張家順 高麗莉 馬江山 劉高強(qiáng)

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)森林資源生物技術(shù)湖南省國(guó)際科技創(chuàng)新合作基地，長(zhǎng)沙 410004；3. 甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730020）

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是一種豐富的可再生資源，然而由于植物細(xì)胞壁對(duì)微生物和分解酶的天然抗性使其難以被有效利用［1]。與物理、化學(xué)等方法相比，利用纖維素酶進(jìn)行酶解糖化具有條件溫和、利于環(huán)保，且不產(chǎn)生后續(xù)發(fā)酵抑制物等優(yōu)點(diǎn)［2]。但目前纖維素酶普遍存在酶解效率低、酶負(fù)荷大等問(wèn)題，導(dǎo)致實(shí)際使用成本過(guò)高，不利于生產(chǎn)［3-4]。為解決這一問(wèn)題，各國(guó)學(xué)者采取了多種策略，包括添加酶助劑［5]、篩選微生物以尋求性能更好的新型纖維素分解酶［6-7]、酶的定向進(jìn)化和蛋白質(zhì)工程［8]以及提高預(yù)處理技術(shù)和酶的再利用等［9]。表面活性劑（Surfactant，SF）是一種兩親性分子，含有一個(gè)憎水基團(tuán)和一個(gè)親水基團(tuán)，具有兩性分子的結(jié)構(gòu)特征使其表現(xiàn)出乳化、浸潤(rùn)、分散和增溶等多種特性，是一種理想的酶助劑。研究發(fā)現(xiàn)，添加SF可以顯著提高纖維素的酶水解率。根據(jù)極性基團(tuán)的解離性質(zhì)，SF可分為離子型和非離子型，離子型SF根據(jù)解離后的電荷，又可分為陽(yáng)離子型、陰離子型和兩性離子型。大量研究表明，對(duì)纖維素酶解的促進(jìn)效果最好的是非離子型SF，如典型的吐溫和聚乙二醇，因其具有穩(wěn)定性高、相容性好和溶解性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以顯著提高纖維素水解率［10-11]。也有研究把陰陽(yáng)離子表面活性劑進(jìn)行復(fù)配，尋找新型表面活性劑［12-13]，進(jìn)一步改善SF對(duì)纖維素酶解的促進(jìn)作用。根據(jù)來(lái)源的不同，SF又可分為化學(xué)表面活性劑（Chemical surfactants，CSF）和生物表面活性劑（Biosurfactant，BSF）。BSF是一類由微生物、植物或動(dòng)物產(chǎn)生的具有一定表面活性的兩性物質(zhì)［14]，相對(duì)CSF具有無(wú)毒、可降解等優(yōu)點(diǎn)，且具有更高的表面活性和較低的臨界膠束濃度，以及更強(qiáng)的pH穩(wěn)定性、乳化能力和抗黏附活性。

雖然添加SF可以顯著提高纖維素酶解效率，增加還原糖產(chǎn)量，但不同類型的SF對(duì)纖維素的酶解具有不同的影響，且SF的作用效果受到底物結(jié)構(gòu)、水解條件和酶的組成等多方面的影響。SF對(duì)纖維素酶解的影響機(jī)理也尚不完全清楚，普遍認(rèn)為其能減少纖維素酶在木質(zhì)纖維素表面的無(wú)效吸附、提高纖維素酶的穩(wěn)定性和活性及改變底物結(jié)構(gòu)特性等。因此，本文從上述幾個(gè)方面對(duì)表面活性劑對(duì)纖維素酶解的影響及機(jī)理的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化研究提供理論借鑒。

1 影響表面活性劑作用效果的因素

大量研究表明添加SF可顯著提升纖維素的轉(zhuǎn)化率，提高酶的穩(wěn)定性，增加還原糖產(chǎn)率［15-16]。Parnthong等［17]在 棕 櫚 果 串（Palm fruit bunch，PFB）中添加濃度為0.25%（W/V）的Tween-80，還原糖產(chǎn)量增加約50.5%，并發(fā)現(xiàn)Tween-80能吸附在木質(zhì)素的疏水表面上，從而促進(jìn)纖維素酶在纖維素上的吸附，進(jìn)而提高纖維素的酶解率。類似的，Kim等［18]研究發(fā)現(xiàn)，SF對(duì)不含木質(zhì)素的底物酶解也有較大的提高。在α-纖維素和濾紙的酶解過(guò)程中加入0.5%的Tween-80，72 h后可以將轉(zhuǎn)化率從59.4%和69.2%分別提高到81.3%和91.2%。Li等［19]發(fā)現(xiàn)隨著SF用量從0增加0.06 g/g DS（干物質(zhì)質(zhì)量比），葡萄糖產(chǎn)率迅速增加，而當(dāng)SF用量超過(guò)0.06 g/g DS時(shí)，葡萄糖產(chǎn)率略有降低。這可能是由于過(guò)量的SF達(dá)到了臨界膠束濃度發(fā)生自凝聚，形成的膠束抑制了酶與底物接觸，從而降低了葡萄糖的產(chǎn)率［20]。Cai等［21]發(fā)現(xiàn)PVP-8000比 PEG、Tween等傳統(tǒng) SF的效果更好。其研究表明，PVP-8000在木質(zhì)素上的吸附量較大，吸附層更穩(wěn)定、更親水，降低了纖維素酶在木質(zhì)素上無(wú)效吸附的73.1%。因此，大大提高了木質(zhì)纖維素的酶解率。但SF性能的優(yōu)劣既取決于其分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)（即極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)的組成），又受到底物結(jié)構(gòu)、酶的組成及各種水解條件，如pH、轉(zhuǎn)速、底物濃度等的影響。

1.1 底物對(duì)表面活性劑作用效果的影響

底物不同，其纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的含量也不同，SF與底物的相互作用亦不同，因此對(duì)酶活的影響也不盡相同。Sipos等［22]在6種木質(zhì)纖維素酶解中添加了PEG-4000，研究發(fā)現(xiàn)僅對(duì)云杉、柳樹(shù)、大麻有促進(jìn)作用，而對(duì)玉米、小麥的秸稈和高粱渣的酶解沒(méi)有明顯的改善。同樣的，Rocha-Martin等［3]采用高固含量和低酶用量等工藝條件，對(duì)預(yù)處理玉米秸稈、甘蔗秸稈和微晶纖維素進(jìn)行水解。結(jié)果表明，加入PEG-4000可使3種材料的葡萄糖產(chǎn)率分別提高10%、7.5%和32%。這可能是不同類型的木質(zhì)素通過(guò)不同的機(jī)制抑制酶水解。Li等［23]研究發(fā)現(xiàn)，纖維素酶在有機(jī)溶膠木質(zhì)素上無(wú)效吸附，減少了降解纖維素的有效酶，從而降低了水解速率和最終還原糖產(chǎn)量。硫酸鹽木質(zhì)素沉積在纖維素表面，抑制其與纖維素酶接觸，而分子量影響木質(zhì)素的抑制作用。小分子木質(zhì)素溶解性較好，與酶結(jié)合后形成的復(fù)合物仍處于水相，只導(dǎo)致少部分（10%）的酶失活，纖維素酶仍能進(jìn)入底物內(nèi)部與纖維素結(jié)合并水解纖維素，但大分子木質(zhì)素與酶結(jié)合后，復(fù)合物可能無(wú)法有效地進(jìn)入纖維素內(nèi)部，形成一定的空間排斥現(xiàn)象，阻止纖維素酶進(jìn)一步水解纖維素，當(dāng)大分子木質(zhì)素較多沉淀在纖維素表面時(shí)，這種空間排斥作用將更加明顯。另外，核磁共振分析表明，木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特征，如官能團(tuán)等決定了木質(zhì)素在酶解過(guò)程中的吸附能力，高含量的脂肪族羥基或低含量的羧基導(dǎo)致高的表面疏水性，增加木質(zhì)素和酶之間的無(wú)效吸附。因此，不同底物的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)特征及含量均不相同，影響纖維素酶與纖維素有效結(jié)合的方式亦不同，表面活性劑因能與底物結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)特性，如疏水性、電負(fù)性及空間位阻等，因而改善了纖維素酶在底物上的吸附性能，提高了纖維素的水解率。

對(duì)于純纖維素來(lái)說(shuō)，纖維素對(duì)纖維素酶的可及度是限制酶解的主要原因，也是影響SF作用效果的重要因素。Mizutani等［24]研究發(fā)現(xiàn)，Tween-20對(duì)Avicel、Tencel等結(jié)晶度較高的纖維物質(zhì)的酶解有促進(jìn)作用，而對(duì)結(jié)晶度較低的銅氨人造纖維沒(méi)有促進(jìn)作用，認(rèn)為可能是SF抑制了內(nèi)切酶在纖維素表面的無(wú)效吸附，從而使得外切酶更容易進(jìn)入纖維素鏈的末端。而有研究者有不同的發(fā)現(xiàn)，Gupta等［25]研究發(fā)現(xiàn)聚合度影響外切酶的活性，外切酶不能水解較低聚合度的纖維素，因而聚合度高的纖維素底物反而水解率更高，并認(rèn)為提高底物的表面積和反應(yīng)位點(diǎn)的數(shù)目有利于酶的吸附，從而提高水解的初始速率。因此，纖維素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如結(jié)晶度、聚合度等均會(huì)影響纖維素的可及度，進(jìn)而影響纖維素酶（外切酶和內(nèi)切酶）的吸附性能，因而SF的作用效果亦不相同。

1.2 水解條件對(duì)表面活性劑作用效果的影響

木質(zhì)纖維素的酶解是一個(gè)固液兩相反應(yīng)過(guò)程，除了木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)特性，水解條件、固液兩相傳質(zhì)效率等同樣會(huì)影響SF的作用效果。Lou等［26]發(fā)現(xiàn)，pH值升高能顯著增強(qiáng)木質(zhì)素的表面電荷（負(fù)電荷），導(dǎo)致木質(zhì)素變得更加親水，并降低其與纖維素酶結(jié)合的親和力，從而減少纖維素酶的無(wú)效吸附，進(jìn)而提高纖維素的轉(zhuǎn)化率。Wang等［27]也有相似的發(fā)現(xiàn)，將緩沖液的pH由5.0提高到5.5時(shí)，陰離子型SF木質(zhì)素磺酸鈉能將木質(zhì)纖維素的72 h轉(zhuǎn)化率提高10%。因此，pH值影響底物、酶的表面性質(zhì)，也影響SF對(duì)酶解的作用效果。而有研究者表示，在最佳水解條件下，SF對(duì)纖維素酶水解的促進(jìn)作用并不明顯，但在苛刻條件下（高轉(zhuǎn)速、高固液比等）可以提高纖維素的轉(zhuǎn)化。Yang等［28]發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)速為0 r/min、100 r/min時(shí)，Tween-80對(duì)純纖維素轉(zhuǎn)化率的影響很小，然而，當(dāng)轉(zhuǎn)數(shù)增加到180 r/min時(shí)，Tween-80使得纖維素轉(zhuǎn)化率從 35% 提高到 45%。類似的，Okino等［29]比較了攪拌和靜置條件下Tween-80的添加對(duì)濾紙水解反應(yīng)速率的影響，發(fā)現(xiàn)在攪拌條件下水解速率明顯增加，然而在靜態(tài)條件下并沒(méi)有增加，認(rèn)為T(mén)ween-80能防止纖維素酶在攪拌條件下失活。另外，含水量（固液比）影響物質(zhì)的傳質(zhì)效率，高固液比能夠提高酶解糖濃度以及后續(xù)發(fā)酵的產(chǎn)物濃度，減少?gòu)U水產(chǎn)生，但會(huì)降低纖維素酶的轉(zhuǎn)化率、增加能耗等［30]，添加SF有助于這一問(wèn)題的解決。Ma等［31]研究了SF與底物濃度的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Tween-80在低固液（10%）比條件下，對(duì)纖維素酶的促進(jìn)作用并不顯著，而在高固液比（25%）條件下能顯著提高纖維素酶的轉(zhuǎn)化率（提高90%）。這可能是苛刻條件下纖維素酶更易受到液體剪切力作用而失活，SF因能通過(guò)相互作用力保護(hù)纖維素酶不受剪切力影響，從而提高了纖維素酶的轉(zhuǎn)化率［28，32]。

1.3 SF的種類和濃度對(duì)其作用效果的影響

SF的種類和濃度對(duì)纖維素酶解的促進(jìn)效果也有顯著影響。Ouyang等［33]發(fā)現(xiàn)，在Avicel 的水解體系中添加0.03 g/g和0.05 g/g的PEG-4000其轉(zhuǎn)化率分別提高了69.8%和78.9%，然而繼續(xù)增加濃度（0.08、0.11和0.14 g/g）并沒(méi)有進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率。研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）的疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)可分別與木質(zhì)素的苯基和甲基相互作用，從而在木質(zhì)素上形成水合層，抑制了木質(zhì)素與纖維素酶的無(wú)效吸附，因而提高了纖維素的酶水解率［34]。類似的，Cai等［35]發(fā)現(xiàn)隨著陽(yáng)離子型SF十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）濃度的增加，微晶纖維素的72 h水解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)CTAB濃度超過(guò)0.1 mmol/L時(shí)，微晶纖維素的72 h水解率出現(xiàn)顯著下降，加入1 mmol/L的CTAB后，微晶纖維素的72 h水解率僅為8.3%。同樣的，Alhammad 等［36]研究了4種非離子型SF（PEG-4000、PEG-8000、TitronX-80和Tween-100）對(duì)纖維素酶解楊木的影響，發(fā)現(xiàn)添加1%（W/W）SF時(shí)，在PEG-4000存在下酶解有58.5%的最大葡萄糖產(chǎn)率，而在TritonX-100存在下只產(chǎn)生40.3%的最低葡萄糖產(chǎn)率。然而，除了TritonX-100，SF濃度增加到5%和8%時(shí)，均沒(méi)有使葡萄糖產(chǎn)量進(jìn)一步提高，表明SF的種類和濃度均對(duì)纖維素酶的水解產(chǎn)生顯著的影響。

1.4 纖維素酶對(duì)表面活性劑作用效果的影響

纖維素酶的來(lái)源與組成也是影響SF作用效果的重要因素。來(lái)源與組成不同的纖維素酶，其分子量、疏水性及所帶電荷亦不同，均會(huì)影響SF與酶的相互作用，進(jìn)而影響酶與纖維素之間的吸附性能以及不同酶組分間的協(xié)同作用，從而對(duì)酶水解的效率和還原糖產(chǎn)率產(chǎn)生影響。Zhou等［37]對(duì)來(lái)源不同的纖維素酶，在加入同一種SF的情況下比較了其CMCase和FPase酶活的活性大小。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加量為0.5 g/L時(shí)，TritonX-114和Tween-80能大大提高纖維素酶II（EbSL OH，德國(guó)）對(duì)濾紙的120 h轉(zhuǎn)化率，而對(duì)羧甲基纖維素沒(méi)有或甚至輕微的負(fù)面影響；相反，SF能促進(jìn)纖維素酶Ⅲ（山東大學(xué)，中國(guó)）對(duì)羧甲基纖維素的水解，但對(duì)濾紙水解沒(méi)有影響；而用纖維素酶I（Novo.s，丹麥）水解時(shí)，SF對(duì)羧甲基纖維素和濾紙都沒(méi)有顯示出積極的效果。

綜上所述，SF對(duì)纖維素酶的促進(jìn)作用受到諸多因素的影響，在利用SF提高酶解效率時(shí)應(yīng)選著合適的種類及濃度范圍，并注意各種水解條件，以達(dá)到最佳的處理效果。

2 表面活性劑對(duì)纖維素酶解影響的作用機(jī)制

SF對(duì)纖維素酶解影響的作用機(jī)制較為復(fù)雜，尚未形成系統(tǒng)理論，總的來(lái)說(shuō)是由SF、底物與酶三者之間通過(guò)各種分子間作用力，包括疏水相互作用、離子鍵、氫鍵等引起的酶吸附性能和酶活性的改變，可以從以下3個(gè)方面解釋：（1）SF吸附在木質(zhì)素上降低纖維素酶在木質(zhì)素上的無(wú)效吸附（圖1）；另外，可通過(guò)與纖維素酶和底物相互作用，分散纖維素酶聚集體并抑制纖維素酶在底物上的過(guò)量吸附，來(lái)降低纖維素酶在纖維素上的無(wú)效吸附（圖2），從而使溶液中的游離酶含量提高，并能促進(jìn)纖維素酶與纖維素結(jié)合，提高纖維素酶的水解效率。（2）通過(guò)與纖維素酶競(jìng)爭(zhēng)氣液界面和降低液體剪切力抑制纖維素失活，提高纖維素酶的活性與穩(wěn)定性，進(jìn)而提高了纖維素的酶水解率（圖3）；（3）改變底物結(jié)構(gòu)特性，增加底物的可及度和酶的結(jié)合位點(diǎn)（圖4）。

2.1 減少纖維素酶的無(wú)效吸附，并促進(jìn)纖維素酶

與纖維素結(jié)合，提高纖維素的酶解效率

圖1 表面活性劑抑制木質(zhì)素對(duì)纖維素酶無(wú)效吸附的機(jī)理

圖2 表面活性劑抑制纖維素對(duì)纖維素酶無(wú)效吸附的機(jī)理

圖3 表面活性劑在防止纖維素酶失活中的作用機(jī)理

圖4 表面活性劑增強(qiáng)纖維素酶對(duì)纖維素的可及度

纖維素的酶解過(guò)程包括酶在纖維素上的吸附、水解和脫吸附3個(gè)步驟，而木質(zhì)素是一類具有強(qiáng)疏水性的物質(zhì)，木質(zhì)素的存在會(huì)影響木質(zhì)纖維素的疏水性質(zhì)，即影響纖維素酶的吸附與脫吸附性能。纖維素酶的吸附分為兩種：特異性吸附和非特異性吸附。特異性吸附是由纖維素酶中的結(jié)合域（Cellulose binding domain，CBD）完成的，并能將纖維素鏈送到纖維素酶催化域（Catalyse domain，CD）中進(jìn)行催化酶解；而非特異性吸附是酶與底物之間的相互作用造成的，如氫鍵、靜電作用和疏水相互作用等，不參與酶解反應(yīng)，即為無(wú)效吸附［38-39]。有研究表明木質(zhì)纖維素對(duì)酶的無(wú)效吸附是導(dǎo)致水解率不高的重要原因之一。Jiang等［40]研究了非離型SF Tween-80對(duì)纖維素酶在模型木質(zhì)素底物上吸附的影響，用石英晶體微天平和耗散監(jiān)測(cè)分析了Tween-80和纖維素酶在木質(zhì)素底物上的吸附發(fā)現(xiàn)，Tween-80主要通過(guò)分散作用（≥85%）快速吸附在木質(zhì)素底物上并促進(jìn)木質(zhì)素分子的增溶。Tween-80吸附在木質(zhì)素上能增強(qiáng)木質(zhì)素的極性表面能，使木質(zhì)素表面更加親水，從而降低了纖維素酶在木質(zhì)素上的吸附。同樣的，Cai等［41]使用木質(zhì)磺酸鹽和（3-氯-2-羥丙基）三甲基氯化銨合成了一種新型表面活性劑（Quaternization of sulfonated lignin，SLQA），并研究了其對(duì)桉木酶解的影響發(fā)現(xiàn)，SLQA比木質(zhì)素磺酸鹽有更顯著的促進(jìn)作用，SLQA吸附在木質(zhì)素表面可以提高木質(zhì)素的親水性，形成更有效的空間位阻和水化層，減少對(duì)纖維素酶的無(wú)效吸附，從而促進(jìn)纖維素的酶解。Lin等［42-43]將SF進(jìn)行復(fù)配，把木質(zhì)素磺酸鹽基聚氧乙烯醚（Lignosulfonate-based polyoxyethylene ether，LS-PEG）與陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨結(jié)合發(fā)現(xiàn)，LS-PEG的磺酸基能通過(guò)靜電吸引優(yōu)先與CTAB的季銨基相互作用，形成具有非離子表面活性的配合物CTAB-LS-PEG。CTAB-LS-PEG表現(xiàn)出電中性和疏水性，從而加強(qiáng)了對(duì)纖維素酶在木質(zhì)素上無(wú)效吸附的抑制作用，使得新型SF配合物對(duì)木質(zhì)纖維素酶解效率的提高更為顯著。

也有研究者有不同的發(fā)現(xiàn)，Li等［44]認(rèn)為，內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶首先以結(jié)合結(jié)構(gòu)域吸附在纖維素底物上，大部分催化結(jié)構(gòu)域與纖維素反應(yīng)，當(dāng)大量纖維素酶吸附在纖維素上時(shí)，由于過(guò)于擁擠，纖維素酶的催化結(jié)構(gòu)域發(fā)生重疊，不能被充分利用。聚乙二醇是一種在水溶液中具有不穩(wěn)定性和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象的線性聚合物，由于它吸附在纖維素上抑制了纖維素酶的過(guò)量吸附，因而使得吸附在纖維素上的纖維素酶得以充分反應(yīng)，從而提高了對(duì)不含木質(zhì)素的微晶纖維素（Avicel）的酶水解率。因此，證實(shí)了PEG-4000不僅可以減少纖維素酶在木質(zhì)素的無(wú)效吸附，而且對(duì)纖維素也同樣有效。類似的，Lin等［45]發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素磺酸鹽（Lignosulfonate，LS）與十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）的配合物L(fēng)S-CTAB可以顯著提高木質(zhì)纖維素的水解率。首先，LS通過(guò)靜電作用或疏水作用吸附在纖維素酶聚集體上，分散纖維素酶聚集體形成更小和更親水的LS-纖維素酶聚集體，減少纖維素酶聚集體在纖維素上的無(wú)效吸附。然后，CTAB吸附在LS-纖維素酶聚集體上將其強(qiáng)負(fù)電荷調(diào)節(jié)為弱負(fù)電荷，弱負(fù)電荷有利于纖維素酶與帶負(fù)電荷的纖維素相互作用，進(jìn)一步提高纖維素的轉(zhuǎn)化率。

2.2 提高纖維素酶的穩(wěn)定性與活性

纖維素酶的失活是影響木質(zhì)纖維素生物質(zhì)發(fā)展的重要原因之一。在攪拌的液體環(huán)境里，纖維素酶由于液體剪切力作用容易失活，而底物的存在與否對(duì)酶活也有很大影響，一般而言，在無(wú)底物存在的條件下，纖維素酶的機(jī)械穩(wěn)定性較好。另外，當(dāng)酶處于氣液界面時(shí)，失活也將加劇。研究發(fā)現(xiàn)，SF可以提高纖維素酶的穩(wěn)定性，通過(guò)抑制酶失活來(lái)促進(jìn)纖維素的酶解。Xin等［46]通過(guò)研究玉米秸稈和云杉的酶解動(dòng)力學(xué)特征發(fā)現(xiàn)，纖維二糖水解酶（外切葡聚糖酶）的失活是纖維素酶總活力損失的主要原因，而Tween-80是纖維二糖水解酶特異性的激活劑。在含0.5 mg/mL木質(zhì)素、0.5 mg/mL半纖維素和0.5 mol/L半纖維素低聚物的混合物中加入纖維二糖酶，發(fā)現(xiàn)原纖維二糖酶活損失了60%，而Tween-80的加入使損失的活性恢復(fù)了約40%。這表明Tween-80能在消除木質(zhì)素、半纖維素及其衍生物對(duì)纖維二糖水解酶的抑制作用方面表現(xiàn)出特異性的積極作用，從而在酶解過(guò)程中維持酶的高活性。

Lou等［47]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在高攪拌速率的情況下SF對(duì)纖維素酶解的促進(jìn)作用反而更顯著。研究纖維素酶溶液的表面張力，發(fā)現(xiàn)緩沖液、PEG-4600溶液及纖維素酶溶液的表面張力分別為70.1 mN/m、63.3 mN/m和55.5 mN/m，這表明纖維素酶和SF均會(huì)在氣液界面上聚集。由于纖維素酶暴露于氣液界面時(shí)，纖維素酶分子的疏水部分會(huì)伸展到空氣中，而親水部分則浸沒(méi)在水中，這種不平衡的作用力會(huì)導(dǎo)致纖維素酶的折疊，從而失去活性。雖然SF在氣液界面聚集的能力沒(méi)有纖維素酶強(qiáng)，但能和纖維素酶競(jìng)爭(zhēng)氣液界面，從而阻止部分纖維素酶在氣液表面聚集，進(jìn)而減少氣液界面上的纖維素酶分子的數(shù)量，抑制酶的失活［48]。另外，研究纖維素酶溶液的流變特性，結(jié)果顯示加入PEG-4600的纖維素酶溶液剪切力低于沒(méi)有PEG-4600的纖維素酶溶液（由8.4 Pa降低到7.6 Pa），這表明PEG-4600可以在高攪拌速率下降低纖維素酶溶液的剪切力，進(jìn)而減少了由剪切力作用導(dǎo)致的酶的失活。纖維素酶分子在高攪拌速率下受到強(qiáng)烈的剪切力和沖擊力，在纖維素酶分子上的瞬時(shí)力可能是不平衡的，這將導(dǎo)致纖維素酶結(jié)構(gòu)的變化而失活。非離子表面活性劑在纖維素酶分子表面的吸附可能與氫鍵和疏水相互作用有關(guān)［49]，而具有極性的親水性基團(tuán)（如PEG分子中的醚基）可以通過(guò)與水的氫鍵形成致密的水化殼［50]。該水化殼具有潤(rùn)滑作用，能夠降低剪切力和沖擊力對(duì)纖維素酶分子的影響，從而提高了纖維素酶的穩(wěn)定性。同樣的，Kaar等［51]研究發(fā)現(xiàn)，SF的存在降低了溶液表面張力，通過(guò)減少“多余的表面”阻止纖維素酶在氣液表面與空氣接觸，使纖維素酶更加穩(wěn)定。另外，SF還可通過(guò)與纖維素酶競(jìng)爭(zhēng)自由表面區(qū)域阻止纖維素酶在氣液交界面上的變性。在高攪拌速率（200 r/min）和低固載條件下，纖維素酶濃度相對(duì)較低，更容易因剪切力和氣液界面而失活，因此非離子表面活性劑對(duì)酶解的促進(jìn)作用更加顯著。

2.3 改變底物結(jié)構(gòu)特性，增加底物的可及度和酶的結(jié)合位點(diǎn)

如前所述底物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)纖維素的酶解有著顯著的影響。研究發(fā)現(xiàn)，SF可以通過(guò)改變底物結(jié)構(gòu)的性質(zhì)來(lái)促進(jìn)纖維素的水解。Seo等［52]研究發(fā)現(xiàn)，除木質(zhì)素含量高、結(jié)晶度高外的大多數(shù)樣品的細(xì)胞壁，在添加Tween-20后會(huì)塌陷，造成10-50 nm孔洞的形成，不僅使纖維素酶的單層飽和吸附量增加3-3.6倍，而且使纖維素酶的吸附速率增加160-880倍，纖維素72 h轉(zhuǎn)化率也提高了8.7%-21.5%，并認(rèn)為為了獲得Tween-20的結(jié)構(gòu)效應(yīng)，需要對(duì)樣品進(jìn)行某種程度的預(yù)處理（如木質(zhì)素去除），以加強(qiáng)Tween-20向樣品中的擴(kuò)散。而Kim等［53]使用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Tween-80能使纖維素濾紙膨脹，表面出現(xiàn)裂紋，變得無(wú)序易剝落，因此增加了其與纖維素酶的接觸面積，從而提高纖維素酶的吸附性能。相似的，Helle等［54]認(rèn)為SF可以改變纖維素的超微結(jié)構(gòu)以增加纖維素酶對(duì)其攻擊的脆弱性。Lin等［55]使用耗散監(jiān)測(cè)石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring，QCM-D）和原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）研究了SF配合物EHL-PEG對(duì)纖維素膜酶解動(dòng)力學(xué)的影響發(fā)現(xiàn)，EHL-PEG能在纖維素膜表面開(kāi)鑿出大量空腔，使膜更加疏松、暴露，達(dá)到最大酶解速率后，纖維素膜被逐層剝落，直至平衡，因而增加了纖維素酶的接觸位點(diǎn)，提高了纖維素酶的酶解效率。

另外，拉伸強(qiáng)度的損失被認(rèn)為是決定纖維素織物物理性能的主要因素之一。Hemmatinejad等［56]測(cè)定了纖維素織物的拉伸強(qiáng)度和折皺回復(fù)角等物理性能發(fā)現(xiàn)，5種SF在同一濃度下，分別使纖維素織物的拉伸強(qiáng)度降低了5%、7%、8%、8%和17%，而對(duì)應(yīng)纖維素織物水解釋放的還原糖含量也呈逐漸增加的趨勢(shì)。表明表面活性劑，尤其是非離子表面活性劑，能通過(guò)降低底物結(jié)構(gòu)的拉伸強(qiáng)度來(lái)提高纖維素的酶水解率。

SF可以改變底物一定的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，使其更易與纖維素酶發(fā)生反應(yīng)，但相互作用的分子機(jī)理尚不清楚，且纖維素底物的結(jié)構(gòu)包括聚合度、結(jié)晶度、可及度以及纖維素與半纖維素、木質(zhì)素的交聯(lián)互相影響，較為復(fù)雜，不能孤立考察，今后需更進(jìn)一步地深入探究。

3 總結(jié)與展望

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的利用具有極大的應(yīng)用前景，提高纖維素酶的水解效率與還原糖產(chǎn)量，對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的有效利用有重大意義。SF對(duì)纖維素的酶解有顯著的促進(jìn)作用，然而SF、纖維素酶與底物三者之間相互作用較為復(fù)雜，諸多因素均會(huì)對(duì)其作用效果產(chǎn)生影響（圖5）。目前，SF對(duì)纖維素酶解的影響機(jī)制多停留在宏觀方面，為發(fā)揮SF的最大作用，需進(jìn)一步從以下幾個(gè)方面深入探究SF對(duì)木質(zhì)纖維素酶解的影響規(guī)律及微觀作用機(jī)制：（1）SF是通過(guò)何種作用力與底物結(jié)合的，對(duì)底物的表面電荷及親水性有什么影響，是如何影響纖維素酶與底物結(jié)合的；（2）SF與纖維素酶之間的分子作用力有哪些，是如何影響酶的活性和穩(wěn)定性的，如何減少酶因與底物相互作用而導(dǎo)致的失活的；（3）SF是如何影響液體表面張力和剪切力，進(jìn)而提高酶的穩(wěn)定性的；（4）探究SF與底物間的分子作用力，是如何改變底物微觀結(jié)構(gòu)的，綜合考察SF對(duì)底物結(jié)構(gòu)，包括聚合度、結(jié)晶度、可及度及拉伸強(qiáng)度的影響。

圖5 表面活性劑促進(jìn)纖維素酶解的關(guān)系圖