王亞妮 宋金龍 韓剛 穆迎春 江旭 王金耀 阮志勇 李樂

（1. 上海海洋大學(xué)，上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；4. 巴彥淖爾市第一中學(xué)，巴彥淖爾 015002）

孔雀石綠是一種常見的三苯甲烷類染料，廣泛的運(yùn)用在紡織印染工業(yè)中，又由于其對魚類水霉病等病害具有良好控制效果，在我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中曾長期作為漁藥使用［1-2]。20世紀(jì)70年代以來，大量的報(bào)道證實(shí)孔雀石綠具有潛在的致畸、致癌和致突變作用，在水產(chǎn)品中的殘留會(huì)對人體健康構(gòu)成威脅。鑒于孔雀石綠的危害性，我國明確將孔雀石綠列為禁用藥［3-4]。但由于價(jià)格低廉、殺菌效果好等原因，仍有少量不法商販?zhǔn)褂?。加之孔雀石綠在自然環(huán)境中殘留期長、不易降解，因此，開發(fā)一種孔雀石綠高效降解方法具有十分重要的意義［5]。

微生物降解是目前公認(rèn)的處理難降解有機(jī)物最有效的辦法之一，也被證實(shí)是處理孔雀石綠污染的有效方式。房桂華等［6]分離到一株能以孔雀石綠為唯一碳源進(jìn)行生長的菌株Arthrobactersp.M6. 該菌12 h內(nèi)對20 mg/L的孔雀石綠降解率高于80%。梅嬛等［7]報(bào)道了一株孔雀石綠降解菌Raoultellasp. K4-W在48 h內(nèi)對20 mg/L的孔雀石綠降解率為82.5%。吳永利等［8]研究報(bào)道在LB培養(yǎng)基中，菌株P(guān)seudomonassp.KL-1在6 h內(nèi)，可以使100 mg/L的孔雀石綠幾乎完全脫色，降解最適溫度為30℃，菌株在pH為7-14范圍能很好地降解孔雀石綠，脫色率均能達(dá)到72%以上。綜上所述，目前已有一些高效孔雀石綠降解菌，但高降解率均是在LB培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)的，LB培養(yǎng)基碳氮源豐富，無法代表菌株的實(shí)際降解效果。為了進(jìn)一步分離到高效降解菌，本研究采用未培養(yǎng)結(jié)合可培養(yǎng)篩選的方法，以期獲得以孔雀石綠為唯一碳源的高效的孔雀石綠降解菌，為該類化合物在環(huán)境中的修復(fù)提供優(yōu)良的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試樣品采自浙江省杭州市某化工廠廢水處理池的活性污泥，采集后裝入無菌樣品瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，用于孔雀石綠降解菌的分離。

1.1.2 主要試劑 供試孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich，純度為 ≥98.5%；甲醇和乙腈等為色譜純，購自賽默飛世爾公司。實(shí)驗(yàn)用水為高純水與蒸餾水。

1.1.3 培養(yǎng)基 MSM培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO41.5，KH2PO40.5，NH4Cl 1，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7。Luria-Bertani LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 降解菌群的富集 將10 g活性泥樣品加入乘有100 mL的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，以100 mg/L孔雀石綠為唯一碳源，在轉(zhuǎn)速150 r/min，30℃搖床上振蕩30 min培養(yǎng)7 d，后按10%（V/W）接入新鮮無機(jī)鹽培養(yǎng)基，并調(diào)整孔雀石綠濃度至200 mg/L，連續(xù)傳代直至富集物中的孔雀石綠濃度達(dá)到300 mg/L，將每個(gè)代次的富集培養(yǎng)物分別命名為JW1、JW2 和 JW3［9]。

1.2.2 富集培養(yǎng)物微生物群落組成和區(qū)系變化分析 對活性污泥樣品和3個(gè)代次的富集培養(yǎng)物進(jìn)行了總DNA提取，方法參照MOBIO Power Soil土壤總DNA試劑盒說明書步驟進(jìn)行。采用16S rRNA V4-V5區(qū)通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對總DNA進(jìn)行了擴(kuò)增。PCR體系（50 μL）為：上下游引 物（10 mmol） 各 2 μL，DNA（20 ng/μL）3 μL，2×Premix Taq 25 μL，Nuclease-free water 20 μL。PCR反應(yīng)條件 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃40 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止。PCR產(chǎn)物純化回收后，采用DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB）進(jìn)行文庫構(gòu)建，后交（美格基因科技公司）對構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫進(jìn)行 PE2500 測序。獲得測序結(jié)果后進(jìn)行運(yùn)算分類單位（Operational taxonomic units，OTU）物種注釋，從而得到每個(gè)樣品的群落組成信息，結(jié)合物種豐度信息，通過 PCoA、NMDS 等排序分析，比較不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異。

1.2.3 孔雀石綠降解菌的分離 根據(jù)富集培養(yǎng)高通量測序獲得的菌種信息，選擇第三代富集樣品進(jìn)行稀釋涂布于含有50 mg/L孔雀石綠的MSM固體平板上，挑選形態(tài)不一樣的菌落進(jìn)行劃線，并且以同樣的平板多次劃線純化。

1.2.4 孔雀石綠降解菌的初步鑒定 采用細(xì)菌基因組提取試劑盒（Omega）提取菌株的基因組DNA，并以此為PCR擴(kuò)增模板，采用細(xì)菌16S rRNA通用 引 物 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-ACGGHTACCTTGTTTACGACTT-3'） 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）為：上下引物各0.5 μL， 模 板 2 μL，Taq PCR Mix12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，預(yù)計(jì)產(chǎn)物大小為 1 500 bp 左右。將PCR產(chǎn)物送于博邁德有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 孔雀石綠降解菌的能力測定 將分離到的菌株接種于MSM培養(yǎng)基中，于 30℃、150 r/min 的恒溫振蕩器培養(yǎng)12-24 h后，將富集培養(yǎng)的菌液，在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心6 min后，棄上清液，菌體用0.9% NaCl生理鹽水，洗滌3次，以1%接種量加入含有50 mg/L孔雀石綠的MSM培養(yǎng)基中，研究降解菌對孔雀石綠的降解效果。檢測采用高效液相色譜方法，具體檢測條件為：色譜柱Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；紫外波長 600 nm；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相：乙腈/乙酸銨緩沖溶液（85∶15，V∶V）；流速 0.6 mL/min，柱溫 35℃［10-11]。依據(jù)檢測波長為600 nm處孔雀石綠的峰面積結(jié)果，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出培養(yǎng)液中孔雀石綠濃度，再根據(jù)降解率計(jì)算公式（降解率=（初始濃度-終濃度）/初始濃度×100%）計(jì)算降解能力［12]。

1.2.6 菌株生長量的測定 通過可見分光光度計(jì)測定，以波長λ=600 nm 處的吸光度表示，將培養(yǎng)好菌液離心后用無菌水洗滌 1-2 次，然后懸浮于等量的生理鹽水中測定OD600nm值［13]。

1.2.7 降解特性研究 設(shè)置不同溫度（15、20、25、30、35、40 和 45），pH（4、5、6、7、8 和 9）， 不同接種量（1×107、2×107、3×107、5×107、8×107和10×107CFU/mL），研究不同條件對菌株JW3-6降解50 mg/L孔雀石綠能力的影響。

2 結(jié)果

2.1 孔雀石綠降解菌群多樣性和區(qū)系變化分析

經(jīng)過連續(xù)傳代2次，富集物中的孔雀石綠濃度達(dá)到了300 mg/L，將每個(gè)代次的富集培養(yǎng)物分別命名為JW1、JW2和JW3，污泥樣品命名為JWY，分別提取了4個(gè)樣品的總DNA并進(jìn)行了16S rRNA V4-V5區(qū)擴(kuò)增，運(yùn)用Illumina Hiseq2500平臺(tái)對構(gòu)建的擴(kuò)增子文庫進(jìn)行測序和OTU（Operational taxonomic units）物種注釋。結(jié)果（圖1）表明JWY樣品中的序列聚類到1 568個(gè)OTUs，屬水平上菌群主要分屬于Flavobacterium、Pseudomonas、Arenimonas、Methylotenera、Dechloromonas、Geobacter、Labrys，分別占總OTUs的27.37%、9.39%、4.7%、3.2%、1.64%、1.51%和0.16%（圖1）。經(jīng)過1次傳代的富集培養(yǎng)物JW1 中序列聚類到967個(gè)OTUs。在屬水平上菌群主要分屬于Pseudomonas、Methylotenera、Methylobacillus、Acinetobacter和Labrys， 分 別 占51.14%、33.17%、2.43%、1.46%和0.3%。2次傳代樣品JW2序列聚類到576個(gè)OTUs，在屬水平上菌群主要分屬于Pseudomonas、Labrys、Acinetobacter、Achromobacter和Cupriavidus，分別占總OTUs的54.7%、21.5%、10.4%、2.67%和1.6%。3次 傳 代JW3樣品78 458個(gè)16S rDNA序列聚類到396個(gè)OTUs。在屬水平上，菌群主要分屬于Pseudomonas、Labrys、Acinetobacter、Cupriavidus、Achromobacter、Mesorhizobium和Methylobacillus，分別占總OTUs的67.8%、14.6%、7.9%、2.7%、1.7%、0.09%和0.71%。

從結(jié)果（圖2）中可以看出，隨著富集代次的增加和孔雀石綠濃度的提高，富集培養(yǎng)中的微生物多樣性逐漸降低，從原始樣品的1 568個(gè)OTUs降至396個(gè)，群落組成也發(fā)生了明顯的變化。優(yōu)勢菌屬從初始的Flavobacterium變?yōu)镻seudomonas，經(jīng)2次傳代后OTUs總數(shù)占比達(dá)67.8%，說明Pseudomonas菌屬與孔雀石綠的降解密切相關(guān)，F(xiàn)lavobacterium菌屬經(jīng)1次傳代后OTUs占比就降低至0.1%以下。而原本占總OTUs比僅為0.16%的Labrys，OTUs上升至14.6%，說明Labrys也是參與孔雀石綠降解的主要菌群。此外，Acinetobacter、Cupriavidus、Achromobacter菌屬經(jīng)2次傳代后OTUs占比逐漸升高，也很可能與孔雀石綠的降解相關(guān)。

2.2 降解單菌的分離鑒定

經(jīng)連續(xù)劃線純化，從富集培養(yǎng)物JW3中分離到13株對孔雀石綠具有降解效果的菌株，其中JW3-6和JW3-5效果較好，降解率分別為91.2%和67.8%，顯著高于其他菌株，最終選擇降解效果最好的JW3-6進(jìn)行后續(xù)研究。菌株JW3-6在LB平板上菌落呈乳白色，表面光滑，邊緣整齊。在顯微鏡下，菌體形狀為桿狀，革蘭氏染色陰性。將菌株JW3-6 的16S rRNA 基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為MK494181，BLAST結(jié)果表明，JW3-6與Pseudomonasveronii16S rRNA 基因的相似性為99.69%，根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3可以看出，菌株JW3-6與假單胞菌數(shù)的菌株匯聚在一起，因此初步將JW3-6鑒定為Pseudomonas veronii。

2.3 菌株JW3-6降解孔雀石綠特性分析

菌株JW3-6能以孔雀石綠為唯一碳源生長，從降解實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出，如圖4，孔雀石綠的降解率與菌株JW3-6的菌體濃度呈正相關(guān)，主要的降解發(fā)生在1-3 d，4 d后降解效率逐漸降低，菌體生長到達(dá)平穩(wěn)期，經(jīng)過7 d后，JW3-6對初始濃度為50 mg/L的孔雀石綠降解達(dá)到了91.2%。

2.4 溫度對JW3-6降解效率的影響

圖 3 JW3-6 16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

從圖5中可以看出菌株JW3-6具有良好的溫度適應(yīng)范圍，可以在15-45℃的區(qū)間內(nèi)降解孔雀石綠，其中30℃降解效率最高，達(dá)到了92.3%，當(dāng)溫度為45℃時(shí)，降解率為42.2%。當(dāng)溫度降低至15℃時(shí)，降解率為50.2%。由此可見，菌株JW3-6具有較好的溫度適應(yīng)范圍。

圖 4 孔雀石綠降解率與菌株JW3-6菌體濃度正相關(guān)圖

圖 5 溫度對JW3-6降解效率的影響

2.5 pH對JW3-6降解效率的影響

菌株JW3-6可以在pH為4-9的范圍內(nèi)降解孔雀石綠，如圖6所示，在pH為5-7的范圍內(nèi)降解效率均超過80%，pH為7時(shí)降解效率最高，為92.5%。菌株JW3-6在偏堿性的條件下降解效率較低，當(dāng)pH升高至8時(shí)，降解效率即下降至65.5%，在pH為9時(shí)，降解效率為34.5%，說明菌株在偏酸性條件下降解效果較好。

圖 6 pH對JW3-6降解效率的影響

2.6 接種量對JW3-6降解效率的影響

研究了不同初始接種量對菌株降解孔雀石綠的影響，如圖7所示，初始接種量1-5×107CFU/mL的范圍內(nèi)降解效率均超過80%，接種量為5×107CFU/mL時(shí)降解效率最高，為92.8%。菌株JW3-6在接種量增加的條件下降解效率無明顯變化，當(dāng)接種量增加為8×107CFU/mL時(shí)降解效率為85%，10×107CFU/mL時(shí)降解效率為76.5%。由此可見，初始接種量對菌株JW3-6降解孔雀石綠的影響較小。

圖 7 接種量對JW3-6降解效率的影響

3 討論

近年來，研究人員已從土壤、湖泊及廢水處理池等各類環(huán)境樣品中分離到可脫色或降解孔雀石綠的微生物，涉及細(xì)菌、放線菌及真菌中不同的屬種。已報(bào)道的細(xì)菌和放線菌如庫特氏菌屬（Kurthia）［14]、芽孢桿菌屬（Brevibacillus）［15]、腸桿菌屬（Enterobacter）［16]、拉烏爾菌屬（Raoultella）［17]及假單胞菌屬（Pseudomonas）［18-19]。吳永利等［8]研究報(bào)道在LB培養(yǎng)基中，菌株P(guān)seudomonassp.KL-1在6 h內(nèi)，可以使得100 mg/L 的孔雀石綠幾乎完全被脫色。Tao等［20]研究中篩選到Pseudomonassp.YB2甚至能夠?qū)? 000 mg/L的孔雀石綠，12 h內(nèi)完全降解脫色，但該2個(gè)菌株的降解率均是在LB培養(yǎng)基條件下實(shí)現(xiàn)的，在實(shí)際環(huán)境中很難達(dá)到同等效果。本研究以孔雀石綠為唯一碳源，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基當(dāng)中篩選的JW3-6菌體可以對50 mg/L孔雀石綠的降解效率達(dá)到92.8%，為孔雀石綠污染環(huán)境的微生物修復(fù)提供了優(yōu)良的菌株。

以往有關(guān)孔雀石綠降解菌的報(bào)道中，大多采用傳統(tǒng)的分離篩選方法，通常對樣品直接富集馴化和定向分離降解微生物，本研究結(jié)合未培養(yǎng)與可培養(yǎng)的方法，首先對樣品進(jìn)行高通量測序，獲得樣品當(dāng)中主要的微生物組成信息，分析了不同代次孔雀石綠降解富集物中微生物群落變化發(fā)現(xiàn)，可能與孔雀石綠降解相關(guān)的菌株，如Labrys菌屬原本占總OTUs升至14.6%，說明Labrys很可能參與了孔雀石綠降解；菌 種Acinetobacter、Cupriavidus、Achromobacter在 兩次傳代中OTUs占比呈升高趨勢，推測也與孔雀石綠降解有關(guān)系。運(yùn)用高通量測序的方法獲得降解菌群群落組成，直接獲得可能與降解孔雀石綠相關(guān)的微生物菌種，有目的地篩選，最終得到13株可能具有降解孔雀石綠高效的降解菌株，其中以假單胞菌降解效率最高，結(jié)合可培養(yǎng)的方式得到目的菌株JW3-6。此方法更具有高效性和針對性，為其他環(huán)境污染物降解過程中微生物分離提供參考。

4 結(jié)論

通過高通量測序分析了不同代次孔雀石綠降解富集物中微生物群落變化，確定了優(yōu)勢菌群為假單胞菌，進(jìn)一步分離到了高效孔雀石綠降解菌，經(jīng)初步鑒定為PseudomonasveroniiJW3-6，7 d內(nèi)對孔雀石綠降解效率最高為92.8%。通過單因素試驗(yàn)確定了該菌最適的降解條件為30℃，pH 7，初始接種量5.0×107CFU/mL。