馬 爽，何冬梅，林 鏗，馬 翔

(1.廣州市花都區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東廣州510800；2.廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州511430；3.廣州花都人愛醫(yī)院，廣東廣州 510800)

致瀉性大腸埃希菌包括產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(STEC)，侵襲性大腸埃希菌(EIEC)，產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)，腸致病性大腸埃希菌(EPEC)和腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)。其中，STEC能導(dǎo)致血性腹瀉、出血性腸炎，甚至嚴(yán)重的溶血性尿毒癥綜合征(HUS)，國內(nèi)外已有報(bào)道[1-3]。但是，大腸埃希菌O157:H7為典型的大腸埃希菌特征，常規(guī)方法不能識(shí)別出來。筆者觀察到糞便標(biāo)本中的多數(shù)大腸埃希菌的MUG和山梨醇陽性，而大腸埃希菌O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株的MUG和山梨醇均陰性。為此，通過對大腸埃希菌的MUG和山梨醇2項(xiàng)試驗(yàn)的單獨(dú)和聯(lián)合試驗(yàn)的結(jié)果分析，探討大腸埃希菌O157:H7鑒定的實(shí)用方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1培養(yǎng)基 哥倫比亞血平板、麥康凱平板、山梨醇麥康凱平板購自廣州市迪景微生物科技有限公司，大腸埃希菌O157顯色平板購自法國科瑪嘉公司。診斷血清：大腸埃希菌診斷血清購自丹麥國家血清研究院。OK O Pool 1血清(內(nèi)含O157血清型)批號(hào)：P1Q1-2H1，有效期2021-07-30； O157單價(jià)血清批號(hào)：O157 K1-1H2，效期2020-01-03；H7單價(jià)血清批號(hào)：H7E1-H15，效期至2021-06-06，均在有效期內(nèi)。

1.1.2生化管 MUG和山梨醇生化管購自杭州濱河微生物試劑有限公司，均在有效期內(nèi)。

1.1.3試驗(yàn)菌株 大腸埃希菌O157:H7(ATCC 43888)、大腸埃希菌O157:H7(NCTC 12900)、大腸埃希菌O157:H7(衛(wèi)生部室間質(zhì)評菌株1708)3株標(biāo)準(zhǔn)菌株以及大腸埃希菌ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EPEC O111、EAEC各1株，均為本室收藏質(zhì)控菌株。

1.1.4臨床菌株 2018年4月至2019年2月廣州市花都區(qū)餐飲從業(yè)人員糞便(肛拭子)中隨機(jī)檢出的大腸埃希菌357株。

1.2儀器與試劑 ATB半自動(dòng)微生物儀及32E鑒定條和吲哚試劑、VITEK 2-compact全自動(dòng)微生物儀及革蘭陰性菌鑒定卡(GN卡)，法國生物梅里埃公司生產(chǎn)，鑒定條、鑒定卡及試劑均在有效期內(nèi)。基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(VITEK MS)，法國梅里埃公司生產(chǎn)。DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。ZF-80型暗箱四用紫外線分析儀，上海嘉鵬科技有限公司生產(chǎn)。

1.3方法 通過實(shí)驗(yàn)菌株的菌落特征、MUG和山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果以及自動(dòng)化儀器鑒定、血清學(xué)試驗(yàn)鑒定大腸埃希菌O157:H7，找出該菌的鑒定特征。用哥倫比亞血平板復(fù)蘇大腸埃希菌O157:H7、ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EPEC O111、EAEC六種菌，同時(shí)接種MUG和山梨醇生化管，并劃線接種麥康凱平板、山梨醇麥康凱平板、大腸埃希菌O157顯色平板觀察菌落特征，并做玻片法血清學(xué)凝集試驗(yàn)。健康體檢人員的糞便拭子劃線接種山梨醇麥康凱平板，35 ℃孵育18～24 h，挑選無色透明(山梨醇陰性)、紅色(山梨醇陽性)菌落轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板經(jīng)35 ℃孵育18～24 h，取革蘭陰性、氧化酶陰性的培養(yǎng)物，用ATB進(jìn)行生化鑒定，鑒定出的大腸埃希菌(選擇好的或者極好的鑒定菌株)接種MUG和山梨醇生化管。對MUG陰性或山梨醇陰性以及2項(xiàng)試驗(yàn)均陰性的大腸埃希菌劃線接種麥康凱平板、大腸埃希菌O157顯色平板，觀察菌落特征并做玻片法血清凝集試驗(yàn)。對3株大腸埃希菌O157:H7及ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EPEC O111、EAEC共8株菌全部用ATB半自動(dòng)微生物儀、VITEK 2-compact、VITEK MS鑒定。對糞便中檢出的MUG和山梨醇2項(xiàng)試驗(yàn)均陰性的大腸埃希菌(已經(jīng)ATB半自動(dòng)微生物儀鑒定)，再用VITEK 2-compact鑒定。過夜的MUG培養(yǎng)液在紫外線下觀察熒光，陽性菌株為藍(lán)綠色熒光；山梨醇發(fā)酵，培養(yǎng)基由紫變黃。每批試驗(yàn)用大腸埃希菌ATCC 25922做陽性對比，大腸埃希菌O157:H7做陰性對比。用3株大腸埃希菌O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株和1株大腸埃希菌ATCC 25922標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控實(shí)驗(yàn)條件。

2 結(jié) 果

質(zhì)控菌株的MUG和山梨醇以及血清學(xué)試驗(yàn)質(zhì)量控制合格，3株大腸埃希菌O157:H7的MUG和山梨醇均陰性、與大腸埃希菌O157多價(jià)、O157單價(jià)及H7單價(jià)血清凝集。其他的大腸埃希菌結(jié)果明確。MUG和山梨醇試驗(yàn)及大腸埃希菌O157:H7血清學(xué)試驗(yàn)的質(zhì)量控制結(jié)果如下。MUG(+)山梨醇(+)：大腸埃希菌ATCC 25922；MUG(-)山梨醇(-)為O157:H7 ATCC 43888、O157:H7 NCTC 12900、O157:H7衛(wèi)生部質(zhì)評菌1807；O157:H7血清學(xué)(+)為O157:H7 ATCC 43888、O157:H7 NCTC 12900、O157:H7衛(wèi)生部質(zhì)評菌1807; O157:H7血清學(xué)(-)為大腸埃希菌ATCC 25922。

3株大腸埃希菌O157:H7菌在麥康凱平板上為紅色菌落(乳糖陽性)，在山梨醇麥康凱平板上為無色透明菌落(山梨醇陰性)，在大腸埃希菌O157顯色平板為紫紅色菌落，見圖1。EPEC O111發(fā)酵乳糖，不發(fā)酵山梨醇，在麥康凱平板和山梨醇麥康凱平板上的菌落特征與大腸埃希菌O157:H7相似，但在O157顯色平板上的綠色菌落可區(qū)別；ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EAEC因發(fā)酵乳糖和山梨醇，在麥康凱平板和山梨醇麥康凱平板上均為紅色菌落，在大腸埃希菌O157顯色平板為藍(lán)色、綠色菌落，這些大腸埃希菌的菌落特征相同，見表1。

圖1 大腸埃希菌O157:H7菌落及菌體特征

表1 大腸埃希菌O157:H7及其他大腸埃希菌的表型特征

三株大腸埃希菌O157:H7的MUG和山梨醇試驗(yàn)均陰性；EPEC O111的MUG陽性，山梨醇陰性；其他的菌株2項(xiàng)試驗(yàn)均陽性，見圖2，圖3；山梨醇試驗(yàn)結(jié)果與山梨醇麥康凱平板菌落特征吻合。

試驗(yàn)的菌株中，3株大腸埃希菌O157:H7均與大腸埃希菌O157、大腸埃希菌H7血清凝集，其他的5株大腸埃希菌血清學(xué)試驗(yàn)陰性。

三株大腸埃希菌O157:H7經(jīng)ATB半自動(dòng)微生物儀鑒定為大腸埃希菌(好的或者極好的鑒定)，VITEK MS鑒定也是大腸埃希菌，因此，這兩種儀器均不能明確鑒定大腸埃希菌O157:H7。但是VITEK 2-compact鑒定為大腸埃希菌O157，提示高致病微生物，需進(jìn)行血清學(xué)確認(rèn)。其他5株大腸埃希菌均被3種自動(dòng)化儀器鑒定為大腸埃希菌。

圖2 普通大腸埃希菌和致瀉大腸埃希菌的MUG試驗(yàn)

糞便中的357株大腸埃希菌經(jīng)ATB半自動(dòng)微生物儀鑒定，均為好的或極好的鑒定。山梨醇試驗(yàn)結(jié)果與山梨醇麥康凱平板上的菌落特征吻合，MUG和山梨醇試驗(yàn)結(jié)果及在這幾種平板上的菌落特征見表2。此外，篩選出的MUG陰性或山梨醇陰性及2項(xiàng)試驗(yàn)均陰性的95株大腸埃希菌與O157血清不發(fā)生凝集，從健康體檢者糞便中沒有檢出大腸埃希菌O157:H7。

圖3 普通大腸埃希菌和和致瀉大腸埃希菌的山梨醇試驗(yàn)

表2 357株健康體檢者糞便大腸埃希菌的表型特征

3 討 論

大腸埃希菌O157:H7的MUG陰性，山梨醇陰性[1,3-5]，有兩個(gè)血清型，85%為O157:H7(有動(dòng)力)，12%為O157:HNM(無動(dòng)力)，3%是H7以外的H型。由于臨床微生物室通常不將其作為目的菌，且此菌在麥康凱平板上是紅色菌落，可能作為非致病菌排除。

來自糞便中的357株大腸埃希菌，未檢出O157:H7，可能與健康人群帶菌率低有關(guān)。雖然，根據(jù)MUG或山梨醇單一試驗(yàn)可以篩查O157[6-8],但有較高的假陽性，因MUG和山梨醇均陰性的大腸埃希菌只有2.2%，故選擇“雙陰”菌株作進(jìn)一步鑒定，特別在大批量標(biāo)本篩查時(shí)省時(shí)省力、且節(jié)省血清。單獨(dú)的山梨醇麥康凱平板、大腸埃希菌O157顯色平板篩查不及MUG和山梨醇2項(xiàng)試驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用[9-12]，使用VITEK 2-compact成本昂貴，不適合大批量篩查。

大腸埃希菌O157:H7的MUG和山梨醇均陰性，直接用于可疑菌篩查簡便易行，此特征是其他的致瀉性大腸埃希菌所沒有的，在各種致瀉性大腸埃希菌篩查中有明確的鑒別作用。有報(bào)道極少的MUG陽性的大腸埃希菌O157菌株檢出[5]，此種情況下表型特征不適合其鑒別。此外，應(yīng)注意糞便中常見的摩根摩根菌MUG和山梨醇均陰性，少見的蜂房哈夫尼亞菌也是陰性。糞便中的銅綠假單胞菌(常見)和惡臭假單胞菌的MUG陽性(這2種菌自身也產(chǎn)生熒光)，二者都不發(fā)酵山梨醇。

MUG快速法可在4 h出結(jié)果，應(yīng)注意陰性的大腸埃希菌在延長培養(yǎng)后陽性。不要盲目加快速度，對可疑菌株延長觀察時(shí)間，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確。

大腸埃希菌O157:H7在O157顯色平板上為紫紅色菌落，著色明顯，而非大腸埃希菌O157:H7的菌落為藍(lán)色、綠色，有良好篩查作用,其平板成本較高。來自糞便的357株大腸埃希菌在O157顯色平板上為藍(lán)色、綠色菌落。同時(shí)應(yīng)排除其他細(xì)菌在O157顯色平板上的紫紅色菌落[13]。此外，筆者在試驗(yàn)中觀察到沙門菌屬中的某些血清型，如腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌在O157顯色平板上也是紫紅色菌落，需引起重視。大腸埃希菌O157:H7在山梨醇麥康凱平板上為無色透明菌落，且價(jià)廉，與MUG組合篩查為佳。麥康凱平板及ATB 半自動(dòng)微生物儀和VITEK MS均不適合大腸埃希菌O157:H7的篩查。

MUG和山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)簡便易行，成本低廉，不受試驗(yàn)條件限制，適合各級實(shí)驗(yàn)室；山梨醇麥康凱平板及大腸埃希菌O157顯色平板也有較好的篩查作用。VITEK 2-compact能明確篩查大腸埃希菌O157，并提示為高致病微生物，但是成本昂貴，不適合大批量標(biāo)本的篩查，可用于篩查出菌株的補(bǔ)充鑒定。對篩查出的菌株必須用血清學(xué)試驗(yàn)鑒定。包括無動(dòng)力或H7抗原陰性的菌株應(yīng)送上級實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行毒素或毒素基因的檢測和確認(rèn)。

通過分析大腸埃希菌O157:H7三株標(biāo)準(zhǔn)菌株以及ATCC 25922、EIEC O143、ETEC、EPEC O111、EAEC、臨床標(biāo)本中的大腸埃希菌在VITEK 2-compact GN卡中的48項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中的山梨醇和β-葡萄糖醛酸酶2項(xiàng)試驗(yàn)是區(qū)別大腸埃希菌O157與其他大腸埃希菌的關(guān)鍵特征，而MUG可以鑒定產(chǎn)β-葡萄糖醛酸酶的細(xì)菌[14]。因此，MUG和山梨醇試驗(yàn)作為鑒定大腸埃希菌O157:H7的首選試驗(yàn)。

MUG和山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用，對大腸埃希菌O157:H7有較高的篩查準(zhǔn)確率，效果優(yōu)于其他方法，但必須經(jīng)血清學(xué)鑒定。