張瑾，姜慧，董欣琦，卞志強(qiáng)

1. 安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230601 2. 清華大學(xué)新興有機(jī)污染物控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084

化學(xué)品污染已引起了嚴(yán)重的環(huán)境問題?；旌衔锸俏廴疚镌诃h(huán)境中存在的普遍規(guī)律，混合物產(chǎn)生的累積毒性與相互作用對環(huán)境中暴露的生物具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因而，化學(xué)混合污染物毒性評估與預(yù)測是環(huán)境化學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1-2]。等效線圖法是一種經(jīng)典的二元混合物聯(lián)合毒性作用的圖形分析方法，可以直觀地反映觀測值是否偏離預(yù)測模型[3-5]。但經(jīng)典等效線圖法只能分析化學(xué)混合物在某個(gè)特殊效應(yīng)水平下(通常為半數(shù)效應(yīng)濃度EC50)的相互作用[6-7]，如王成林等[8]應(yīng)用等效線圖法分析3種咪唑類離子液體和殺菌劑甲霜靈(MET)在半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)水平時(shí)的毒性相互作用，發(fā)現(xiàn)二元混合物體系的相互作用(協(xié)同作用或拮抗作用)隨MET濃度比的變化而變化。

然而，在實(shí)際的環(huán)境體系中，大多數(shù)毒物及其混合物的濃度往往遠(yuǎn)低于50%效應(yīng)的濃度[9]。因此，經(jīng)典等效線圖法在實(shí)際應(yīng)用中受到了限制，需要將等效線圖法進(jìn)行拓展，以適于包括高、低效應(yīng)水平在內(nèi)的多個(gè)效應(yīng)水平下的混合物毒性相互作用評估。Zhang等[10]在評估離子液體和農(nóng)藥間相互作用研究中，將等效線圖法進(jìn)行了拓展，并應(yīng)用于評估多個(gè)效應(yīng)水平下預(yù)測混合毒物的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合物在多個(gè)效應(yīng)水平下表現(xiàn)出不同的作用類型。

離子液體(ionic liquids, ILs)是一種所謂的“綠色”有機(jī)溶劑[11]，根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為咪唑類和吡啶類ILs。近年來，因其具有在常溫下蒸氣壓低、不易燃等優(yōu)良特性，尤其是不揮發(fā)的特性，減少了對空氣的污染，因而被廣泛應(yīng)用于合成、催化和提取等化工領(lǐng)域中[12-15]。然而，正是其廣泛的應(yīng)用和很高的水溶性，進(jìn)入環(huán)境后，ILs很可能會(huì)對水體中生物的生存構(gòu)成很大的威脅[16]。同時(shí)，污染物并不僅僅以其自身原本的形式和濃度存在，在進(jìn)入環(huán)境中后，會(huì)與其他污染物如農(nóng)藥等結(jié)合成各種形式和濃度的混合污染物，進(jìn)而對環(huán)境中的生物甚至人類的生存和健康構(gòu)成更大的風(fēng)險(xiǎn)[17-18]。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道ILs尤其是咪唑類ILs與其他污染物共存時(shí)對水生生物產(chǎn)生很強(qiáng)的聯(lián)合毒性，而關(guān)于吡啶類ILs的研究報(bào)道較少。

因此，本文基于吡啶環(huán)上烷基鏈的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特點(diǎn)，以3種具有不同烷基鏈長的溴代吡啶離子液體：溴化丁基吡啶([bpy]Br)、溴化己基吡啶([hpy]Br)、溴化辛基吡啶([opy]Br)和殺菌劑多果定(Dod)為研究對象，應(yīng)用直接均分射線法設(shè)計(jì)離子液體與農(nóng)藥多果定的二元混合物體系，并應(yīng)用拓展等效線圖法分析在5個(gè)不同的效應(yīng)水平(ECx)下的混合物體系的毒性相互作用情況，與經(jīng)典等效線圖法和濃度加和(concentration addition, CA)模型評估的結(jié)果進(jìn)行比較，研究結(jié)果將為化學(xué)混合物毒性相互作用評估提供方法和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

BioRad酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)、MGC-250型智能型光照培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、BT25S型五位電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)、70SW-CJ-IF超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)、Dragon-lab單道可調(diào)移液器(10～100 μL)、手動(dòng)12道移液器(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)(50～300 μL)和Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

[bpy]Br、[hpy]Br和[opy]Br購自德國Merck公司，多果定(Dod)購自德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司，4種試劑均為優(yōu)級純試劑，其結(jié)構(gòu)式見圖1，其CAS登記號、分子式和分子量等參數(shù)見表1。實(shí)驗(yàn)前均用Milli-Q超純水配制儲(chǔ)備液并保存在棕色瓶中，置于4C冰箱保存待用。

圖1 4種化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式注：Dod表示多果定，[bpy]Br、[hpy]Br和[opy]Br表示 溴化丁基吡啶、溴化己基吡啶和溴化辛基吡啶。Fig. 1 The structures of four chemicals Note: Dod stands for dodine; [bpy]Br, [hpy]Br and [opy]Br stand for bromide butyl pyrimidine, bromide hexyl pyrimidine and bromide oxyl pyrimidine.

1.2 菌種的培養(yǎng)和毒性測試

青?；【?Vibrioqinhaiensissp.-Q67, Q67)購自北京濱松光子技術(shù)股份有限公司，液體培養(yǎng)基配方及菌種培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)[19]，Q67活化和接種方法見文獻(xiàn)[20]。

采用微板毒性分析法(microplate toxicity analysis, MTA)測定每個(gè)化學(xué)毒物以及它們的混合物體系對Q67的發(fā)光抑制毒性[21-22]。每個(gè)組分及其混合物射線均設(shè)計(jì)12個(gè)濃度梯度、3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)24個(gè)空白對照，并重復(fù)3板。每孔試液總體積200 μL，其中菌液100 μL。在酶標(biāo)儀上測定各試液的相對發(fā)光單位(RLU)，依據(jù)空白RLU的平均值(I0)和各濃度梯度3次測量RLU的平均值(I)，計(jì)算出毒物及其混合物體系各濃度梯度的發(fā)光抑制率E：

(1)

1.3 二元混合物設(shè)計(jì)

為了合理地探索整個(gè)濃度空間范圍下二元混合物的毒性變化規(guī)律，采用直線均分射線法(direct equipartition ray design, EquRay)[23]設(shè)計(jì)3個(gè)ILs與農(nóng)藥Dod的3組二元混合物體系(Dod-[bpy]Br、Dod-[hpy]Br、Dod-[opy]Br)，每組混合物體系安排5條射線(R1、R2、R3、R4和R5)。每條射線代表具有一定濃度配比(pi,i=Dod、ILs)的二元混合物射線，實(shí)驗(yàn)中每條射線安排12個(gè)濃度點(diǎn)。EquRay設(shè)計(jì)的3組二元混合物體系的構(gòu)成及其濃度配比見表2。

1.4 濃度效應(yīng)擬合

應(yīng)用MTA法獲得的離子液體和多果定以及它們的二元混合物體系對Q67的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，采用Weibull和Logit函數(shù)進(jìn)行最小二乘擬合，Weibull和Logit如式(2)和(3)所示：

E=1/(1+exp(-α-βlog10(c)))

(2)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(3)

式中α和β分別為位置參數(shù)和斜率參數(shù)，c為毒物濃度。

表1 3種離子液體和農(nóng)藥多果定的基本性質(zhì)、擬合函數(shù)及其統(tǒng)計(jì)量、半數(shù)效應(yīng)濃度及其負(fù)對數(shù)Table 1 Physicochemical properties, fitted functions together with some statistics, the median effective concentration as well as their negative logrithm of three ionic liquids (ILs) and pesticide dozine

注：α和β是擬合參數(shù)，r和RMSE分別表示相關(guān)系數(shù)和均方根誤差。

Note:αandβare two parameters;rand RMSE stand for correlation coefficient and root-mean square error, respectively.

1.5 濃度加和模型

選擇標(biāo)準(zhǔn)加和模型CA為參考模型，比較觀測毒性與CA模型預(yù)測毒性的大小：如果觀測毒性大于、等于或小于CA模型預(yù)測毒性，則認(rèn)為混合物發(fā)生了協(xié)同作用、加和作用或拮抗作用。CA模型公式表達(dá)為[24-25]：

(4)

式中：ci表示混合物效應(yīng)為x時(shí)該混合物中第i個(gè)組分的濃度；ECx,i為第i個(gè)組分的等效應(yīng)濃度；n是混合物中組分?jǐn)?shù)。

1.6 等效線圖法與拓展等效線圖法

等效線圖法[26-27]是用來評估二元混合物相互作用的圖形分析法，在平面直角坐標(biāo)系內(nèi)展現(xiàn)二元混合物在某個(gè)特殊效應(yīng)(50%)時(shí)混合物毒性相互作用情況。在傳統(tǒng)的等效線圖中，僅連接直角坐標(biāo)系二元混合物組分EC50值點(diǎn)，構(gòu)造截距，稱為CA預(yù)測線。根據(jù)CA預(yù)測線位于觀測值的置信區(qū)間內(nèi)、上方或下方，表示二元混合物為加和效應(yīng)還是非加和效應(yīng)。如果CA預(yù)測線在觀測值的置信區(qū)間內(nèi)、上方或下方，則分別稱混合物呈加和作用、拮抗作用或協(xié)同作用。拓展的等效線圖法，不僅連接直角坐標(biāo)系二元混合物組分EC50值點(diǎn)，同時(shí)連接多個(gè)ECx值點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了在多個(gè)效應(yīng)水平下評估二元混合物的毒性相互作用。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 3種ILs和多果定對Q67的毒性

通過MTA法測得的3種溴代吡啶ILs和農(nóng)藥Dod在12 h對Q67的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)及Weibull函數(shù)和Logit函數(shù)擬合結(jié)果列于表1中，實(shí)驗(yàn)觀測的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)及其擬合的濃度-效應(yīng)曲線(CRCs)見圖2。表1顯示，Weibull函數(shù)和Logit函數(shù)都能較好地表征4種化合物的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)(r≥0.9971, RMSE≤0.036)。以半數(shù)效應(yīng)濃度的負(fù)對數(shù)(-lgEC50即pEC50)作為毒性指標(biāo)，4種毒物對Q67的毒性順序?yàn)镈od>[opy]Br>[hpy]Br>[bpy]Br。Dod的毒性大于離子液體的毒性，同時(shí)3種離子液體對Q67的毒性都具有烷基鏈效應(yīng)[28]，即其毒性隨烷基鏈上碳原子數(shù)的增加而增加，則ILs的pEC50值幾乎增加1，文獻(xiàn)也報(bào)道了類似的結(jié)果[29-30]。從化學(xué)物的作用機(jī)制分析，多果定屬于胍類殺菌劑，溶于水后會(huì)帶正電荷，吸附于帶負(fù)電荷的微生物表面，并滲透到微生物體內(nèi)，聚合形成的薄膜堵塞微生物呼吸道通道，使微生物迅速窒息死亡[31]。發(fā)光菌Q67作為直接靶細(xì)菌，被多果定迅速鎖定并殺死。這可能是多果定的毒性大于其他3種離子液體的原因。

圖2 3種離子液體和多果定的濃度-效應(yīng)曲線(CRCs)注：圖中分散的點(diǎn)表示實(shí)驗(yàn)觀測值，實(shí)線表示擬合線。Fig. 2 The concentration-response curves of three ionic liquids and dodine Note: The scattered points and solid lines in diagram represent the observed values and fitted lines, respectively.

圖2顯示4種化學(xué)物質(zhì)對Q67的CRCs曲線呈經(jīng)典的S形，相互之間幾乎是平行的，表明4種化學(xué)物質(zhì)對Q67的毒性響應(yīng)隨濃度變化的規(guī)律相似。

2.2 Dod-ILs混合物體系對Q67的毒性

3組多果定與ILs的二元混合物體系(Dod-[bpy]Br, Dod-[hpy]Br, Dod-[opy]Br)共15條射線對Q67的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)擬合結(jié)果見表2，擬合的15條射線的CRC曲線以及實(shí)驗(yàn)觀測值繪于圖3中。從表2中可看出Weibull函數(shù)和Logit函數(shù)能有效擬合3組多果定與ILs二元混合物的濃度-效應(yīng)關(guān)系(r>0.9815, RMSE<0.068)。以pEC50作為毒性指標(biāo)，結(jié)合表2中混合物組分的濃度配比pi值，可看出，隨著混合物組分中pDod值的減小，3組二元混合物體系(R1～R5)的15條射線的pEC50值也隨之逐漸降低，即各組二元混合物的毒性逐漸減小。且兩者呈良好的線性關(guān)系，3組二元混合物體系的pEC50值與pDod的線性擬合關(guān)系方程如下：

Dod-[bpy]Br pEC50=111.21×pDod+2.2

(r=0.9774)

(5)

Dod-[hpy]Br pEC50=17.95×pDod+3.14

(r=0.9729)

(6)

Dod-[opy]Br pEC50=1.02×pDod+4.33

(r=0.7503)

(7)

表2 3組二元混合物的構(gòu)成、組分濃度配比(pi)、擬合函數(shù)及其統(tǒng)計(jì)量、半數(shù)效應(yīng)濃度及其負(fù)對數(shù)Table 2 The composites, concentration ratios (pi), fitted functions together with some statistics, the median effective concentration as well as their negative logrithm of three binary mixture rays

注：pDod和pILs表示多果定和離子液體的濃度比，L和W分別為Logit和Weibull。

Note:pDodandpILsstand for the concentration ratios of dodine and ionic liquids; L and W represent for Logit and Weibull, respectively.

從方程(5)～(7)可看出，混合物體系Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br的pEC50值與Dod的濃度比有很好的正相關(guān)性(r>0.97)，在混合物體系Dod-[opy]Br中，其pEC50值與Dod的濃度比的相關(guān)性稍差，可能是由于[opy]Br的毒性與Dod的毒性較接近的緣故[21,30,32]。

2.3 CA模型對Dod-ILs混合物體系的拮抗作用表征

CA模型能較好地評估大多數(shù)混合物的毒性[22,33-35]。本研究中，CA模型對于3組二元混合物體系中所有15條射線的毒性效應(yīng)的評估預(yù)測結(jié)果也繪于圖3中。從圖3中可知，15條混合物射線的CA預(yù)測線均高于實(shí)驗(yàn)觀測值，說明15條射線均為拮抗作用，但CA預(yù)測線偏離每條混合物射線的程度不同，即拮抗作用程度不同，這可能與混合物體系中各射線組分及其濃度配比的不同有關(guān)[36]，如Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br體系中射線的拮抗作用隨組分濃度配比pDod的減少先逐漸增強(qiáng)然后逐漸減弱，而在Dod-[opy]Br體系中5條射線的拮抗作用隨pDod的增加沒有明顯變化，可能是由于在Dod-[bpy]Br和Dod-[hpy]Br體系中，農(nóng)藥Dod的濃度配比pDod較小，而其毒性遠(yuǎn)大于2個(gè)ILs，而在Dod-[opy]Br體系中，2個(gè)組分的毒性較接近[37-39]。

2.4 等效線圖法對Dod-ILs混合物體系的拮抗作用表征

圖4是等效線圖法對Dod-ILs混合物體系15條射線在50%濃度-效應(yīng)水平時(shí)的毒性相互作用的表征結(jié)果。從圖4中可知，15條射線的等效線圖均位于CA預(yù)測線的上方，這說明在EC50效應(yīng)水平下，混合物間均存在拮抗作用。

2.5 拓展等效線圖法評價(jià)混合物毒性效應(yīng)

圖5是Dod與ILs的3組二元混合物體系在5個(gè)不同效應(yīng)濃度(EC20、EC30、EC40、EC50和EC60)水平下的等效線圖。從圖5可知，3組混合物在5個(gè)效應(yīng)水平線下的等效線均位于對應(yīng)的CA預(yù)測線上方的拮抗區(qū)域，且不對稱。同一混合物體系中，5條射線在同一濃度效應(yīng)水平拮抗作用程度不同，在Dod-[hpy]Br體系中，R4的拮抗作用比其他4條射線的拮抗作用明顯，而其他2個(gè)混合物體系的R4沒有呈現(xiàn)出明顯的變化。與圖3相比，CA模型預(yù)測需要一個(gè)混合物體系的所有射線的CA線、觀測值等必須逐一畫出，比較麻煩，尤其是在同一個(gè)圖內(nèi)不容易展示，更不容易觀察和比較相互作用情況。而拓展等效線圖法不僅能表現(xiàn)出一組混合物體系中全部射線的相互作用類型，且能直觀地分析比較出各射線毒性相互作用的變化情況，簡化了混合物毒性相互作用比較分析的過程。與圖4相比，拓展等效線圖法不僅分析了EC50水平時(shí)毒性相互作用情況，也分析了其他效應(yīng)水平，即拓寬了三組混合物體系拮抗作用評價(jià)的效應(yīng)水平范圍，且與濃度加和(CA)模型評估結(jié)果相似。因此，拓展后的等效線圖法可以用于化學(xué)混合污染物實(shí)際環(huán)境的毒性評價(jià)。

圖3 3組二元混合物體系的濃度-效應(yīng)曲線及其濃度加和模型(CA)預(yù)測值注：●實(shí)驗(yàn)值；—擬合線；﹍CA預(yù)測線。Fig. 3 The concentration-response curves and predicted lines by concentration addition (CA) for three binary mixture systems Note: ● observed data; — fitted line; ﹍ predicted line by CA.

圖4 3組二元混合物體系的等效線圖注：圓圈及連接的線段為各射線等效點(diǎn)及95%觀測置信區(qū)間；實(shí)曲線為擬合等效線；實(shí)直線為CA預(yù)測線。Fig. 4 Isobolograms for three binary mixture systems Note: circle and connected line segment represents equal toxicity point of each ray and 95% observation confidence interval; solid curve represents fitted equal toxicity line; solid line represents CA prediction line.

圖5 3組二元混合物在5個(gè)不同效應(yīng)水平的拓展等效線圖注：R1、R2、R3、R4、R5為混合物混合射線；彩色實(shí)曲線為擬合等效線；彩色實(shí)直線為CA預(yù)測線。Fig. 5 Extended isobolograms at five effect concentration levels (EC20, EC30, EC40, EC50 and EC60) for three binary mixtures Note: R1, R2, R3, R4, R5 represents mixture ray; color solid curve represents fitted equal toxicity line; color solid line represents CA prediction line.

綜上所述：(1)具有不同烷基鏈的3種吡啶類離子液體(ILS)對發(fā)光菌Q67的發(fā)光抑制毒性具有典型的烷基鏈效應(yīng)，且4種毒物對Q67的毒性大小順序?yàn)镈od>[opy]Br>[hpy]Br>[bpy]Br。

(2)3組二元混合物體系均呈明顯的拮抗作用，且混合物射線毒性與Dod組分濃度具有一定的線性關(guān)系。

(3)拓展等效線圖法能較好、直觀地表征3組二元混合物體系的拮抗作用，與傳統(tǒng)等效線圖法相比，拓寬了評估混合物效應(yīng)濃度水平的范圍；與CA模型評估結(jié)果相似，不僅直觀且簡化了混合物毒性相互作用分析過程。