楊熙凱，徐 冰，王耀光

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎（HBV-GN），簡稱乙肝相關(guān)性腎炎，中國是乙型肝炎病毒（HBV）感染的高發(fā)地區(qū)，HBV-GN的檢出率呈逐年上升趨勢[1]。目前多認(rèn)為HBV-GN的發(fā)病為HBV直接侵犯腎臟上皮細(xì)胞[2]導(dǎo)致，同時腎臟中確定了HBV抗原的表達(dá)，并揭示了病毒復(fù)制和直接病毒誘導(dǎo)的病理改變[3-4]。當(dāng)乙肝病毒侵犯腎臟時，會對腎小管上皮細(xì)胞造成損傷導(dǎo)致腎小管-間質(zhì)纖維化的發(fā)生[5]，腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（TEMT）是腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵過程。腎疏寧是黃文政教授“疏利少陽”學(xué)術(shù)思想的代表方劑，用于治療免疫球蛋白A（IgA）腎病[6]、膜增生性腎炎[7]、HBV-GN[8]等腎病，是臨床常用方劑，但是本方在治療HBV-GN的作用機(jī)制方面尚不清楚。故本實(shí)驗(yàn)使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染C基因型重組乙型肝炎病毒（pHY106-HBV）質(zhì)粒至腎小管上皮細(xì)胞，旨在證明HBV質(zhì)?？梢哉T導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，而腎疏寧含藥血清可以抑制其對HK-2細(xì)胞的不良作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與試劑 SANYO MCO-15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱，SANYO公司；DMED/F12培養(yǎng)基（批號：C11995500BT），Gibco公司；胎牛血清（批號：35-010-CV），Cellgro 公司；Opti-MEM（批號：31985-070），Gibco 公司；lipofectamine 2000（批號：11668019），Invitrogen公司；人乙肝病毒e抗原（HBeAg）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）Kit ELISA（EK0215），SAB 公司；人乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）ELISA Kit（EK0216），SAB 公司；Transwell小室（PI342050），Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 腎疏寧的方劑組成為柴胡15 g，生黃芪 30 g，黃芩 10 g，丹參 30 g，鬼箭羽 30 g，山茱萸12 g，萹蓄15 g，白花蛇舌草30 g，益母草30 g。中藥購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，煎煮后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥含量為5.512 g/mL。pHY106-HBV及pHY106真核表達(dá)載體（不含重組HBV的空載質(zhì)粒），為北京地壇醫(yī)院劉順愛教授惠贈。

1.3 細(xì)胞與小鼠 HK-2細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；SPF級成年C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量20～25 g，雌雄各半，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備含藥血清 將小鼠隨機(jī)分為空白組、腎疏寧低濃度組、腎疏寧中濃度組、腎疏寧高濃度組，每組15只。根據(jù)人和動物間體表面積折算的等效劑量比率表換算，腎疏寧高濃度組生藥濃度為2.756 g/mL，腎疏寧中濃度組生藥濃度為2.034 g/mL，腎疏寧低濃度組生藥濃度為1.313 g/mL，以每日每只小鼠0.2 mL/10 g灌胃，空白組灌服同體積生理鹽水，灌胃7 d。末次灌胃前8 h禁食、不禁水，灌胃2 h后予以摘眼球采血，靜置后3 000 r/min 4℃離心20 min，取上清，56 ℃水浴箱滅活 30 min，0.22 μm 濾膜過濾除菌，-80℃保存。

2.2 細(xì)胞傳代 HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每隔2 d換新鮮培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)融合至80%以上，使用胰酶消化，消化后傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前，無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h同步細(xì)胞，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 收集細(xì)胞均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分為6組，分別為：1）空白血清對照組：HK-2細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，予10%生理鹽水組血清培養(yǎng)。2）空質(zhì)粒組：將空質(zhì)粒（pHY106）轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，予10%生理鹽水組血清培養(yǎng)。3）HBV組：轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒（pHY106-HBV）的HK-2細(xì)胞，予以10%生理鹽水含藥血清培養(yǎng)。4）腎疏寧低濃度組：轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞，予10%腎疏寧低濃度組含藥血清培養(yǎng)。5）腎疏寧中濃度組：轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞，予10%腎疏寧中濃度組含藥血清培養(yǎng)。6）腎疏寧高濃度組：轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞，予10%腎疏寧高濃度含藥血清培養(yǎng)。含藥血清干預(yù)48 h后進(jìn)行檢測。

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 觀察6孔板中細(xì)胞，當(dāng)達(dá)到60%～70%密度時，進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。將2 μg質(zhì)粒和5 μL Lipofectamine 2000分別加入250 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基中，并輕輕混合。室溫下靜置5 min，將兩者混合，室溫靜置20 min。吸取原有培基，將1.5 mL新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基加入每孔?？瞻籽鍖φ战M另加500 μL DMEM/F12 培養(yǎng)基; 將 500 μL lipofectamine 2000-空質(zhì)粒（pHY106）復(fù)合物加入空質(zhì)粒組。將500μLlipofectamine 2000-HBV質(zhì)粒（pHY106-HBV）加入HBV組及腎疏寧含藥血清組，注意轉(zhuǎn)染時不可加入血清。6 h后換液并分別加入各組對應(yīng)的含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5 ELISA法檢測HBsAg、HBeAg的表達(dá) 按試劑盒說明采用ELISA法檢測各組細(xì)胞裂解液中HBsAg、HBeAg的含量。

2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin） 將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，并在室溫下用0.3%TritonX-100處理20 min。與3%H2O2溫育后，在室溫下用兔血清封閉細(xì)胞30 min。然后分別加入第一抗體 α-SMA（abcam，1∶200 稀釋）、E-cadherin（abcam，1∶50 稀釋），在4℃下孵育細(xì)胞過夜。使用生物素標(biāo)記的第二抗體在37℃下孵育1 h。在8 min DAB孵育后，用蘇木精對細(xì)胞進(jìn)行反染色，隨后進(jìn)行梯度醇脫水，二甲苯透明和樹膠密封。每組3個獨(dú)立樣本，每個樣本隨機(jī)取3個視野進(jìn)行拍照。采用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（Image pro plus）進(jìn)行圖像分析，用平均吸光度表示陽性物質(zhì)的相對含量。

2.7 Transwell法檢測細(xì)胞遷徙能力 將Transwell放置于24孔板中并標(biāo)號，消化細(xì)胞，種植于Transwell上室。同時取等量細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)作為細(xì)胞總量的參考。在下室加入10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基以形成營養(yǎng)梯度。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，去除培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛4℃過夜后取出風(fēng)干，同時去除24孔板中固定的參照細(xì)胞的多聚甲醛并風(fēng)干。用0.01%的結(jié)晶紫染色30 min。清洗后拍照并檢測吸光度。

2.8 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)方差不齊，進(jìn)行Welch’s anova檢驗(yàn)，兩兩比較采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HBsAg、HBeAg的表達(dá) 空質(zhì)粒組與空白血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；HBV組與空質(zhì)粒組和空白血清組比較，HBsAg、HBeAg表達(dá)上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

3.2 α-SMA、E-cadherin的表達(dá)

3.2.1 α-SMA蛋白的表達(dá)結(jié)果 α-SMA蛋白為上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測α-SMA蛋白，結(jié)果如表2，圖1所示，空質(zhì)粒組與空白血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與空質(zhì)粒組比較，HBV組α-SMA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；與HBV組比較，腎疏寧低濃度組、腎疏寧中濃度組、腎疏寧高濃度組α-SMA蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）。HBV組胞質(zhì)呈棕黃色，而各治療組胞質(zhì)棕黃色顆粒表現(xiàn)為不同程度的減少；腎疏寧各干預(yù)組組間比較，與腎疏寧高濃度組比較，腎疏寧低濃度組α-SMA蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；腎疏寧中濃度組 α-SMA蛋白表達(dá)相對較多（P＜0.01）。

表 1 HBsAg、HBeAg 的表達(dá)（x±s）Tab.1 Expression of HBsAg，HBeAg（x±s）

表2 各組細(xì)胞α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)結(jié)果（x±s）Tab.2 Expression of α-SMA and E-cadherin proteins of cells in each group（x±s）

圖1 各組α-SMA表達(dá)結(jié)果（標(biāo)尺：19 μm）Fig.1 Expression of α-SMA in each group（scale bar：19 μm）

3.2.2 E-cadherin蛋白的表達(dá)結(jié)果 E-cadherin蛋白為腎小管上皮細(xì)胞間黏性連接蛋白，空質(zhì)粒組與空白血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與空質(zhì)粒組比較，HBV組E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01）；與HBV組比較，各治療組有上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。HBV組細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒減少，E-cadherin蛋白表達(dá)降低，其余治療組較HBV組，其胞漿內(nèi)棕黃色顆粒均略有增多，但增多不明顯。見圖2。

表3 各組細(xì)胞遷徙能力（x±s）Tab.3 Migration capacity of cells in each group（x±s）

圖2 各組E-cadherin表達(dá)結(jié)果（標(biāo)尺：19 μm）Fig.2 Expression of E-cadherin in each group（scale bar：19 μm）

3.3 Transwell法檢測細(xì)胞遷徙能力 應(yīng)用Transwell法動態(tài)觀察EMT過程中細(xì)胞遷徙能力的變化，以及各治療藥物對細(xì)胞遷徙能力的抑制作用。如圖3可見，空質(zhì)粒組與空白血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；HBV組與空質(zhì)粒組比較，因HBV誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化發(fā)生EMT，細(xì)胞遷徙能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。與HBV組比較，腎疏寧低濃度組、腎疏寧中濃度組、腎疏寧高濃度組細(xì)胞遷徙能力明顯減弱（P＜0.01）。腎疏寧各干預(yù)組組間比較細(xì)胞遷徙能力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 Transwell法檢測各組細(xì)胞遷徙能力（標(biāo)尺：25 μm）Fig.3 Migration capacity of cells detected by Transwell in each group（scale bar：25 μm）

4 討論

中國乙型病毒性肝炎的發(fā)病人數(shù)占全球感染乙肝病毒總?cè)藬?shù)的30%[9]。HBV抗原在腎小管上皮細(xì)胞持續(xù)表達(dá)會介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，并向間質(zhì)纖維化方向發(fā)展。

中醫(yī)并無HBV-GN的病名，根據(jù)患者的臨床癥狀和疾病的特點(diǎn)，可歸于中醫(yī)“尿濁”“尿血”“虛勞”“鼓脹”等范疇。黃文政教授在治療腎病時，使用“三焦網(wǎng)絡(luò)學(xué)說”作為理論指導(dǎo)，療效甚佳。在治療HBV-GN時，黃文政教授認(rèn)為面對HBV-GN水腫、蛋白尿等癥狀，使用疏利少陽、通暢三焦的方法，調(diào)節(jié)三焦網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，恢復(fù)水液正常代謝。同時黃文政教授也認(rèn)為HBV-GN存在濕熱邪毒內(nèi)蘊(yùn)臟腑、病情纏綿累及脾腎的病機(jī)。所謂毒邪，即濕熱、濁毒等，對于西醫(yī)學(xué)而言，則為HBV侵犯人體后的有毒代謝產(chǎn)物、血肌酐、尿素氮等。法當(dāng)解毒利濕，肝腎虧虛則應(yīng)當(dāng)補(bǔ)益脾腎，所以使用黃教授“疏利三焦”學(xué)術(shù)思想的代表方腎疏寧治療本病，此方由柴胡、生黃芪、黃芩、丹參、鬼箭羽、山茱萸、萹蓄、白花蛇舌草、益母草組成。方中柴胡疏解少陽樞機(jī)，黃芩清解三焦郁火；黃芪補(bǔ)氣、山茱萸養(yǎng)陰；白花蛇舌草、萹蓄清熱利濕解毒；丹參、鬼箭羽、益母草活血化瘀通絡(luò)，諸藥搭配，疏利少陽，扶正祛邪。

本研究中采用的重組質(zhì)粒是以中國感染患者的HBV為模板構(gòu)建，拷貝的C基因型HBV的（含HBV的全基因組）pHY106-HBV，并且C基因型是中國HBV感染患者的多見基因型，具有代表性，它能在細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制。當(dāng)使用HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞時，通過ELISA檢測，可以發(fā)現(xiàn)HBV有效的復(fù)制和表達(dá)了相應(yīng)的抗原，并且通過免疫細(xì)胞化學(xué)法，也可以發(fā)現(xiàn)α-SMA、E-cadherin的變化，此過程中，上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特性，細(xì)胞之間黏附能力的下降[10]，而腎小管上皮細(xì)胞通過發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）而轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞，其中肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白α-SMA蛋白表達(dá)逐漸增多。同時應(yīng)用Transwell法觀察發(fā)現(xiàn)，HBV轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了在HK-2細(xì)胞的遷徙能力，這無疑是上皮細(xì)胞表型以及細(xì)胞的骨架蛋白的改變，才導(dǎo)致了細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)。綜上，HBV轉(zhuǎn)染對HK-2細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化確有影響。

而當(dāng)使用腎疏寧藥物干預(yù)后筆者發(fā)現(xiàn)，腎疏寧各濃度含藥血清α-SMA蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用，并且腎疏寧中濃度組有較好效果。遺憾的是3組藥物對E-cadherin蛋白的表達(dá)雖然有一定的上調(diào)趨勢，但并沒有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可知，腎疏寧在干預(yù)HBV-GN腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中是以抑制α-SMA為方向，達(dá)到減輕腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的目的。已有研究表明，柴胡、生黃芪等藥物可抑制α-SMA[11-12]，這些研究從單味藥層面對中藥的作用進(jìn)行了闡述，間接證明了腎疏寧的有效性。同時，腎疏寧，雖然對E-cadherin蛋白的作用不明顯，但其可以下調(diào)細(xì)胞的遷徙能力，這可能與中藥復(fù)方的多靶點(diǎn)作用有關(guān)，比如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族對于細(xì)胞的遷徙能力就具有重要作用[13]，這也為研究者進(jìn)一步研究腎疏寧的作用提供了新的方向。故本研究提示，HBV轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞會導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)分化并增強(qiáng)細(xì)胞遷徙能力，而腎疏寧含藥血清可以減輕由HBV導(dǎo)致的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化并減弱其細(xì)胞遷徙能力，但其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。