康佳，趙志軍，李剛，茆永娟，楊紅，周云花，潘亞菲，賈偉

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川750004；3.寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750004)

人體腸道是致病菌的天然儲(chǔ)存庫(kù)，攜帶碳青霉烯酶編碼基因菌株易導(dǎo)致耐藥基因在腸道細(xì)菌之間傳遞[1]，使耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)腸道定植越來(lái)越普遍。研究表明，CRE定植會(huì)增加患者感染CRE的風(fēng)險(xiǎn)，造成患者死亡率升高[2]。因此，對(duì)于入院患者，尤其是重癥患者進(jìn)行腸道定植CRE篩查尤為重要。目前，國(guó)際上對(duì)CRE的篩查方法尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，主要有美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)推薦的肉湯增菌法、商品化顯色培養(yǎng)基、PCR方法等，但以上方法仍存在操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高等問題。因此，有必要建立一種敏感性和特異性高、操作簡(jiǎn)便且適合推廣使用的腸道定植CRE篩查方法。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在麥康凱培養(yǎng)基中分別加入3種不同碳青霉烯類藥物制成改良平板，用CRE菌株和非CRE菌株檢測(cè)其敏感性、特異性和最低檢測(cè)限；通過(guò)臨床糞便樣本驗(yàn)證平板篩查性能，并與肉湯增菌法及CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2019年1—12月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床連續(xù)分離45株CRE菌株(包括肺炎克雷伯菌21株、大腸埃希菌12株、陰溝腸桿菌10株、產(chǎn)酸克雷伯菌1株和弗勞地檸檬酸桿菌1株)和30株非CRE菌株(包括肺炎克雷伯菌12株、大腸埃希菌10株、陰溝腸桿菌8株)，其中收集于2019年6—12月的20株CRE(包括肺炎克雷伯菌10株、大腸埃希菌4株、陰溝腸桿菌6株)用于最低檢測(cè)限評(píng)估。同時(shí)收集2019年11—12月重癥監(jiān)護(hù)室患者非重復(fù)糞便樣本142份。CRE判定標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)美國(guó)CDC發(fā)布的CRE指南[3]，亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)≥4 μg/mL和(或)厄他培南MIC≥2 μg/mL(微量肉湯稀釋法)。經(jīng)測(cè)序證實(shí)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌臨床分離菌為寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心保存，大腸埃希菌ATCC 25922購(gòu)自北京百歐博偉生物技術(shù)公司。

1.2主要試劑與儀器 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DL 2000 DNA marker(TaKaRa公司)；瓊脂糖(西班牙BIOWEST公司)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基干粉、M-H(B)培養(yǎng)基干粉(北京索萊寶公司)；亞胺培南藥粉、美羅培南藥粉、厄他培南藥粉(>95%BR，大連美侖公司)；胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、10 μg美羅培南藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)；CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉公司)；M-H固體培養(yǎng)基(鄭州安圖生物公司)；一次性培養(yǎng)皿(浙江拱東公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海力申公司)；Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及配套AST-GN04藥敏卡、MALDI-TOF MS儀、麥?zhǔn)媳葷醿x(法國(guó)生物梅里埃公司)；PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3PCR法檢測(cè)耐藥基因 煮沸法提取DNA，采用PCR法檢測(cè)CRE相關(guān)耐藥基因(TEM、SHV、NDM、KPC、OXA-48、VIM、IMP)，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[4]。反應(yīng)體系50 μL：Premix TaqTM25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水 22 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55～57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。引物序列及退火溫度見表1。引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序均由上海生工生物工程公司完成，測(cè)序結(jié)果與GenBank中原序列進(jìn)行比對(duì)鑒定。

表1 耐藥基因引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和退火溫度

1.4改良麥康凱平板、CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)平板的制備及結(jié)果判讀 分別稱取3.3 g CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基干粉及51.5 g麥康凱瓊脂干粉，各溶解于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min。待培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃時(shí)，向CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基中加入0.4 g增補(bǔ)劑(試劑自帶)，同時(shí)依據(jù)CLSI M100第30版[5]腸桿菌科關(guān)于各藥物耐藥的MIC折點(diǎn)，向麥康凱培養(yǎng)基中分別加入3種碳青霉烯類藥物(終濃度為亞胺培南4 μg/mL、美羅培南4 μg/mL、厄他培南2 μg/mL)。輕輕搖動(dòng)錐形瓶，混勻后立即傾注25 mL至90 mm平皿中，凝固后備用。標(biāo)本接種于改良麥康凱平板35 ℃培養(yǎng)16～18 h后菌落經(jīng)Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)及配套AST-GN04藥敏卡鑒定為腸桿菌科細(xì)菌且亞胺培南或美羅培南MIC≥4 μg/mL和(或)厄他培南MIC≥2 μg/mL則判定為CRE[3]。標(biāo)本接種CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基35 ℃培養(yǎng)16～18 h后菌落呈暗粉紅色到紅色菌落為碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌，菌落呈深藍(lán)色則為碳青霉烯類耐藥克雷伯菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌。

1.5肉湯增菌法 根據(jù)CRE指南[3]，制備100 μL糞便懸液(每毫升生理鹽水約0.5 g糞便)，將其加入含有一片10 μg美羅培南藥敏紙片的5 mL TSB培養(yǎng)基中。置于35 ℃培養(yǎng)16～18 h后吸取100 μL培養(yǎng)液移種至普通麥康凱平板上，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取乳糖發(fā)酵的菌落用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀及配套AST-GN04藥敏卡進(jìn)行菌株鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)。

1.6微量肉湯稀釋法 根據(jù)藥物的理化性質(zhì)及使用說(shuō)明將亞胺培南和美羅培南分別配制成終濃度為2 560 μg/mL的藥物儲(chǔ)存液，在96孔板中連續(xù)倍比稀釋后得到一系列100 μL藥物梯度稀釋液(藥物濃度范圍為0.125～256 μg/mL)。將待測(cè)菌經(jīng)M-H瓊脂平板35 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，稀?00倍后取100 μL菌懸液分別接種于含100 μL藥物的小孔中。陰性對(duì)照孔加入200 μL菌懸液，空白對(duì)照孔加入200 μL M-H肉湯培養(yǎng)基。將接種好的96孔板置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h后觀察細(xì)菌，將菌體生長(zhǎng)量約80%被抑制判為終點(diǎn)孔。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922，結(jié)果解釋參照CLSI文件[5]。

1.7敏感性與特異性檢測(cè) 菌株經(jīng)血平板復(fù)蘇后，分別接種于3種不同抗菌藥物的改良麥康凱平板，置于35 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察是否長(zhǎng)出菌落。經(jīng)測(cè)序證實(shí)產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌為陽(yáng)性質(zhì)控，大腸埃希菌ATCC 25922為陰性質(zhì)控。

1.8最低檢測(cè)限的評(píng)估 選取20株CRE臨床菌株經(jīng)接種血平板復(fù)蘇后，用生理鹽水配置成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝痪鷳乙?，并進(jìn)行101～106倍比稀釋，制成102～108CFU/mL菌懸液，取不同濃度的菌懸液10 μL分別接種于3種不同抗菌藥物的改良麥康凱平板，置35 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察是否長(zhǎng)出菌落，所有菌株重復(fù)檢測(cè)3次。

1.9臨床樣本的性能驗(yàn)證 將142份糞便樣本分別用肉湯增菌法、CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基以及改良麥康凱平板3種方法接種，置于35 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察是否生長(zhǎng)菌落。將長(zhǎng)出的菌落分離純化后用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行菌株鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，并用MALDI-TOF MS及微量肉湯稀釋法復(fù)核最終結(jié)果。藥敏試驗(yàn)操作方法及結(jié)果解釋參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 26.0軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)表示，方法間篩查結(jié)果的一致性采用Kappa一致性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PCR結(jié)果 45株CRE中僅檢出1種耐藥基因15株，檢出2種耐藥基因25株，另外5株檢出3種耐藥基因。TEM、SHV檢出率分別為62.22%(28/45)和24.44%(11/45)，NDM、KPC、OXA-48的檢出率分別為62.22%(28/45)、15.56%(7/45)和13.33%(6/45)，未檢出IMP及VIM。見表2。

表2 45株CRE的耐藥基因結(jié)果

2.2改良麥康凱平板檢測(cè)CRE的敏感性及特異性 45株CRE中，亞胺培南改良麥康凱平板上有1株攜帶blaTEM大腸埃希菌未生長(zhǎng)；美羅培南改良麥康凱平板上有2株未生長(zhǎng)，分別為攜帶blaTEM大腸埃希菌和blaKPC肺炎克雷伯菌；45株CRE均在厄他培南改良麥康凱平板上生長(zhǎng)。30株非CRE菌株，除2株肺炎克雷伯菌在厄他培南改良麥康凱平板上生長(zhǎng)外，其余菌株均不生長(zhǎng)。亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良麥康凱平板分別檢出44株、43株和45株CRE，敏感性分別為97.78%(44/45)、95.56%(43/45)和100%(45/45)；亞胺培南與美羅培南改良平板特異性均為100%(30/30)，厄他培南為93.33%(28/30)；美羅培南與亞胺培南改良平板陽(yáng)性預(yù)測(cè)值一致，為100%，厄他培南為95.74%；陰性預(yù)測(cè)值由高到低分別為厄他培南改良平板(100%)、亞胺培南改良平板(96.77%)和美羅培南改良平板(93.75%)。

2.3改良麥康凱平板最低檢測(cè)限評(píng)估 20株CRE中，接種菌液濃度為108CFU/mL時(shí)，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有14株、13株、20株生長(zhǎng)，檢出率分別為70%(14/20)、65%(13/20)和100%(20/20)；接種菌液濃度為107CFU/mL時(shí)，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有11株、10株、20株生長(zhǎng)，檢出率分別為55%(11/20)、50%(10/20)和100%(20/20)；接種菌液濃度為106CFU/mL時(shí)，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有8株、7株、20株生長(zhǎng)，檢出率分別為40%(8/20)、35%(7/20)和100%(20/20)；接種菌液濃度為105CFU/mL時(shí)，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有3株、5株、19株生長(zhǎng)，檢出率分別為15%(3/20)、25%(5/20)和95%(19/20)；接種菌液濃度為104CFU/mL時(shí)，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有2株、2株、19株生長(zhǎng)，檢出率分別為10%(2/20)、10%(2/20)和95%(19/20)。見表3。

表3 3種改良麥康凱平板最低檢測(cè)限評(píng)估

2.43種方法從糞便中篩查CRE能力的比較 經(jīng)確認(rèn)，142份糞便樣本中，共有5株CRE，包括4株大腸埃希菌及1株肺炎克雷伯菌。肉湯增菌法共檢測(cè)出7株菌，其中包括5株CRE(大腸埃希菌4株，肺炎克雷伯菌1株)及2株非CRE(碳青霉烯類敏感的大腸埃希菌和惡臭假單胞菌各1株)；CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基檢測(cè)出5株CRE(大腸埃希菌4株，肺炎克雷伯菌1株)和1株惡臭假單胞菌；亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良麥康凱培養(yǎng)分別檢出3株CRE(大腸埃希菌)、2株CRE(大腸埃希菌)、4株CRE(大腸埃希菌3株，肺炎克雷伯菌1株)，均未檢出非CRE菌株。

肉湯增菌法與CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基篩查結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，Kappa=0.919)；3種改良麥康凱平板與肉湯增菌法篩查結(jié)果均一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，厄他培南改良麥康凱平板與其一致性(Kappa=0.717)高于亞胺培南(Kappa=0.588)與美羅培南(Kappa=0.563)；3種改良麥康凱平板與CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基篩查結(jié)果均一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，厄他培南改良麥康凱平板與其一致性(Kappa=0.885)大于亞胺培南(Kappa=0.657)及美羅培南(Kappa=0.489)。

3 討論

本研究建立一種基于改良麥康凱平板的快速篩查CRE的方法，同時(shí)利用臨床菌株及糞便樣本評(píng)價(jià)其檢測(cè)性能。結(jié)果顯示，亞胺培南、美羅培南和厄他培南改良平板特異性分別為100%、100%和93.33%，敏感性分別為97.78%、95.56%和100%。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)4株僅檢測(cè)出blaTEM的大腸埃希菌中有1株未在亞胺培南改良麥康凱平板上生長(zhǎng)，其他3株卻可以生長(zhǎng)。目前已報(bào)道的CRE相關(guān)耐藥基因有很多種[6]，而本研究只檢測(cè)了其中7種，該菌株是否攜帶其他耐藥基因或由其他耐藥機(jī)制造成還未可知。有文獻(xiàn)報(bào)道，碳青霉烯酶濃度[7]、亞型及相關(guān)β-內(nèi)酰胺酶基因的表達(dá)差異[8]均會(huì)影響藥物抑菌效果，這可能會(huì)導(dǎo)致攜帶不同耐藥基因的同種菌株在3種藥物改良平板上生長(zhǎng)狀況不同。用20株CRE評(píng)估3種不同藥物改良平板最低檢測(cè)限時(shí)發(fā)現(xiàn)：不同菌株或不同基因型的相同菌株在同種藥物改良平板上生長(zhǎng)的最低檢測(cè)限略有差異，亞胺培南、美羅培南改良麥康凱平板最低檢測(cè)限大多分布在105～108CFU/mL接種水平，而厄他培南改良麥康凱平板最低檢測(cè)限集中分布于102～103CFU/mL。可見，厄他培南改良平板最低檢測(cè)限優(yōu)于亞胺培南及美羅培南改良平板。陳善建等[9]以KPC型CRE為主評(píng)估亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良法國(guó)科瑪嘉尿路顯色培養(yǎng)基最低檢測(cè)限，也發(fā)現(xiàn)厄他培南平板具有更低的檢測(cè)限。Ramachandran等[10]從藥物結(jié)構(gòu)及分子動(dòng)力學(xué)的角度闡釋了這3種碳青霉烯類藥物抑菌效果存在差異的原因，并表明相較于厄他培南，美羅培南和亞胺培南治療細(xì)菌感染效果更好，這也為本實(shí)驗(yàn)中厄他培南改良平板上菌株更易生長(zhǎng)提供了理論依據(jù)。

本研究中的3種碳青霉烯類藥物改良麥康凱平板與肉湯增菌法及CHROMagar KPC培養(yǎng)基在篩查腸道定植CRE方面均具有一致性，尤其以厄他培南平板一致性更好。肉湯增菌法雖為美國(guó)CDC推薦篩查方法，但其操作復(fù)雜、檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不適用于大量篩查。而商品化的CHROMagar KPC培養(yǎng)基由于價(jià)格昂貴，臨床難以大規(guī)模推廣。在現(xiàn)有報(bào)道中，鮮有評(píng)價(jià)自制平板性能并采用臨床標(biāo)本驗(yàn)證，且與肉湯增菌法及商品化方法的結(jié)果進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)后期仍需增加樣本數(shù)量及類型進(jìn)一步驗(yàn)證其篩查性能。