帖余，劉軍，李麗*，王景峰，王國強，趙琦鍇，周鵬松

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢，643000)2(樂山恒峰華邦生物科技有限公司，四川 樂山，614000)

菜粕是菜籽經(jīng)榨油后的副產(chǎn)物，其中含粗蛋白質(zhì)量分數(shù)為35%～42%，氨基酸含量豐富，是一種重要的植物蛋白資源[1-2]。但由于含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子且蛋白品質(zhì)不佳，降低了其在食品和飼料行業(yè)中的應(yīng)用價值[3-4]。為了改善菜粕的品質(zhì)，國內(nèi)外許多學(xué)者已對其進行了大量研究，雖然早期的物理法、化學(xué)法能有效降低有毒物質(zhì)，但存在試劑殘留、營養(yǎng)損失等問題[5-6]。近年來，微生物發(fā)酵法因具有經(jīng)濟高效、重現(xiàn)性好等優(yōu)點受到廣泛關(guān)注[7]。

目前大多數(shù)提高菜粕營養(yǎng)價值的研究僅側(cè)重于通過微生物發(fā)酵脫毒，而對蛋白品質(zhì)提升改良關(guān)注相對較少。即使菜粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子能被有效的降解，但其中大部分蛋白仍為大分子蛋白，且小肽含量少、蛋白溶解度低[8]，因此其品質(zhì)不如豆粕魚粉等蛋白原料，仍然導(dǎo)致其使用價值受到限制。小肽是由2～20個氨基酸組成的寡肽[9]，不僅具有易分解、吸收的特點，更具有抗氧化性等功能[10-11]。蛋白溶解性是衡量蛋白質(zhì)食品加工屬性的重要指標，是具有其他優(yōu)良功能性質(zhì)的先決條件[12]。因此，提高菜粕中小肽含量及蛋白溶解度將有利于其在食品、飼料行業(yè)的應(yīng)用。基于霉菌在發(fā)酵過程中會分泌多種蛋白酶系的特點[13-14]，本實驗主要先通過霉菌固態(tài)發(fā)酵菜粕產(chǎn)酶，后在發(fā)酵的基礎(chǔ)上利用酶解進一步處理菜粕提高小肽含量和蛋白溶解度。同時考察不同條件對菜粕中小肽含量和蛋白溶解度的影響，為進一步提高菜粕應(yīng)用價值奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉(H1, H2, H3, H4)、米曲霉(M1, M2)、白地霉(J1)、產(chǎn)朊假絲酵母(J2)、熱帶假絲酵母(J3)、解脂假絲酵母(J4, J5):均購于中國工業(yè)菌種保藏中心(CICC)。

1.1.2 原料

菜粕、麩皮:由樂山恒峰華邦科技有限公司提供。菜粕中含粗蛋白，小肽質(zhì)量分數(shù)為38%、2.86%，蛋白質(zhì)溶解度為 10.17%，水分含量為 10.09%(質(zhì)量分數(shù))；麩皮中水分含量為9.87%(質(zhì)量分數(shù))。

1.1.3 培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基：黑曲霉、米曲霉采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，酵母菌采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

霉菌麩皮種子培養(yǎng)基：麩皮∶水=2∶1 (g∶mL)；酵母麩皮種子培養(yǎng)基：麩皮∶水=6∶5 (g∶mL)；混勻后分別取30 g裝入500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：菜粕∶麩皮∶水=7∶3∶15 (g∶g∶mL)；混勻取 60 g裝于500 mL三角瓶，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

T-114型分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；T6紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；QYC-2102C型恒溫培養(yǎng)搖床，上海福馬實驗設(shè)備有限公司；MF 80BSH-2型霉菌培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LS-75HD立式高壓蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2F 型超級潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；K9840自動凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子制備

將保藏的菌種勾取5～7環(huán)分別接種于種子培養(yǎng)基中，霉菌30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，酵母30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

將霉菌和酵母的麩皮種子分別按1∶20(g∶g)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，30 ℃發(fā)酵36 h；之后取30 g發(fā)酵菜粕于70 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩網(wǎng)測定指標。

1.3.3 酶解

取固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后的30 g發(fā)酵菜粕裝入自封袋，45 ℃密閉恒溫酶解24 h；之后將菜粕于70 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩網(wǎng)測定指標。

1.3.4 不同工藝條件對小肽含量和蛋白溶解度的影響

固態(tài)發(fā)酵階段，分別考察不同發(fā)酵時間(12、24、36、48、60、72 h)對小肽和蛋白溶解度變化影響；酶解階段，分別考察不同酶解時間(6、12、18、24、30、36 h)、酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)對小肽和蛋白溶解度變化影響。

1.3.5 理化指標測定

小肽根據(jù)GB/T 22492—2008測定[15]；蛋白溶解度根據(jù)文獻[16]測定；酸性蛋白酶活根據(jù)文獻[17]測定；蛋白分子質(zhì)量分布采用Tricine-SDS-PAGE測定[18]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進行單因素方差分析，并用Duncan檢驗法進行多重比較，試驗結(jié)果采用平均值±標準誤差表示，以P<0.05作為差異性顯著判斷標準。采用Origin 2018 進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵

所有單一試驗菌株發(fā)酵36 h后對小肽含量和蛋白溶解度均有一定影響(圖1)。結(jié)果表明，經(jīng)霉菌發(fā)酵后，小肽含量及蛋白溶解度顯著提高(P<0.05)。經(jīng)H4發(fā)酵后，菜粕中小肽質(zhì)量分數(shù)及蛋白溶解度均最高，分別為7.86%、25.23%，相比于未發(fā)酵菜粕分別提高了148.08%和174.83%。這與吳正可等[19]通過多菌種發(fā)酵菜粕將小肽含量從0.84%提高至2.62%的研究結(jié)果相似。

圖1 單菌固態(tài)發(fā)酵對小肽含量及蛋白溶解度的影響Fig.1 Changes of small peptide content and protein solubility of rapeseed meal after fermentation

2.2 酶解

圖2表明，進一步將霉菌發(fā)酵的菜粕酶解，小肽含量和蛋白溶解度在發(fā)酵后的基礎(chǔ)上進一步提高。

圖2 酶解發(fā)酵菜粕后小肽含量及蛋白溶解度變化Fig.2 Changes of small peptide content and protein solubility of rapeseed meal after enzymatic hydrolysis

尤其經(jīng)H4發(fā)酵酶解后，小肽質(zhì)量分數(shù)及蛋白溶解度提高到13.05%和44.37%。相比于單步固態(tài)發(fā)酵分別提高了66.03%和75.86%，相比于空白，小肽含量提高了3.6倍。這與姚曉紅等[20]采用外加中性蛋白酶與微生物協(xié)同固態(tài)發(fā)酵菜粕96 h后小肽含量提高了3.7倍的研究結(jié)果相似。在發(fā)酵過程中，蛋白酶將菜粕中大分子蛋白分解為小分子肽，同時由于菌體的生長代謝，分解培養(yǎng)基中部分碳水化合物，最終導(dǎo)致干物質(zhì)損失，因此使得小肽含量提高[21]。當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，將菜粕置于適當(dāng)溫度下進行酶解，H4分泌的相關(guān)的酶系進一步將大分子蛋白降解為小分子肽，因此使得小肽含量及蛋白溶解度進一步顯著提高。將酵母菌發(fā)酵的菜粕進一步酶解后，相比單步固態(tài)發(fā)酵，小肽含量及蛋白溶解度提高不明顯，可能由于酵母菌分泌蛋白酶系能力較弱導(dǎo)致，因此推測此過程中小肽含量增加的主要原因是菜粕中碳水化合物被消耗而使得小肽含量相對富集。由于菜粕經(jīng)H4發(fā)酵酶解后，小肽含量及蛋白溶解度最高，因此選擇H4用于后續(xù)試驗研究最佳酶解條件。

2.3 不同發(fā)酵酶解時間對小肽含量、蛋白溶解度的影響

經(jīng)H4發(fā)酵不同時間后酶解24 h的結(jié)果如圖3所示。發(fā)酵48 h后酶解，小肽質(zhì)量分數(shù)及蛋白溶解度最高，分別為13.96%，42.98%。在發(fā)酵48 h前酶解，小肽含量及蛋白溶解度隨蛋白酶活增加而增加，但當(dāng)發(fā)酵超過48 h后酶解，小肽含量和蛋白溶解度不隨酶活增加而增加。結(jié)果表明，在酶解過程中，小肽含量及蛋白溶解度與蛋白酶活變化趨勢不同，可能存在其他酶系影響小肽含量及蛋白溶解度。此結(jié)果與ZHAO等[22]的研究結(jié)果相似，在酶解豆粕生產(chǎn)氨基酸過程中，氨基酸含量不完全隨中性蛋白酶的變化趨勢變化。

圖3 發(fā)酵時間對小肽含量、蛋白溶解度、蛋白酶活的影響Fig.3 Effect of fermentation time on small peptide content, protein solubility and protease activity

圖4表明，通過固態(tài)發(fā)酵后，菜粕中含小肽質(zhì)量分數(shù)及蛋白溶解度分別為7.74%、27.40%，再經(jīng)過45 ℃酶解30 h后，小肽質(zhì)量分數(shù)及蛋白溶解度分別提高至14.12%、 44.95%，相比于單步固態(tài)發(fā)酵分別提高了82.43%和64.05%。同時結(jié)果也表明，酶解前12 h， 小肽含量及蛋白溶解度增長較快，12 h后增長速率下降，可能是酶解12 h后蛋白酶酶活力大幅下降所致；當(dāng)經(jīng)過30 h酶解后，小肽含量及蛋白溶解度不隨酶解時間增加而改變(P>0.05)，可能是酶解后期底物濃度不足和蛋白酶活較低導(dǎo)致。因此，選擇48、30 h分別為最佳發(fā)酵、酶解時間。

圖4 酶解時間對小肽含量、蛋白溶解度、蛋白酶活的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on small peptide content, protein solubility and protease activity

2.4 酶解溫度對小肽含量、蛋白溶解度的影響

如圖5所示， 45～50 ℃為最適酶解溫度范圍，當(dāng)酶解溫度超過50 ℃時，小肽含量及蛋白溶解度明顯下降(P<0.05)。這可能因為H4產(chǎn)生的蛋白酶最適作用溫度為45～50 ℃，當(dāng)酶解溫度超過酶最適溫度范圍時，酶穩(wěn)定性下降，易在酶解過程中失活，最終導(dǎo)致酶解后小肽含量及蛋白溶解度低。由于發(fā)酵的菜粕在45～50 ℃酶解后，小肽含量及蛋白溶解度沒有顯著變化(P>0.05)，同時為降低酶解能耗，選擇45 ℃作為最佳酶解溫度。

圖5 酶解溫度小肽含量、蛋白溶解度、蛋白酶活的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on small peptide content, protein solubility and protease activity

2.5 發(fā)酵酶解后菜粕蛋白質(zhì)分子組成變化

如圖6所示，未發(fā)酵的菜粕蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在4.6～42 kDa分布較少，經(jīng)過H4發(fā)酵后，10～42 kDa的蛋白質(zhì)含量增加，少量10 kDa的蛋白質(zhì)被分解。經(jīng)過酶解后，4.6～97.2 kDa的蛋白質(zhì)含量明顯減少，特別是10 kDa的蛋白質(zhì)幾乎完全降解。由于菜粕中的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要約為300 kDa[23]，經(jīng)H4發(fā)酵后，其中部分大分子蛋白被H4或分泌的酶分解利用，使得42～97.2 kDa的蛋白質(zhì)含量增加，且部分10 kDa的蛋白質(zhì)被分解為小分子蛋白。結(jié)果表明，經(jīng)過酶解后大部分10～97.2 kDa的蛋白質(zhì)進一步被相關(guān)酶系分解為小分子蛋白(<4.6 kDa)，使得小肽含量及蛋白溶解度在酶解后顯著增加。

M1、M2-蛋白分子質(zhì)量標準圖6 菜籽粕發(fā)酵、酶解后蛋白分子組成變化Fig.6 Changes of protein molecular composition of fermented and enzymatic hydrolysis rapeseed meal

3 結(jié)論

通過不同工藝條件比較，確定最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵時間、酶解時間和酶解溫度分別為48、30 h和45 ℃。與空白對照相比，經(jīng)過發(fā)酵酶解兩步法處理的菜粕，其小肽含量和蛋白溶解度分別提高了393.71%和341.99%；與單步固態(tài)發(fā)酵相比，其小肽質(zhì)量分數(shù)和蛋白溶解度分別提高了79.64%和78.16%。酶解后，菜粕中大部分大分子蛋白降解為小分子蛋白(<4.6 kDa)，有效改善了菜粕蛋白的品質(zhì)，提高了菜粕的應(yīng)用價值。