曹 科，羅小娟△，沈 丹，姚 強，吳蘇偉，楊志林，陳運生，馬東禮

(深圳市兒童醫(yī)院：1.檢驗科；2.泌尿外科，廣東深圳 518038)

隱睪是睪丸未能按正常發(fā)育過程從腰部腹膜后下降至陰囊底部，包括睪丸缺如、異位和下降不全[1]，是小兒外科常見的生殖系統(tǒng)先天性畸形，其病因復雜，眾多遺傳和內分泌因素都參與了睪丸下降過程[2]。隱睪可能會引發(fā)睪丸萎縮、惡變及成年后男性不育和性功能障礙，嚴重影響男性生殖健康和心理健康而受到廣泛關注[3-6]?？姑缋展芗に?AMH)在男性由睪丸未成熟支持細胞分泌，具有調控生殖細胞生長發(fā)育、引起苗勒管退化及誘導睪丸下降等功能[7]。AMH主要是與抗苗勒管激素Ⅱ受體(AMHRⅡ)結合發(fā)揮生物學效應[8]。本課題組前期研究表明隱睪患兒血清AMH水平顯著下降，是反映隱睪患兒睪丸發(fā)育狀況的一項重要指標[9]。但AMH、AMHRⅡ基因多態(tài)性是否與隱睪發(fā)病相關，不同基因型之間血清AMH、睪酮(T)水平是否存在差異，尚不明確。本研究擬通過檢測隱睪患兒及健康兒童AMH和AMHRⅡ基因多態(tài)性及血清AMH、T激素水平，初步分析AMH和AMHRⅡ基因多態(tài)性與單、雙側隱睪癥及血清AMH、T水平的相關性，從基因多態(tài)性層面初步探討兒童隱睪癥的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年4-8月在本院泌尿外科住院隱睪患兒49例，年齡9個月至7歲9個月，所有病例經體格檢查、B超及手術探查得到確診。納入標準：符合 2012 年我國小兒隱睪的診斷標準[1]，所有入選病例均排除了尿道下裂、兩性畸形、睪丸外傷，術前均未使用激素藥物治療。所有病例均為低位型隱睪(患側睪丸在腹股溝管內環(huán)口下側與陰囊上側之間)。按隱睪睪丸的類型分為單側隱睪組和雙側隱睪組。術中發(fā)現(xiàn)：單側隱睪中，29例可以一次手術固定至陰囊，1例需要分期手術，術中發(fā)現(xiàn)1例隱睪嚴重發(fā)育不良，3例為單睪癥；雙側隱睪中18例可以一次手術固定至陰囊，1例需分期手術，術中發(fā)現(xiàn)1例單側隱睪嚴重發(fā)育不良。同時選取同年齡段40例(9個月至8歲3個月)保健科體檢健康男童作為對照組，納入標準：無腹股溝斜疝、隱睪、尿道下裂、精索靜脈曲張、鞘膜積液、兩性畸形、睪丸外傷、性早熟等病史，無腹股溝區(qū)外傷手術史。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2試驗方法

1.2.1標本采集 所有兒童清晨空腹抽取靜脈血6 mL，其中乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血2 mL標本，分離膠促凝管4 mL標本，分離膠促凝管標本經3 000 r/min離心10 min后取上層血清，抗凝全血和血清標本置于-20 ℃冰箱保存待測，抗凝全血和血清標本均為常規(guī)項目檢測后的剩余標本。

1.2.2血清AMH、T水平測定 采用上海心語生物科技有限公司生產的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒檢測AMH、T水平，AMH試劑盒的線性范圍為0.8～35 ng/mL，T試劑盒的線性范圍為0.4～18 nmol/L，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3AMH和AMHRⅡ基因序列聚合酶鏈反應(PCR)及測序 采用Qiagen DNA Mini試劑盒提取DNA(嚴格按照說明書進行)，AMH和AMHRⅡ4個基因多態(tài)性位點引物由Life Technology公司合成，引物序列見表1。珠海Hema 9600基因擴增儀完成PCR擴增，PCR反應總體積25 μL，包含2 μL 2.5 mmol/L dNTP，0.25 μL 20 mmol/L正向引物，0.25 μL 20 mmol/L反向引物，0.125 μL 5 U/μL Tag聚合酶，2.5 μL 10×Buffer，0.5 μL DNA模板，19.375 μL滅菌蒸餾水。擴增反應程序為94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，從變性至延伸共35個熱循環(huán)后，再72 ℃延伸2 min，12 ℃保存。反應完成后，取5 μL用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產物的擴增情況。PCR產物送Life Technology公司進行產物純化和測序分析。AMH采用正向測序、AMHRⅡ采用反向測序。為保證分析的準確性，每個SNP位點均分析兩次，兩次分析均顯示相同的結果。

表1 AMH 和AMHRⅡ4個基因多態(tài)性位點引物序列

2 結 果

2.1病例組與對照組基本信息比較 49例隱睪患兒中，單側隱睪30例(66.7%)，雙側隱睪19例(33.3%)。單側隱睪組年齡(3.0±2.4)歲與雙側隱睪組年齡(3.3±2.4)歲比較，病例組年齡(3.1±2.4)歲與對照組年齡(3.1±2.4)歲比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2病例組和對照組血清AMH、T水平比較 單側隱睪組AMH、T水平分別與雙側隱睪組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而對照組AMH、T水平均高于單側隱睪組和雙側隱睪組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3AMH和AMHRⅡ基因型分布及其等位基因頻率分布 病例組和對照組AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型、等位基因頻率分布差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；病例組和對照組AMH Ile49Ser、AMHRⅡIVS 10+77 A>G基因型、等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；單側隱睪組和雙側隱睪組AMH Ile49Ser、AMHRⅡIVS 10+77 A>G、AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型、等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 血清AMH、T水平比較

注：▲與雙側隱睪組比較，△單、雙側隱睪組分別與對照組比較，P<0.05

表3 AMH和AMHRⅡ基因型及其等位基因頻率分布[n(%)]

續(xù)表3 AMH和AMHRⅡ基因型及其等位基因頻率分布[n(%)]

表4 不同AMH Ile49Ser基因型對應血清AMH、T水平比較

續(xù)表4 不同AMH Ile49Ser基因型對應血清AMH、T水平比較

表5 不同AMHRⅡIVS10+77A>G基因型對應血清AMH、T水平比較

表6 不同AMHRⅡ IVS 5-6C>T基因型對應血清AMH、T水平比較

表7 不同AMHRⅡ482 A > G基因型對應血清AMH、T水平比較

2.4不同AMH、AMHRⅡ基因型對應血清AMH、T水平比較 單側隱睪組內、雙側隱睪組內、病例組內、對照組內AMH、AMHRⅡ不同基因型之間血清AMH和T水平差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4～7。

3 討 論

抗苗勒管激素又名苗勒抑制物(MIS)，在男性，AMH主要由未成熟睪丸支持細胞(Sertoli cell)分泌，而T主要由成熟睪丸間質細胞(Leydig cell)分泌。因此，測定血清AMH和T水平可以分別反映睪丸支持細胞和間質細胞的功能狀態(tài)、發(fā)育程度。本研究結果顯示，病例組血清AMH、T水平均低于對照組，說明隱睪患兒的睪丸功能受到了損害，這與GRINSPON等[10]、MATUSZCZAK等[11]的研究結果相一致。同時筆者發(fā)現(xiàn)，雙側隱睪組血清AMH、T水平均低于單側隱睪組，表明雙側睪丸未降者，其睪丸受損程度大于單側睪丸未降者，這與HAMDI等[12]研究結論一致，而與VAN BRAKEL等[13]、KOMAROWSKA等[14]的研究結果不太一致，可能與各研究所選取的研究對象數(shù)量、年齡、隱睪類型不同等因素有關。

基因組單個核苷酸A/T/C/G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人類在內的物種之間染色體基因組DNA序列的多樣性，即單核苷酸多態(tài)性(SNP)。它是人類可遺傳變異中最常見的一種，SNP分析對疾病的易感性、早期風險性評估、預防、診斷和治療等各方面均具有重要的作用和價值。既往研究表明，AXIN1[15]、IL-27[16]、IL-21[17]、INSL3[18]、HOXA11[19]、RXFP2[18]等基因多態(tài)性與隱睪癥的發(fā)病風險相關。本研究發(fā)現(xiàn)，AMH、AMHRⅡ基因型分布情況與KOMAROWSKA等[14]研究結果相似，說明中國人與歐洲人的頻率分布相似，不存在人種差異，但與其不同的是，筆者發(fā)現(xiàn)并不是所有IVS 5-6 C>T純合子和雜合突變的病例都伴隨有IVS10+77A>G和482A>G純合子和雜合突變，這可能與人種差異有關。本研究顯示隱睪病例組AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G基因型及等位基因頻率分布與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G可能與隱睪發(fā)病有關。但不同基因型之間血清AMH和T水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示血清AMH和T水平并不受AMH、AMHRⅡ基因多態(tài)性影響。

本研究表明隱睪患兒血清AMH水平顯著下降，但未發(fā)現(xiàn)AMH基因多態(tài)性與隱睪發(fā)病具有相關性?？赡芘c其SNP位點的選擇有關，在EXAC數(shù)據(jù)庫中查到的AMH基因的錯位突變位點有189個，分布于基因組不同區(qū)域，位于啟動子區(qū)域的位點可參與AMH的轉錄表達，編碼區(qū)的SNP可影響翻譯后關鍵功能基團的氨基酸序列，從而影響蛋白質的功能，最終導致對病因或特定環(huán)境的反應敏感性，而內含子區(qū)域SNP可通過影響基因剪接、信使RNA降解、轉錄子結合、非編碼區(qū)RNA序列或與其他相關的SNP位點共同作用等最終影響基因功能。本研究只選取了AMH Ile49Ser非同義SNP位點，其改變了編碼的氨基酸種類，導致第49位的異亮氨酸Ile為絲氨酸Ser所取代，雖然研究結果提示AMH Ile49Ser在研究地區(qū)兒童隱睪癥發(fā)病無明顯作用，但仍不能排除SNP位點的局限性，且可能存在多個位點相互共同作用進而影響實驗結果。隱睪是導致男性不育、睪丸腫瘤的重要因素，AMH和AMH RⅡ基因多態(tài)性是否可以作為遺傳標記用于隱睪的基因診斷并預測不育癥及睪丸腫瘤等，尚有待于今后擴大樣本量更深一步的研究和探討。

4 結 論

AMH、AMHRⅡ基因多態(tài)性是否與隱睪發(fā)病相關研究甚少報道，不同基因型之間血清AMH、T水平是否存在差異，尚不明確，筆者檢測了隱睪患者和健康對照兒童AMH和AMHRⅡ基因多態(tài)性及血清AMH、T激素水平，發(fā)現(xiàn)AMHRⅡ IVS 5-6 C>T、AMHRⅡ482 A>G可能與隱睪發(fā)病有關。隱睪患兒血清AMH、T水平顯著低于對照組，但不受AMH、AMHRⅡ基因多態(tài)性影響。