杜卓 余小姚 鄺翠瓊 莫玉芳 周寶珠 劉露 李海儀 郭嘉亮

摘 要 目的：建立測定丁香油滴丸中丁香酚含量的方法，并對其制備工藝進行優(yōu)化。方法：采用紫外-可見分光光度法測定丁香油滴丸中丁香酚的含量。在單因素試驗基礎上，以藥物質量占總質量的百分比、藥液溫度、冷凝液下落距離、藥液滴距為因素，以滴丸圓整度、硬度、質量差異及綜合得分為指標，采用L9（34）正交設計試驗對制備工藝進行優(yōu)化，并進行驗證試驗和滴丸質量考察。結果：丁香酚質量濃度線性范圍為15.15～45.45 μg/mL（r=0.999 6）;精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均小于1%;加樣回收率為97.41%～100.59%（RSD=1.35%，n=6）。最優(yōu)制備工藝為藥物質量占總質量的百分比為5%，藥液溫度為80 ℃，冷凝液下落距離為13 cm，藥液滴距為6 cm。在此條件下，所得丁香油滴丸外觀完整光潔，硬度適宜，圓整度較好;丁香酚平均含量為4.073%（RSD=0.35%，n=6）。結論：所建含量測定方法操作簡單、方便，可用于測定丁香油滴丸中丁香酚的含量;優(yōu)化所得制備工藝穩(wěn)定、可行。

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for content determination of eugenol in Syzygium aromaticum oil dropping pills， and to optimize the preparation technology. METHODS： The content of eugenol in S. aromaticum oil dropping pills was determined by UV spectrophotometry. Based on single factor test， using the percentage of drugs in total amount， liquid temperature， falling distance of condensate， liquid drop distance as factors， taking the roundness， weight and hardness difference and comprehensive score as factors， L9（34） orthogonal design test was adopted to optimize the preparation process. RESULTS： The linear range of eugenol was 15.15-45.45 μg/mL（r=0.999 6）; RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 1%; the recoveries were 97.41%-100.59%（RSD=1.35%， n=6）. The optimal preparation technology included that the percentage of drugs in total amount was 5%; liquid temperature was 80 ℃; falling distance of condensate was 13 cm; liquid drop distance was 6 cm. The dropping pills had smooth appearance， good roundness and moderate hardness; the average content of engenol was 4.073%（RSD=0.35%，n=6）. CONCLUSIONS： The established method is simple， and can be used for the content determination of eugenol in S. aromaticum oil dropping pills. The optimal preparation technology is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Syzygium aromaticum oil dropping pills; Eugenol; UV spectrophotometry; Content determination; Preparation technology; Optimization; Orthogonal design

丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）為桃金娘科植物丁香樹的干燥花蕾。丁香油是丁香花蕾經水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，其主要活性成分為丁香酚，含量約為80%～87%，具有抑菌[1]、抗氧化[2-3]、抗缺氧[4-5]、抗血栓[6]、抗凝、抗血小板聚集[7]、疏通血管、鎮(zhèn)痛[8]等作用。雖然已有文獻報道了丁香油膜劑、栓劑等非口服局部給藥制劑[8-9]，但這些劑型在使用方式上存在諸多不便。而將丁香油制成經口服給藥的滴丸可達到使用方便、快速起效的目的，具有較好的開發(fā)應用前景[10]，而且目前也尚無關于丁香油滴丸研究的報道。為此，本研究采用紫外-分光光度法（UV）測定丁香油滴丸中丁香酚的含量，采用正交設計對該滴丸制備工藝進行優(yōu)化，旨在為其藥理、藥效研究提供依據(jù)，也為開發(fā)丁香油新制劑提供參考。

1 材料

1.1 儀器

752N型UV計（上海儀電分析儀器有限公司）;SIM-F140AY65-PC型制冰機[松下冷鏈（大連）有限公司];RO-2236P型Tankpro純水機（浙江銘泉水暖設備有限公司）;eppendorf 1 000 μL移液槍（德國艾文德集團公司）;HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）;YPD-30A型片劑硬度儀、CJY-300D型片劑脆碎度測定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）;AL204型萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

丁香油（批號：20161014，規(guī)格：100 mL/瓶）、丁香酚對照品（批號：20180622，純度：≥98.5%）、單硬脂酸甘油酯（批號：20171218）均由國藥集團化學試劑有限公司提供;聚乙二醇4000（PEG 4000，廣東光華化學廠有限公司，批號：20090420）;聚乙二醇6000（PEG 6000，廣州市醫(yī)藥公司化學試劑玻璃儀器批發(fā)部，批號：990825）;二甲基硅油、無水乙醇均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 丁香油滴丸的制備

將PEG 4000、PEG 6000 以質量比1 ∶ 3混合作為基質，置于75 ℃電熱恒溫水浴鍋中水浴加熱至溶解，加入處方量的丁香油攪拌，使其與基質充分混勻;將混勻后的藥液在電熱恒溫水浴鍋中保溫，采用1 000 μL移液槍吸取藥液后，以 30滴/min滴入二甲基硅油中冷凝，并保持裝有二甲基硅油的容器低溫，冷凝成丸后靜置3 min;收集滴丸并瀝干，用濾紙吸去滴丸表面冷凝液，自然干燥6 h，即得丁香油滴丸。

2.2 丁香酚含量測定

采用UV法測定[9] 。

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取丁香酚對照品1.010 g，置于100 mL量瓶中，加80%乙醇溶解并定容，搖勻;精密吸取10 mL，置于100 mL量瓶，加80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為1.010 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“2.1”項下丁香油滴丸20粒，稱定質量，置于干燥的小燒杯中，加80%乙醇溶解并定容至50 mL量瓶中，經濾紙濾過后，取續(xù)濾液2 mL，置于25 mL量瓶中，加80%乙醇至刻度，即得供試品溶液。

2.2.3 空白對照溶液 以80%乙醇為空白對照溶液。

2.2.4 檢測波長的確定 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液2 mL，置于100 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為20.20 μg/mL對照品溶液A。以80%乙醇為空白對照，取上述對照品溶液A、“2.2.2”項下供試品溶液適量，在200～400 nm波長范圍內進行掃描[11]。結果，兩者在210、228 nm波長處吸光度均較高，但存在末端吸收、空白對照吸收等因素的干擾;而在280 nm波長處兩者也有吸收峰，且空白對照在此處無吸收，故選擇280 nm為檢測波長，詳見圖1。

2.2.5 線性關系考察 取“2.2.1”項下對照品溶液 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL，分別置于100 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，制成質量濃度分別為15.15、20.20、25.25、30.30、35.35、40.40、45.45 μg/mL的系列對照品溶液。以80%乙醇為空白對照，于280 nm波長處測定上述系列溶液吸光度。以丁香酚質量濃度為（x，μg/mL）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸，得丁香酚回歸方程為y=0.015 8x（r=0.999 6）。結果表明，丁香酚在15.15～45.45 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液適量，以80%乙醇為空白對照，于280 nm波長處測定吸光度，平行測定5次。結果，吸光度的RSD為 0.29%（n=5），表明本方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24、48 h[11-12]時，以80%乙醇為空白對照，于280 nm波長處測定吸光度。結果，吸光度的RSD為0.45%（n=8），表明供試品溶液于室溫下放置48 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復性試驗 取“2.1”項下丁香油滴丸適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，以80%乙醇為空白對照，于280 nm波長處測定吸光度并按標準曲線法計算樣品的含量。結果，含量的RSD為0.12%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取“2.1”項下已知含量的丁香油滴丸適量，共6份，加入“2.2.1”項下對照品溶液0.5 mL，加80%乙醇溶解并定容至50 mL量瓶中，濾紙濾過，取濾液2 mL置于25 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，以80%乙醇為空白對照，于280 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率，結果見表1。

2.2.10 樣品含量測定 取“2.1”項下丁香油滴丸適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，以80%乙醇為空白對照，于280 nm波長處測定吸光度并按標準曲線法計算樣品的含量。結果，樣品含量為4.067%～4.082%，平均含量為4.075%，RSD為0.123%（n=6）。

2.3 單因素試驗篩選工藝

2.3.1 基質的篩選 分別將PEG 4000、PEG 6000 按質量比1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、0 ∶ 1、0 ∶ 0混合作為基質（所有基質總量固定為1.2 g），按“2.1”項下方法制備丁香油滴丸[11]，以黏稠度、滴丸成型情況、硬度為指標篩選基質比例，結果見表2。根據(jù)表2結果選擇處方1、2、5，分別加入丁香油1.0 g進一步篩選，結果見表3。由表3可知，處方2制備的丁香油滴丸圓整度好，故以處方2的基質比例制備丁香油滴丸。

2.3.2 冷凝溫度的篩選 參考相關文獻[13-14]，分別以5、7、9 ℃為冷凝溫度，以滴丸沉降速度、滴丸成型情況為指標進行篩選，結果見表4。由表4可知，冷凝溫度為5 ℃時滴丸沉降速度適中，滴丸圓整度好、無拖尾現(xiàn)象、硬度適中，故選擇冷凝溫度為5 ℃。

2.4 工藝考察指標

2.4.1 滴丸圓整度 滴丸圓整度總分為5分，外形不規(guī)則為1分，扁圓或橢圓形且有空泡為2分，圓形且有空洞為3分，橢圓形為4分，圓形為5分;分數(shù)越高表示滴丸圓整度越好[12]。

2.4.2 質量差異 質量差異總分為5分，RSD為4.7%～5%記1分，RSD為4.4%～<4.7%記2分，RSD為4.1%～<4.4%記3分，RSD為3.8%～<4.1%記4分，RSD<3.8%記5分[由于制備滴丸的質量差異均未超過2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定，故質量差異以RSD為標準];RSD越小，分數(shù)越高，表示質量差異越小[12]。

2.4.3 硬度差異 硬度差異總分為5分，評分標準同“2.4.2”項下標準;RSD越小，分數(shù)越高，表示硬度差異越小[12]。

2.4.4 綜合得分 綜合得分=質量差異評分+硬度差異評分;綜合得分越高，表示制備工藝越穩(wěn)定。

2.5 正交試驗優(yōu)化工藝

2.5.1 試驗設計 參考相關文獻[9，13-15]，以藥物質量占總質量的百分比（A）、藥液溫度（B）、冷凝液下落距離（C）、藥液滴距（D）為因素，以滴丸圓整度、質量差異、硬度差異及綜合得分為指標，采用L9（34）正交設計試驗對制備工藝進行優(yōu)化。因素與水平見表5，試驗方案設計與結果見表6，方差分析結果見表7、表8。

由表6可知，影響滴丸成型的因素大小順序依次為A>D>C>B，即藥物質量占總質量的百分比>藥液滴距>冷凝液下落距離>藥液溫度，其中藥物質量占總質量的百分比有顯著影響。最優(yōu)制備工藝為A3B2C2D3，即藥物質量占總質量的百分比為5%，藥液溫度為80 ℃，冷凝液下落距離為13 cm，藥液滴距為6 cm。

2.5.2 工藝驗證試驗 按最優(yōu)制備工藝制備丁香油滴丸并按“2.2”項下方法測定含量，平行測定6次。結果，每粒丁香油滴丸中丁香酚的平均含量為4.073%（RSD=0.35%，n=6），提示該工藝穩(wěn)定、可行。

2.6 最優(yōu)工藝制備的丁香油滴丸質量考察

2.6.1 外觀形態(tài) 取按最優(yōu)制備工藝制備的丁香油滴丸進行觀察。結果，其外觀完整光潔，硬度適宜，圓整度較好，無拖尾粘連，符合2015年版《中國藥典》（四部）中滴丸的外觀要求[12]。

2.6.2 質量差異 取按最優(yōu)制備工藝制備的丁香油滴丸20粒，分別稱定質量。結果，20粒滴丸質量范圍為0.014 5～0.016 8 g/粒，總質量為0.307 2 g，平均為0.015 4 g/粒，RSD為3.22%（n=20），該結果未超過2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的限度值（藥典規(guī)定對低于0.03 g滴丸的質量差異限度要求為±15%，滴丸超出質量差異限度不得多于2丸，并不得有1丸超出限度1倍[12]），符合規(guī)定。

2.6.3 硬度差異 取按最優(yōu)制備工藝制備的丁香油滴丸6粒，采用片劑硬度測試儀檢測滴丸硬度。結果，硬度范圍為2.0～2.1 N，平均硬度為2.0 N，RSD為3.87%（n=6），表明該滴丸硬度差異小。

3 討論

有研究認為，制備滴丸的冷凝液下落距離需要50 cm以上[14-15]。而本研究前期預試驗發(fā)現(xiàn)，丁香油滴丸在冷凝液下降7～8 cm時即可成球形，因此本研究結合上述文獻分別對冷凝液下落8、13、18 cm進行單因素考察。

本研究前期預試驗還發(fā)現(xiàn)，在制備丁香油滴丸時，先使空白基質滴丸滿足一定的硬度及圓整度條件后，再加入丁香油，可使藥液處于較為黏稠的狀態(tài)，且混合后藥液溫度下降，使得藥液黏稠度增加。此外，藥液體積減小，可致藥液降溫越快，從而使藥液更易凝固或粘連在移液槍的槍頭壁上，加之小容量移液槍的槍頭開口較小，難于吸取黏稠藥液制備滴丸，致使滴丸的質量差異較大[16]。故本研究綜合考慮操作方便，同時能較好維持藥液溫度的情況下，選擇1 000 μL移液槍制備滴丸。

本研究參考相關文獻[14-15]，曾嘗試采用冰水浴冷卻，但降溫效果差且降溫等待時間長，因此改用二甲基硅油為冷凝液，使用前將二甲基硅油置于冰箱冷藏過夜，試驗中保持冷凝液及裝有冷凝液的容器低溫，該方法降溫效果好，低溫保持時間長。此外二甲基硅油采用冰箱冷藏，可減少滴丸制備過程中產生氣泡，從而減小冷凝液中氣泡對滴丸成型及圓整度的影響。

綜上所述，所建含量測定方法操作簡單、方便，可用于測定丁香油滴丸中丁香酚的含量;優(yōu)化所得制備工藝穩(wěn)定、可行。

參考文獻

[ 1 ] 蔡少青.生藥學[M]. 6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：185-187.

[ 2 ] OU HC，CHOU FP，LIN TM，et al. Protective effects of eugenol against oxidized LDL-induced cytotoxicity and adhesion molecule expression in endothelial cell[J].Food Chem Toxicol，2006，44（9）：1485-1495.

[ 3 ] FUJISAWA S，ATSUMI T，SATOH K，et al. Radical gen- geration，radical-scavenging activity，and cytotoxicity of? eugenol-related compounds[J]. In Vitr Mol Toxico，2000，? 13（4）：269-279.

[ 4 ] ITO M，MURAKAMI K，YOSHINO M. Antioxidant action of eugenol compounds：role of metalion in the inhi- bition of lipid peroxidation[J]. Food Chem Toxicol，2005，43（3）：461-466.

[ 5 ] 袁德俊.丁香酚對體外培養(yǎng)心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2009.

[ 6 ] 李錦繡.丁香現(xiàn)代藥理研究進展[J].實用中醫(yī)藥雜志，2002，18（6）：54.

[ 7 ] 李英嘉，劉洪章.丁香揮發(fā)油的研究進展[J].黑龍江農業(yè)科學，2014（7）：148-151.

[ 8 ] 王二麗，楊秀娟，杜卓，等.丁香油陰道栓的制備與質量評價[J].海峽藥學，2019，31（1）：10-13.

[ 9 ] 杜卓，劉芳，譚淑儀，等.紫外分光光度法測定丁香油膜劑丁香酚含量的方法學研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2017，28（2）：315-316.

[10] 朱金段，袁德俊，林新穎，等.丁香的藥理研究現(xiàn)狀及臨床應用[J].中國藥物經濟學，2013（1）：32-35.

[11] 張智敏，朱倩倩.紫外分光光度法測定丁香油和風油精中丁香酚的含量[J].安徽工業(yè)大學學報（自然科學版），2006，23（3）：272-274.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：11-12.

[13] 劉永霞，王琰.正交試驗法優(yōu)選心腦欣滴丸的制備工藝研究[J].藥學研究，2016，35（12）：709-711.

[14] 張麗軍，肖志強，朱愛華，等.肉桂油滴丸制備工藝研究[J].內蒙古中醫(yī)藥，2017，36（13）：122-123.

[15] 魏永義，李懷平，王朔，等.八味沉香滴丸制備方法研究[J].中醫(yī)藥導報，2014，20（8）：79-81.

[16] 梁偉春，王金，曹惠琪，等.影響滴丸丸重因素現(xiàn)狀的研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2013，26（3）：76-77.

（收稿日期：2019-05-28 修回日期：2019-10-13）

（編輯：陳 宏）