黃后期和定色前期（烘烤時間60～84 h和烘烤溫度38～46 ℃）天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性較高，此時，第1類游離氨基酸中的谷氨酸、第3類游離氨基酸中的丙氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸、第4類游離氨基酸中的天冬氨酸在烘烤中變黃后期和定色前期變幅較大（烘烤時間48～84 h和烘烤溫度38～46 ℃），這可能是由于轉(zhuǎn)氨酶在植物中各時期分布和活性有很大差異，適熟和過熟煙葉處于衰老進(jìn)程的后期，在烘烤逆境環(huán)境脅迫下，其酶活性表現(xiàn)出較高的活性。本文只初步、定量分析了不同成熟度煙葉游離氨基酸組分相互轉(zhuǎn)化以及相關(guān)酶活動態(tài)變化規(guī)律，煙葉的烘烤是一個化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜的酶活變化體系，進(jìn)一步研究不同成熟度煙葉的游離氨基酸組分與轉(zhuǎn)氨酶活性的對應(yīng)關(guān)系，制定更為科學(xué)、合理的烘烤工藝曲線標(biāo)準(zhǔn)，將能進(jìn)一步提升煙葉烘烤品質(zhì)，更符合不同卷煙企業(yè)原料的需求。

4? 結(jié)? 論

密集烘烤過程中，煙葉中谷氨酸、脯氨酸、組氨酸等10種氨基酸和氨基酸總量波動和變幅較大。不同成熟度煙葉中谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和天冬氨酸含量差異主要集中在變黃后期和定色前期（烘烤時間48～84 h和烘烤溫度38～46 ℃），此時，適熟和過熟煙葉在烘烤中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶與谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性較高。與尚熟煙葉相比，適熟和過熟煙葉絲氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸含量從烘烤定色期（烘烤時間72 h和烘烤溫度42 ℃）開始，呈現(xiàn)下降的變化趨勢，表明煙葉成熟度對游離氨基酸轉(zhuǎn)化為美拉德產(chǎn)物有一定影響。由本試驗研究結(jié)果可知提高煙葉成熟度有利于氨基酸組分的互相轉(zhuǎn)化以及美拉德產(chǎn)物生成，為后續(xù)煙葉成熟采收和烘烤工藝優(yōu)化提供了重要理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。

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