劉文莉 ，只德賢 ，4，王麗莉 ，劉昌孝 ，3，何 新 ，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006；3.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；4.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

香柑內(nèi)酯是從傘形科和蕓香科植物中發(fā)現(xiàn)的一種具有生物活性的天然化合物，不僅存在于許多傳統(tǒng)中藥植物如獨(dú)活、防風(fēng)、白芷中，而且在許多蔬菜和水果也有發(fā)現(xiàn)[1-2]。香柑內(nèi)酯結(jié)構(gòu)如圖1所示，屬于呋喃香豆素類(lèi)化合物。香柑內(nèi)酯具有很強(qiáng)的光敏性，能與長(zhǎng)波紫外光結(jié)合，在臨床上主要用于治療牛皮癬，白癜風(fēng)和T細(xì)胞淋巴瘤等[3-7]。

肝臟中存在的細(xì)胞色素P450酶（CYP450酶）是人體中最重要的肝臟微粒體混合功能酶系統(tǒng)，能作用于各種外源性化合物，使其在肝臟內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，對(duì)藥物在機(jī)體內(nèi)的代謝起到極其重要的作用[8-10]。藥物代謝過(guò)程中存在的種屬差異，對(duì)于藥物的安全性評(píng)價(jià)、藥效學(xué)及藥物動(dòng)力學(xué)研究具有重要的意義[11-12]。當(dāng)動(dòng)物與人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在明顯差異時(shí)，如何將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果外推至人體是一個(gè)難題。確切地估計(jì)藥物代謝的種屬差異，對(duì)評(píng)價(jià)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、科學(xué)地預(yù)測(cè)藥物毒理學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)、藥理學(xué)特性是至關(guān)重要的[13-14]。

圖1 香柑內(nèi)酯Fig.1 Structure of bergapten

為了更好地理解香柑內(nèi)酯的肝代謝及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體之間可能存在的差異，本文利用人、恒河猴、食蟹猴、豚鼠、大鼠、小鼠、比格犬7種動(dòng)物肝微粒體，采用肝微粒體體外孵育法研究了香柑內(nèi)酯在不同種屬微粒體中的代謝差異。

1 材料與儀器

1.1 儀器及耗材 6520四級(jí)肝飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用（Q-TOF HPLC/MS，美國(guó)安捷倫公司，MassHunter B.02.01SP3色譜工作站）；高速離心機(jī)（ALLEGRA-64R，美國(guó)BECKMAN公司）；海爾-80℃超低溫保存箱（青島海爾股份有限公司）；微型旋渦混合儀（WH-3，上海滬西分析儀器廠有限公司）；十萬(wàn)分之一天平（AX205，瑞士MettlerToledo公司）；DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Millipore Milli-Q/30 L超純水機(jī)（法國(guó)Millipore公司）；96孔深孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；電子恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 香柑內(nèi)酯（5-甲氧基補(bǔ)骨脂素）標(biāo)準(zhǔn)品（＞98%）、卡馬西平（內(nèi)標(biāo)）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；人肝微粒體、恒河猴肝微粒體、食蟹猴肝微粒體、小鼠肝微粒體、SD大鼠肝微粒體及比格犬肝微粒體，均購(gòu)于瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司；還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、二甲基亞砜（DMSO），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈、為色譜純等購(gòu)于天津康科德科技發(fā)展有限公司；所有其他溶劑和化學(xué)試劑均為分析純或以上。

2 方法

2.1 香柑內(nèi)酯在7種肝微粒中的孵育反應(yīng) 香柑內(nèi)酯（終濃度為50 μmol/L）溶于DMSO（終濃度不超過(guò) 0.5%），并在磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.1 mol/L）中稀釋。將50 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液與50 μL 7種肝微粒體（終濃度為2 mg/mL）混合，分別在37℃預(yù)孵育5 min。然后，向上述反應(yīng)混合物中加入100 μL NADPH（終濃度為1 mmol/L）。在37℃孵育120 min后，使用400 μL冰甲醇終止反應(yīng)。在4℃下10 000 g離心10 min后，上清液通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，并通過(guò)UPLC/Q-TOF MS進(jìn)行分析。對(duì)照組不加香柑內(nèi)酯。分別將 5 μL上述溶液注入 Q-TOF UPLC/MS和HPLC/MS/MS進(jìn)行分析。

2.2 香柑內(nèi)酯在7種哺乳動(dòng)物肝微粒體中的代謝產(chǎn)物測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：AgilentProshell120（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫，0～3min，90%A，3～14min，90%→10%A，14～17 min，10%A，17～17.01 min，10%→90%A，17.01～20 min，90%A；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子模式和負(fù)離子模式；碰撞能量，25 eV；毛細(xì)管電壓，3.2 kV；離子源溫度：300℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流速：480 L/h；錐空氣流速：600 L/h。

3 結(jié)果

3.1 香柑內(nèi)酯在7種肝微粒體中代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定 在正離子ESI+下，香柑內(nèi)酯（tR=14.108 2 min）在m/z 217.095 6處具有質(zhì)子化分子[M+H]+。香柑內(nèi)酯主要通過(guò)去甲基（-CH3）和脫掉中性分子CO生成m/z 202.065 2，174.067 7，146.071 4，117.693 2 處的特征產(chǎn)物離子。

如圖2所示，基于香柑內(nèi)酯的代謝產(chǎn)物裂解和特征性質(zhì)譜分離特征，推斷這些代謝產(chǎn)物的碎片信息和斷裂過(guò)程。

圖2 香柑內(nèi)酯Q-TOF質(zhì)譜和碎片信息Fig.2 Q-TOF mass spectrometry and fragment information of bergaptenin

香柑內(nèi)酯與7種肝微粒體孵育后，共檢測(cè)到4種代謝產(chǎn)物：M1（苯環(huán)羥基化），M2（內(nèi)酯環(huán)水解），M3（內(nèi)酯環(huán)的羥基化）和M4（呋喃環(huán)氧化）。代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)詳細(xì)分析如圖3所示。代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)詳細(xì)分析如圖3所示。

圖3 香柑內(nèi)酯代謝產(chǎn)物的Q-TOF的質(zhì)譜圖（A）M1、（B）M2、（C）M3、（D）M4Fig.3 Q-TOF mass spectrum of the metabolites of bergaptenin：（A）M1，（B）M2，（C）M3，（D）M4

代謝產(chǎn)物M1準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z233.158 1的離子，表明加入H2O分子，主要碎片離子為m/z 187.956 4，159.929 2，128.759 9，101.246 0，確認(rèn)內(nèi)酯環(huán)水解產(chǎn)物的形成。代謝產(chǎn)物M2和M3準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+和[M-H]-分別為m/z 251.178 0和m/z 249.127 5。碎片數(shù)據(jù)表明，香柑內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為γ-酮戊二酸和環(huán)氧化物中間體，并形成羥基香豆素乙酸和二氫二醇。代謝產(chǎn)物M4準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z 251.104 1，與在呋喃環(huán)上羥基化產(chǎn)物的形成一致，也是二氫二醇（M3）的氧化產(chǎn)物。

3.2 香柑內(nèi)酯在不同肝微粒體中代謝產(chǎn)物種類(lèi)及含量比較

3.2.1 香柑內(nèi)酯在不同肝微粒體中代謝產(chǎn)物的種類(lèi)比較 由表1可以看出，人肝微粒體、大鼠肝微粒體及比格犬肝微粒體中均發(fā)現(xiàn)4種代謝產(chǎn)物（M1、M2、M3、M4）。恒河猴肝微粒體、食蟹猴肝微粒體及小鼠肝微粒體中均發(fā)現(xiàn)3種代謝產(chǎn)物（M2、M3、M4），而在豚鼠肝微粒體中僅發(fā)現(xiàn)兩種代謝產(chǎn)物（M3、M4）。從代謝產(chǎn)物的種類(lèi)上分析，香柑內(nèi)酯在大鼠、比格犬肝微粒體的代謝產(chǎn)物種類(lèi)與人肝微粒體代謝產(chǎn)物種類(lèi)相同。表1總結(jié)了在7種肝微粒體中鑒定的香柑內(nèi)酯代謝產(chǎn)物的化學(xué)式，準(zhǔn)確的質(zhì)量和保留時(shí)間（tR）。

3.2.2 香柑內(nèi)酯在不同肝微粒體中代謝產(chǎn)物含量比較 如圖4所示，香柑內(nèi)酯在人肝微粒體中代謝產(chǎn)物M1的含量與比格犬和大鼠比較接近；香柑內(nèi)酯在人肝微粒體中代謝產(chǎn)物M2的含量與比格犬、小鼠及大鼠接近。代謝產(chǎn)物M3、M4在七種肝微粒體中的含量都較為接近。綜上所述，從代謝產(chǎn)物的含量上分析，比格犬和大鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物與人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物含量比較接近。

表1 肝微粒體中香柑內(nèi)酯代謝產(chǎn)物的鑒定Tab.1 Identification of bergapten metabolites in liver microsomes

圖4 香柑內(nèi)酯在不同肝微粒體中代謝產(chǎn)物含量比較（n=3）Fig.4 Comparison of metabolite contents of bergaptenin in different liver microsomes（n=3）

4 討論

傘形科藥用植物植物包括北沙參、白芷等在中醫(yī)藥中應(yīng)用十分廣泛，如消炎癬濕藥膏等復(fù)方中藥，其主要藥效成分為呋喃香豆素類(lèi)化合物。香柑內(nèi)酯為來(lái)源于傘形科藥用植物中的呋喃香豆素類(lèi)化合物，在臨床上多用于治療皮膚病，同時(shí)具有抗菌降血壓等作用。

藥物進(jìn)入體內(nèi)主要經(jīng)由肝臟進(jìn)行代謝，在這一過(guò)程中肝臟中的CYP450酶發(fā)揮著及其重要作用[15-17]。其中，CYP1A2占CYP450酶總量的13%，參與包括咖啡因、非那西丁、奧美拉唑等20多種臨床常用藥物的代謝。CYP2E1約占CYP450酶總量的7%，具有超過(guò)70種外源性底物，CYP3A4參與50%以上臨床用藥的I相代謝[18]。一些香豆素類(lèi)化合物的體內(nèi)代謝與CYP450酶相關(guān)，如補(bǔ)骨脂素等為CYP450酶的抑制劑[19]。

由于存在種屬差異，香柑內(nèi)酯在不同動(dòng)物肝微粒體中的代謝也不相同。通過(guò)從代謝產(chǎn)物種類(lèi)及含量上分析，香柑內(nèi)酯在比格犬和大鼠肝微粒體中的代謝與在人肝微粒的代謝較為相近。開(kāi)展藥物代謝的種屬差異研究，有助于闡明藥物的毒副作用，對(duì)于藥物的安全性評(píng)價(jià)、藥效學(xué)及藥物動(dòng)力學(xué)研究具有重要的意義，為新藥開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果外推至人體提供理論支持。