魏雙霞，師尚禮，康文娟，譚諶淼

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

苜蓿為多年生植物，利用年限達5～6年，甚至更長[1]，并且是一種高蛋白植物[1]，富含VA、VE和Fe、Ca等營養(yǎng)物質(zhì)，苜蓿所含蛋白質(zhì)大部分存在于葉片中，含量30%～40%，蛋白質(zhì)的消化率達70%以上，在單位面積上紫花苜蓿比谷類和油料作物能產(chǎn)出更多的蛋白質(zhì)，是發(fā)展優(yōu)質(zhì)高效畜牧業(yè)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是人類有益健康的食用植物之一，而且紫花苜蓿所含氨基酸種類全面，研究表明，紫花苜蓿含有18種以上氨基酸，包括人和動物全部必需的氨基酸和一些稀有氨基酸[3-4]。隨著我國畜牧業(yè)尤其是奶業(yè)的迅速發(fā)展，對苜蓿的需求量日益增加，但其總量供應(yīng)不足，優(yōu)質(zhì)苜蓿尤為缺乏[5]。張鵬[6]、韓學(xué)俊[7]、肖海峻[8]等對苜蓿種質(zhì)材料的氨基酸進行分析，篩選出了氨基酸含量較高的苜蓿品種。因此，從不同角度對我國苜蓿種質(zhì)資源進行深入評價研究，將有助于我國苜蓿種質(zhì)資源的進一步開發(fā)利用。青藏高原素有“世界屋脊”和“世界第三極”之稱[9]，是我國重要的草地畜牧業(yè)基地之一，但過度放牧使天然草地產(chǎn)量下降，毒雜草滋生，牧草品質(zhì)降低[10]。通過對6份參試苜蓿種質(zhì)材料在青藏高原高寒陰濕區(qū)引進種植，進行葉部、莖部氨基酸種類和含量、氨基酸組成、氨基酸評分(AAS)和必需氨基酸指數(shù)分析，評定蛋白品質(zhì)和營養(yǎng)價值，旨在從6個抗寒苜蓿種質(zhì)材料選育出適宜青藏高原種植的蛋白質(zhì)品質(zhì)較高的抗寒苜蓿新材料，為解決青藏高原地區(qū)牧草營養(yǎng)不平衡問題提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗于2013年4月～2015年5月在高寒陰濕區(qū)的甘南州夏河縣牧草試驗站進行。夏河縣位于甘南藏族自治州西北部，E 101°54′～103°25′，N 34°32′～35°34′，地處青藏高原東北邊緣，地勢由西北向東南傾斜，海拔3 000～3 800 m，屬于寒冷濕潤性氣候，土壤類型為高寒草甸土，有明顯的腐殖質(zhì)積聚，腐殖質(zhì)層厚10 cm，呈灰棕至黑褐色粒狀-扁核狀結(jié)構(gòu)，土壤有機質(zhì)含量45.14 g/kg，pH 7.87，速效氮50.83 mg/kg，速效磷10.57 mg/kg，速效鉀230.0 mg/kg，土壤肥力均勻。

1.2 試驗材料

供試材料GNKH-1 (Cold resistance No.1 of alfalfa)、GNKH-2 (Cold resistance No.2 of alfalfa)和GNKH-3(Cold resistance No.3 of alfalfa 3)為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院選育的抗寒苜蓿品系，具有較強的抗寒能力和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)性能。對照材料為抗寒能力強的俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿(M.sativasubsp.varia)(FD 2)、金皇后紫花苜蓿(M.sativacv.Golden Empress)(FD 2)和阿爾岡金紫花苜蓿(M.sativacv.Algonguin)(FD 3)，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室提供。

1.3 試驗設(shè)計

試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積3 m×5 m，3次重復(fù)，采用深開溝，淺覆土，冬前耙平的播種技術(shù)：人工開溝條播，溝深12～15 cm，覆土1～2 cm，冬前耙平埋頸，行距30 cm，播量1.7 g/m2。適時對試驗地進行鋤草及病蟲害防治等田間管理。播種第2年，3個抗寒苜蓿品系返青、分枝、現(xiàn)蕾、開花、結(jié)莢、枯黃各物候期時間較為一致，對照品種俄羅斯西伯利亞雜花，金皇后和阿爾岡金各物候期時間較為一致，但GNKH-3和GNKH-2較其他幾個品種提前10 d進入返青，提前5 d進入現(xiàn)蕾期，各品種均能結(jié)莢，種子均未成熟，第2年刈割測定兩茬，第1年刈割測產(chǎn)1次，測產(chǎn)時，對每個小區(qū)生長狀況良好的苜蓿的莖、葉各采樣1 kg，風(fēng)干混合，3次重復(fù)。

1.4 樣品前處理

樣品在85℃下干燥4 h，磨細混勻，取樣10 mg，精密稱定。置安瓿瓶中，用6 molHCl封管水解[(110±1)℃]24 h，真空抽去過量氯化氫氣體，微量過濾器過濾，濾渣用蒸餾水淋洗3遍，合并濾液，在水浴上蒸干，蒸干后的殘渣加入蒸餾水溶解，并定容至10 mL。每次吸取50 μL注入氨基酸自動分析儀中進行氨基酸測定。測胱氨酸時，需將水解液用過甲酸氧化3 h，再上機分析。

1.5 儀器條件

氨基酸自動分析儀為日立835-50型。除氨柱：L4×50 mm；分析柱：2.6 mm×150.0 mm不銹鋼柱；樹脂：2619號；柱溫：52℃；反應(yīng)溫度98℃；pH 5～5.5；緩沖液流量：0.230 mL/min；柱壓：8～9 MPa；茚三酮流速：0.28 mL/min。

1.6 蛋白質(zhì)氨基酸分析方法

氨基酸含量 100 g草樣中含有的氨基酸的g數(shù)。氨基酸評分 將高寒陰濕區(qū)苜蓿葉、莖中必需氨基酸含量分別與1985年的WHO的必需氨基酸需要量模式[11-17]進行比較，進行氨基酸評分(AAS)，計算公式為：

(1)

必需氨基酸指數(shù) 將葉和莖中蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量與模式蛋白氨基酸[18]進行比較，計算必需氨基酸指數(shù)(EAAI)，計算公式為：

(2)

式中：aai為受試蛋白質(zhì)中某一個必需氨基酸所占必需氨基酸總數(shù)的百分比。AAi是模式蛋白質(zhì)中此氨基酸占必需氨基酸總數(shù)的百分比。必需氨基酸指數(shù)評價蛋白源的營養(yǎng)價值。當n=6～12，提出的實用評價標準是EAAI>0.95為優(yōu)質(zhì)蛋白源，0.85

2 結(jié)果與分析

2.1 葉、莖氨基酸種類和含量特征

供試苜蓿材料中均檢測出了18種氨基酸，包括9種必需氨基酸。供試苜蓿材料各組分氨基酸按含量多少排序有一定的規(guī)律性，含量最高的氨基酸都是天門冬氨酸，含量最低的氨基酸都是胱氨酸和色氨酸，這與王照蘭[19]2004年對苜蓿材料的氨基酸分析得出的結(jié)果相一致。高寒陰濕區(qū)葉部和莖部的脯氨酸含量均比較高，這與陶雅[20]等研究結(jié)果一致，苜蓿在寒冷環(huán)境下會積累Pro等氨基酸以提高苜蓿的抗寒性；而Trp、Arg、Glu和Gly莖含量高寒陰濕區(qū)較低，這可能與苜蓿樣品的采集時間不同和氣候區(qū)環(huán)境不同所造成。

供試苜蓿材料葉部T平均為22.52%，E平均為7.65%，E/T平均為33.95%，E/N平均為51.41%。GNKH-2葉部T最高(23.86%)，顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-3次之(23.57%)，也顯著高于其他4個品種，供試苜蓿材料葉部T排序為：GNKH-2>GNKH-3>俄羅斯西伯利亞雜花>金皇后>GNKH-1>阿爾岡金。金皇后葉部E最高(8.55%)，GNKH-2、GNKH-3次之，它們顯著高于其他3個品種，GNKH-2是抗寒苜蓿新品系中葉部E最高的(8.55%)，較最高的金皇后(8.55%)僅低0.09%，供試苜蓿材料葉部E排序為：金皇后>GNKH-2>GNKH-3>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-1>阿爾岡金(圖1)。葉部E/T均低于雞蛋蛋白(49.7%)模式，但都高于FAO/WHO模式標準蛋白(35.0%)，金皇后葉E/T和E/N最高(39.40%和65.00%)，顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-1是抗寒苜蓿新品系中葉部E/T和E/N最高的(36.97%、58.66%)，較含量最高的金皇后(39.40%和65.00%)低6.15%、9.75%，抗寒苜蓿新品系顯著高于俄羅斯西伯利亞雜花和阿爾岡金，由苜蓿材料葉部的E/T和E/N可知，供試苜蓿材料葉部蛋白品質(zhì)排序為：金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花(圖2)。

圖1 苜蓿材料葉部T和E(%)Fig.1 The T and E in leaf type of alfalfa materials(%)注：Ⅰ- GNKH-1，Ⅱ- GNKH-2，Ⅲ- GNKH-3，Ⅳ-俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿，Ⅴ-金皇后苜蓿，Ⅵ-阿爾岡金苜蓿；E-必需氨基酸總量，N-非必需氨基酸總量，T-氨基酸總量；下同

圖2 苜蓿材料葉部E/T和E/N(%)Fig.2 The E/T and E/N in leaf type of alfalfa materials (%)

綜合分析供試苜蓿材料在高寒陰濕區(qū)的葉部蛋白品質(zhì)表現(xiàn)，GNKH-1、GNKH-3和GNKH-2葉部蛋白品質(zhì)雖然不及金皇后紫花苜蓿，但均顯著高于俄羅斯西伯利亞雜花、阿爾岡金。GNKH-1為適宜高寒陰濕區(qū)的葉部蛋白品質(zhì)最高的抗寒苜蓿新品系，GNKH-3和GNKH-2僅次GNKH-1。

供試苜蓿材料莖部T平均為10.42%，E平均為3.27%，E/T平均為31.31%，E/N平均為45.62%。俄羅斯西伯利亞雜花莖部T最高(12.11%)，顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中莖部T最高的(10.57%)，但較最高的俄羅斯西伯利亞雜花(12.11%)低12.72%，供試苜蓿材料莖部T排序為：俄羅斯西伯利亞雜花>金皇后>GNKH-3>阿爾岡金>GNKH-2>GNKH-1。金皇后莖部E最高(4.30%)，顯著高于其他品種，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系莖部E最高的(3.42%)，較最高的金皇后(4.30%)低20.47%，供試苜蓿材料莖部E排序為：金皇后>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-3>阿爾岡金>GNKH-1>GNKH-2(圖3)。莖E/T均低于雞蛋蛋白(49.7%)模式，只有金皇后高于FAO/WHO模式標準蛋白(35.0%)，金皇后葉E/T和E/N最高(35.95%和56.14%)，顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-1是抗寒苜蓿新品系中莖部E/T和E/N最高的(33.22%、49.75%)，較含量最高的金皇后(35.95%和56.14%)低7.60%、11.38%，抗寒苜蓿新品系顯著高于俄羅斯西伯利亞雜花和阿爾岡金，由供試苜蓿材料莖部的E/T和E/N可知，供試苜蓿材料莖部蛋白品質(zhì)排序為：金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>俄羅斯西伯利亞雜花>阿爾岡金(圖4)。

圖3 苜蓿材料莖部T和E(%)Fig.3 The T and E in stem type of alfalfa materials(%)

圖4 苜蓿材料莖部E/T和E/N(%)Fig.4 The E/T and E/N in stem type of alfalfa materials (%)

綜合分析供試苜蓿材料在高寒陰濕區(qū)的莖部蛋白品質(zhì)表現(xiàn)，GNKH-1、GNKH-3和GNKH-2莖部蛋白品質(zhì)雖然不及金皇后紫花苜蓿，但均顯著高于俄羅斯西伯利亞雜花、阿爾岡金。GNKH-1為適宜高寒陰濕區(qū)的莖部蛋白品質(zhì)最高的抗寒苜蓿新品系，GNKH-3和GNKH-2僅次GNKH-1。

綜上所述，在高寒陰濕區(qū)供試苜蓿材料葉部和莖部的蛋白品質(zhì)表現(xiàn)，GNKH-1僅次于金皇后，為適宜高寒陰濕區(qū)的蛋白品質(zhì)最高的抗寒苜蓿新品系，GNKH-3和GNKH-2僅次GNKH-1。

2.2 葉和莖氨基酸評分

氨基酸評分指測試蛋白中第一限制性氨基酸的得分，一種蛋白質(zhì)的氨基酸評分越接近100，表示其含量越接近人體需要，蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值也越高。將供試苜蓿材料葉部和莖部蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量與1985年WHO必需氨基酸評分模式比較[21]，根據(jù)公式(1)計算AAS。

供試苜蓿材料葉部的蘇氨酸評分最高，蘇氨酸評分排序為：金皇后(127.22)>GNKH-2(123.25)>俄羅斯西伯利亞雜花(122.50)>GNKH-3(122.12)>GNKH-1(110.30)>阿爾岡金(108.55)，金皇后蘇氨酸評分(127.22)顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-2次之。供試苜蓿材料葉部的組氨酸和含硫氨基酸的AAS是最低的，其中金皇后和阿爾岡金葉組氨酸評分最低，分別為33.92、33.05，表明組氨酸是它們的第一限制性氨基酸；GNKH-1、GNKH-2、GNKH-3和俄羅斯西伯利亞雜花葉部含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)評分最低，分別為29.81、32.07、32.74、33.05，表明含硫氨基酸是它們的第一限制性氨基酸。金皇后葉部的AAS是最高的(33.92)，顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中葉部AAS最高的(32.74)，僅比金皇后低3.47%，供試苜蓿材料葉部AAS排序為：金皇后>阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-3>GNKH-2>GNKH-1(圖5)。

綜合分析在高寒陰濕區(qū)供試苜蓿材料葉部的氨基酸評分表現(xiàn)，GNKH-3、GNKH-2和GNKH-1均不及所有對照，但是GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中葉部氨基酸評分最高的。

圖5 苜蓿材料葉部THR-AAS、AASFig.5 The THR-AAS、 AAS in leaf type of alfalfa materials

供試苜蓿材料莖部的蘇氨酸評分也最高，蘇氨酸評分排序為：金皇后(60.00)>俄羅斯西伯利亞雜花(55.56)>阿爾岡金(51.02)>GNKH-3(46.67)>GNKH-1(40.00)>GNKH-2(38.89)，金皇后蘇氨酸評分(60.00)也顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中莖部蘇氨酸的評分最高的。供試苜蓿材料莖部也是組氨酸和含硫氨基酸的AAS是最低的，其中金皇后莖部組氨酸評分最低(20.63)，表明組氨酸是它的第一限制性氨基酸；GNKH-1、GNKH-2、GNKH-3、俄羅斯西伯利亞雜花和阿爾岡金莖部的含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)評分最低，分別為12.94、11.77、16.24、15.88、17.55，表明含硫氨基酸是它們的第一限制性氨基酸。金皇后莖部的AAS最高(20.63)，顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中莖部AAS最高的(16.24)，供試苜蓿材料莖部AAS排序為：金皇后>阿爾岡金>GNKH-3>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-1>GNKH-2(圖6)。

綜合分析在高寒陰濕區(qū)供試苜蓿材料莖部的氨基酸評分表現(xiàn)，GNKH-3、GNKH-2和GNKH-1均不及對照金皇后和阿爾岡金，但是GNKH-3是抗寒苜蓿材料中莖部氨基酸評分最高的。

圖6 苜蓿材料莖部THR-AAS、AASFig.6 The THR-AAS、 AAS in stem type of alfalfa materials

綜上所述，在高寒陰濕區(qū)供試苜蓿材料葉部和莖部的氨基酸評分表現(xiàn)，GNKH-3、GNKH-2和GNKH-1雖然不及對照金皇后和阿爾岡金，但是GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中氨基酸評分最高的。

2.3 必需氨基酸指數(shù)分析

供試苜蓿材料中阿爾岡金葉部的EAAI值最高，為1.2809，顯著高于其他品種(P<0.05)，GNKH-1(1.279 9)次之，也顯著高于其余品種，金皇后最低(1.276 3)，僅低于最高的阿爾岡金0.36% ，供試苜蓿材料葉部的EAAI值大小排序為：阿爾岡金>GNKH-1>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-3>GNKH-2>金皇后。供試苜蓿材料中阿爾岡金莖部的EAAI值也最高，為1.287 8，顯著高于其他品種(P<0.05)，俄羅斯西伯利亞雜花(1.282 2)次之，也顯著高于其余品種，GNKH-2是抗寒苜蓿新品系中莖部EAAI值最高的(1.281 1)，僅低于最高的阿爾岡金0.52% ，GNKH-3最低(1.279 8)，也僅低于最高的阿爾岡金(1.287 8)0.62%，供試苜蓿材料莖部的EAAI值大小排序為：阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-2>金皇后>GNKH-1>GNKH-3(圖7)。

綜上所述，供試苜蓿材料葉部和莖部蛋白均為優(yōu)質(zhì)蛋白。其中，阿爾岡金和GNKH-1葉部EAAI值最高；GNKH-2莖部EAAI值僅次于阿爾岡金和俄羅斯西伯利亞雜花。

圖7 苜蓿材料葉和莖部EAAIFig.7 The EAAI in leaf and stem type of alfalfa materials

3 討論

供試苜蓿材料中的T、E、E/T、E/N含量在高寒陰濕區(qū)的表現(xiàn)均為葉部>莖部，這與姜健[22]在2008年對苜蓿不同部位的氨基酸組成及含量分析得出的結(jié)論一致。供試苜蓿材料在高寒陰濕區(qū)葉部的E/T均高于FAO/WHO模式標準蛋白(35.0%)，這與何金環(huán)[23]測定的苜蓿葉必需氨基酸含量相近，說明供試苜蓿材料中的氨基酸組成平衡，飼用價值價高；在莖部的E/T除了金皇后都低于FAO/WHO模式標準蛋白(35.0%)，與葉部不同，造成原因可能是與不同氣候區(qū)溫度、苜蓿品種和苜蓿不同部位有關(guān)。研究中測定的葉部E/T(35%左右)遠小于鄧蓉[24]測定的苜蓿芽苗的E/T(54%)，表明苜蓿部位不同，氨基酸含量也會不同，苜蓿蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值也不同。研究中供試苜蓿材料中的T、E、E/T、E/N含量在葉部和莖部均低于劉太宇[25]測定的同生育期(分枝期)黃河灘區(qū)苜蓿T、E、E/T、E/N含量，表明苜蓿中的T、E、N、E/T、E/N隨著溫度的降低而降低，與魏小紅等[26]研究的高寒地區(qū)幾種牧草氨基酸含量隨季節(jié)溫度的動態(tài)變化相一致；古世祿[27]也發(fā)現(xiàn)海拔過高，氣候變得冷涼，溫度過低則不適宜谷子氨基酸的合成。

研究中葉部AAS含量均接近于何金玲[28]于2011年測定的苜蓿葉部AAS(30.00)；莖部AAS遠低于30，說明莖部的營養(yǎng)價值不高。EAAI是評價蛋白源的營養(yǎng)價值的最重要的方法之一，筆者得出供試苜蓿材料葉部和莖部均為優(yōu)質(zhì)蛋白，說明這些苜蓿品種都是青藏高原很好的引種牧草品種，這與何金環(huán)用EAAI評價苜蓿葉部為良好蛋白源的結(jié)果一致，也與劉青廣等[29]、張利平等[30]得出的苜蓿材料是營養(yǎng)價值很高的食用材料的結(jié)果也相一致，說明苜蓿葉部蛋白的氨基酸組成平衡性好，與動物體內(nèi)氨基酸的組成擬合程度高，若與組氨酸和含硫氨基酸飼料合理搭配，可作為優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料。

總之，苜蓿作為優(yōu)質(zhì)牧草，不僅可以直接青飼、調(diào)制干草，而且可以用來提取葉蛋白和維生素等，在飼料、食品、保健品和藥物上具有巨大的發(fā)展?jié)摿途薮蟮慕?jīng)濟效益，所以如何提高苜蓿的氨基酸含量繼而提高苜蓿的營養(yǎng)價值有待我們繼續(xù)研究。祝美云等[31]分析微量元素鋅對苜蓿芽氨基酸提高具有一定促進作用；徐智明等[32]發(fā)現(xiàn)氨基酸復(fù)合微肥對苜蓿的營養(yǎng)品質(zhì)也有一定的影響；王俊平等[33]發(fā)現(xiàn)生長調(diào)節(jié)劑DTA-6有效改善了苜蓿草的營養(yǎng)品質(zhì)。苜蓿氨基酸含量測定及品質(zhì)改善方法研究及生長調(diào)節(jié)劑的作用及效果研究等方面將是下一步工作的重點。

4 結(jié)論

(1)由E/T和E/N可知，高寒陰濕區(qū)供試苜蓿材料葉部蛋白品質(zhì)排序為：金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花；供試苜蓿材料莖部蛋白品質(zhì)排序為：金皇后>GNKH-1>GNKH-3>GNKH-2>俄羅斯西伯利亞雜花>阿爾岡金。GNKH-1為適宜高寒陰濕區(qū)的蛋白品質(zhì)最高的抗寒苜蓿新品系，GNKH-3和GNKH-2僅次GNKH-1。

(2) 高寒陰濕區(qū)供試苜蓿材料葉部的AAS排序為：金皇后>阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-3>GNKH-2>GNKH-1；供試苜蓿材料莖部的AAS排序為：金皇后>阿爾岡金>GNKH-3>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-1>GNKH-2。GNKH-3是抗寒苜蓿新品系中氨基酸評分最高的。

(3)高寒陰濕區(qū)供試苜蓿材料葉部EAAI值大小排序為：阿爾岡金>GNKH-1>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-3>GNKH-2>金皇后；供試苜蓿材料莖部EAAI值大小排序為：阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花>GNKH-2>金皇后>GNKH-1>GNKH-3。供試苜蓿材料蛋白均為優(yōu)質(zhì)蛋白。