暨迪軍,劉明珠,李成思,盧永昌

（1.青海民族大學藥學院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室，青海 西寧 810007；3.青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術中心，青海 西寧 810007）

銀葉菊原產(chǎn)于地中海沿岸，為菊科千里光屬的多年生草本植物[1]，含有大量的黃酮類化合物，且有抗炎、抗菌及抗病毒的功效[2]，還具有預防癌癥、抗衰老、增強機體免疫力以及降低心血管疾病等藥理活性[3]。目前對于銀葉菊中總黃酮的測定未見報道。本研究以蘆丁為標準品，通過紫外分光光度法測定銀葉菊中總黃酮的含量，為銀葉菊的化學成分及其質量控制的進一步研究提供科學依據(jù)。

1 原料、儀器與試劑

1.1 原料

試驗藥材：銀葉菊，2016年8月采自青海省玉樹州，由青海民族大學林鵬程教授鑒定為銀葉菊（Senecio cineraria）。

1.2 儀器

AL 204 型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；TU-1810 紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；KQ-300B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司) ；DFY-200C 粉碎機(上海谷寧實業(yè)有限公司)。

1.3 試劑

蘆丁標準品（批號：20040412，上海潤捷化學試劑有限公司）；甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

2 實驗方法與結果

2.1 樣品的處理

取銀葉菊，曬干粉碎后過80 目篩備用。

2.2 樣品溶液的制備

稱取銀葉菊粉末1.0 g，在55 ℃下用25 mL 50%甲醇超聲55 min，并將提取液定容于50 mL 容量瓶中。

2.3 對照品溶液的配制

稱取蘆丁對照品，加適量甲醇溶液超聲溶解，冷卻后移入容量瓶，并用甲醇溶液定容。

2.4 紫外分光光度法測定銀葉菊總黃酮顯色方法

實驗采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 體系吸光光度法。取10 mL 容量瓶，加入樣品溶液1 mL，加適量甲醇，再加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min 后加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液；靜置6 min 后加入2.5 mL 10%氫氧化鈉顯色液，搖勻，用甲醇溶液定容。靜置20 min 后測其吸光度。參比溶液為試劑空白液，檢測波長為510 nm。

以下過程按此方法進行。

2.5 標準曲線的繪制

吸取0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL 蘆丁對照品分別置于6 只10 mL 容量瓶中，測定吸光度。以蘆丁濃度C與吸光度A的標準曲線，得到線性回歸方程式為：A=6.721C+0.008,R=0.999 8，線性范圍0.03 ～ 0.15 mg。

2.6 銀葉菊總黃酮的提取及提取率測定

稱取銀葉菊干粉1.0 g，加入25 mL 錐形瓶中，測其吸光度。根據(jù)公式C=(A-0.0008)÷6.721×50×10÷1000 計算樣品的總黃酮濃度。

3 結果與分析

以單因素試驗為基礎，選擇甲醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為影響因素，采用選擇L9(34)正交試驗[4]，確定最佳提取工藝，因素水平見表1，試驗分析結果見表2。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗結果直觀分析表

由表2分析可得：提取溫度對總黃酮提取率的影響最大，其次是料液比，然后是甲醇濃度，影響程度最低的是提取時間。銀葉菊中總黃酮含量最佳提取條件為用45%甲醇在55 ℃溫度下用1∶25的料液比每次提取45 min。

分別稱取5 份銀葉菊樣品，采用確定的最佳提取工藝，得出銀葉菊中總黃酮含量平均值為2.09%±0.66%。說明確定的提取條件較優(yōu)。

4 方法學驗證

4.1 精密度實驗

取6 個10 mL 容量瓶，移入定容后的提取液，靜置20 min后測量，計算得RSD值為1.16%。

4.2 加標回收率實驗

在已經(jīng)測定出含量的6份銀葉菊總黃酮提取液中，分別加入2 mL 蘆丁配置好的對照品，測定并計算平均回收率結果為99.25%，RSD值為1.27%，以此說明測定銀葉菊總黃酮含量用該方法是可行的。

4.3 穩(wěn)定性實驗

移液管吸取2 mL 銀葉菊提取液，初次顯色后放置15 min 后，待檢測器系統(tǒng)穩(wěn)定后測定吸光度。每間隔1 h 后，測定一次黃酮提取液吸光度，實驗結果證實吸光度在5 h 內(nèi)無明顯變化，表明該顯色反應溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

5 實驗結果與討論

實驗結果顯示銀葉菊總黃酮含量在55 ℃下用45%甲醇在1∶25 的料液比中超聲55 min 時有最大值2.10%。

本實驗采用紫外分光度法對銀葉菊中總黃酮含量進行了測定，經(jīng)過方法學驗證證實該方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。