張鈺文 袁航 于江悅 馬曉曉 史超碩 李玉

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

羽毛中90%的蛋白是由富含半胱氨酸的β-角蛋白組成的，是重要的蛋白質(zhì)資源。由于β-角蛋白含有大量二硫鍵而難被降解，導(dǎo)致其無法直接被利用［1]。目前，羽毛廢棄物處理通常采用高溫高壓、強(qiáng)酸強(qiáng)堿和擠壓膨化等物理化學(xué)方法［2]，不僅破壞羽毛中重要的氨基酸，使某些氨基酸的消化率和利用率降低［3]，還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染［4]。因此，利用生物酶解法可使羽毛廢棄物的處理過程更加清潔、高效。

角蛋白酶（Keratinase，E.C 3.4.21/24/99.11）是細(xì)菌［5]、放線菌［6]和真菌［7]等微生物產(chǎn)生的一種金屬或絲氨酸蛋白酶［8-9]，可破壞角蛋白二硫鍵使其順利分解為氨基酸及多肽，從而提高角蛋白利用率。目前角蛋白酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)酶水平普遍偏低、發(fā)酵周期較長、生產(chǎn)成本較高、研究技術(shù)不夠成熟［10]等問題，致使只有少數(shù)具備商業(yè)開發(fā)價(jià)值。因此，不斷篩選和優(yōu)化角蛋白酶生產(chǎn)菌株，降低生產(chǎn)成本，對實(shí)現(xiàn)角蛋白酶的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

本研究從全國5個(gè)不同地方的豬、羊圈土壤中篩選分離了一株降解羽毛的菌株，通過菌株形態(tài)特征觀察和16S rDNA序列分析法對該菌株進(jìn)行鑒定，并克隆了角蛋白酶基因序列。在此基礎(chǔ)上，通過篩選信號(hào)肽來提高角蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)，旨為探索信號(hào)肽與靶蛋白表達(dá)效率之間的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)有助于實(shí)現(xiàn)重組角蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 來自新疆、河南、內(nèi)蒙古、河北、山東地區(qū)的羊圈或豬圈的土壤。羽毛：來自寧夏好水川養(yǎng)殖有限公司。菌株與質(zhì)粒：B.subtilisWB600和質(zhì)粒pWB980均由本實(shí)驗(yàn)室保存。試劑與培養(yǎng)基：DNA限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒、DNA片段切膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司。

1.1.2 LB培養(yǎng)基 1.0%蛋白胨、0.5%酵母粉、1.0%NaCl、2.0%瓊脂粉；富集培養(yǎng)基：0.3%牛肉膏、1.0%蛋白胨、0.5% NaCl、pH自然；牛奶培養(yǎng)基：1.0%蛋白胨、1.0% NaCl、0.5%酵母粉、1.5%脫脂牛奶、2.0%瓊脂粉；羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基：1%羽毛粉、0.05% KH2PO4、0.12% K2HPO4、0.05% NaCl、0.01%MgSO4、0.02% CaCl2、pH 7.5-8.0；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：2.0%蛋白胨、1.0%酵母粉、1.0%葡萄糖、0.3%KH2PO4、0.6% Na2HPO4、0.03% MgSO4、pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)角蛋白酶菌株的篩選 稱取1 g土壤放入富集培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。吸取5 mL上述菌懸液梯度稀釋至10-8，每個(gè)稀釋度取100 μL涂布至牛奶平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。挑出產(chǎn)透明圈的單菌落，并進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)。

挑取1個(gè)傳代純化多次的單菌落，接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后，按照2%的接種量，接種于100 mL羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min中培養(yǎng)48 h，觀察羽毛降解情況并測其角蛋白酶酶活。

1.2.2 菌落和菌體形態(tài)觀察 將分離純化的菌株分別劃線于LB平板和牛奶平板中，37℃恒溫培養(yǎng)18-24 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色、菌落邊緣和表面質(zhì)地等特征。挑取單菌落，制片，革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的個(gè)體形態(tài)。

1.2.3 角蛋白酶活力的測定 本研究參照 Yamamura等［11]的測定方法，將發(fā)酵液4℃、12 000 r/min，離心 10 min，取 250 μL 粗酶液，加入 250 μL 0.05 mol/L Gly-NaOH緩沖液（pH 10.0）溶解1%的底物（角蛋白），60℃反應(yīng)10 min，加入500 μL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)（對照組先加入三氯乙酸）。12 000 r/min，離心 5 min，取上清 500 μL， 加 入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和500 μL福林酚試劑（1∶2 V/V）混合，60℃顯色20 min。在波長680 nm下檢測吸光值。

酶活力定義：1 g固體酶粉（或者1 mL液體酶），在60℃，pH 10.0條件下，1 min水解角蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以U/g（U/mL）表示。

酶活力的計(jì)算，得到測酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.01x+0.000 7，R2=0.999 7酶活計(jì)算公式：

式中：X為樣品的酶活力，U/g（U/mL）；A為樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度；K為吸光常數(shù)；1為反應(yīng)試劑的總體積（mL）；10為反應(yīng)時(shí)間10 min，以1 min計(jì)；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，以菌株M的基因組DNA作為模板，用16S rDNA保守序列的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'） 和 1 429R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收PCR產(chǎn)物并測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，選取并下載相似性99%以上的序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 角蛋白酶基因的獲取 將篩選得到的高效降解羽毛菌株的16S rDNA進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，初步判定其為芽孢桿菌屬，從 GenBank 中下載芽孢桿菌中的角蛋白酶基因序列，利用軟件 DNAMAN比對后，用引物設(shè)計(jì)軟件 Snapgene在其保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對引物，上游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物引入SphⅠ酶切位點(diǎn)。引物由蘇州金維智公司合成。

以試劑盒提取的菌株M基因組為模板，PCR擴(kuò)增角蛋白酶基因，純化PCR產(chǎn)物并測序，最終確定其為角蛋白酶基因kerK。

1.2.6 表達(dá)載體的構(gòu)建 利用在線工具SignalP 5.0 Serve（http ：//www. cbs.dtu.dk/services/Signa lP/） 對角蛋白酶基因kerK進(jìn)行分析，可知其自身帶有Sec途徑的信號(hào)肽，以基因組為模板，設(shè)計(jì)引物KE1-F（5'-CGCGGATCCCAGGCGGCAGGGAAATCA-3'）；KE1-R：（5'-CATGCATGCTAAAAAAACCGGCGGG GC-3'），利用PCR的方法獲得不含信號(hào)肽的角蛋白酶基因kerK-1，進(jìn)行純化回收。

角蛋白酶基因kerK經(jīng)PCR擴(kuò)增純化后，用BamHⅠ-SphⅠ雙酶切，回收，通過Solution Ⅰ連接酶連接到 pWB980 表達(dá)載體上，連接反應(yīng)體系為（20 μL）：pWB980 載體片段 6 μL，角蛋白酶基因kerK片段 4 μL，Solution Ⅰ 10 μL，16℃連接 6 h，轉(zhuǎn)化入B.subtilisWB600。

將含有信號(hào)肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW和SPNprE的質(zhì)粒進(jìn)行試劑盒回收。分別使用KpnI -BamHⅠ雙酶切回收信號(hào)肽片段；將信號(hào)肽片段、角蛋白酶kerK1基因通過SolutionⅠ連接酶連接到 pWB980 表達(dá)載體上，連接反應(yīng)體系為（20 μL）：pWB980載體片段6 μL，信號(hào)肽-角蛋白酶基因kerK1片段4 μL，SolutionⅠ 10 μL，16℃連接 6 h，轉(zhuǎn)化入B.subtilisWB600。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩與復(fù)篩

從不同土壤中，利用牛奶培養(yǎng)基篩選得到20株能夠產(chǎn)蛋白酶的菌株，它們均能有效的分解牛奶培養(yǎng)基中的酪蛋白成分。計(jì)算得到水解圈直徑與菌株直徑的比值初步判斷菌株水解蛋白的能力。

利用羽毛粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，將初篩得到的20株有較大水解圈的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，48 h發(fā)酵后，觀察其羽毛降解情況，并以1.2.3的方法測定角蛋白酶活力。發(fā)現(xiàn)其中編號(hào)為M的菌株降解羽毛的效果最好，其酶活為21.98 U/mL，如圖1所示。將菌株M作為目的菌株，進(jìn)行下一步的研究。

圖1 20株菌的角蛋白酶活力

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及菌株鑒定

通過篩選獲得的菌株M，其在初篩平板上菌落為乳白色、邊緣不規(guī)則、扁平、表面光滑，挑起時(shí)較黏稠。革蘭氏染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)菌株M為革蘭氏陽性菌、短直桿狀、有芽孢，染色均勻（圖2），初步判斷其為芽孢桿菌（Bacillussp.）。

菌株M經(jīng)16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示其大小約1 500 bp，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序，測得分子量大小為1 463 bp。測得的16S rDNA的序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行相似性比對發(fā)現(xiàn)，該菌株基因序列與芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等幾株芽孢桿菌屬的16S rDNA同源性均達(dá)99%以上，系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示，初步確定該菌為芽孢桿菌。

圖2 菌株M的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征

圖3 菌株M的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 角蛋白酶基因kerK及重組載體的構(gòu)建

以菌株M基因組為模板，PCR擴(kuò)增帶自身信號(hào)肽SPKerK的角蛋白酶基因（圖4），擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與B.amyloliquefaciensK11角蛋白酶基因（GenBank：KR868996.1）相似性達(dá)到了97.63%，將其命名為角蛋白酶基因kerK，按照1.2.6所述方法，構(gòu)建含有自身信號(hào)肽的重組菌株，命名該重組菌株為R1-KerK。

選取本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)堿性蛋白酶比較好的4個(gè)信號(hào)肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW與SPNprE，分別構(gòu)建重組 質(zhì) 粒 pWB980-SacB-kerK1、pWB980-DacB-kerK1、pWB980-YoaW-kerK1、pWB980-NprE-kerK1，并轉(zhuǎn)化入B. subtilisWB600，獲得重組菌株分別命名為R2-SacB，R3-DacB、R4-YoaW與R5-NprE。

圖4 角蛋白酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 重組菌株初篩

5株重組菌株R1-KerK、R2-SacB、R3-DacB、R4-YoaW與R5-NprE在牛奶平板上，37℃，培養(yǎng)18 h，觀察蛋白水解圈大小，如圖5所示，與對照A相比，5株重組菌株均產(chǎn)生水解圈，表明5株重組菌中角蛋白酶基因均已成功表達(dá)，其中重組菌株R3-DacB的HC值（透明圈直徑與菌落直徑的比值）最大，為4.5，可以初步認(rèn)為信號(hào)肽SPDacB最有利于角蛋白酶基因的表達(dá)。

2.5 發(fā)酵上清液的SDS-PAGE檢測

2.6 不同信號(hào)肽對角蛋白酶分泌的影響

5株重組菌株經(jīng)48 h搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵液上清測定角蛋白酶酶活（圖7），信號(hào)肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW、SPNprE和SPKerK表達(dá)角蛋白酶水平相差較大。

圖5 重組菌株的初篩

將發(fā)酵48 h的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出5株重組菌上清液在相對分子質(zhì)量為39 kD左右均有蛋白條帶，與角蛋白酶相對分子質(zhì)量相符。說明5株重組菌株均能成功表達(dá)角蛋白酶，其中重組菌株R3-DacB的表達(dá)角蛋白酶量較高。重組菌株R1-KerK、R2-SacB、R4-YoaW、R5-NprE產(chǎn)角蛋白酶的酶活分別為68.15 U/mL、63.35 U/mL、18.35 U/mL和23.76 U/mL，其中重組菌株R3-DacB的酶活最高，達(dá)到了226.34 U/mL，為菌株M的10倍，是菌株R1-KerK的3.32倍。同時(shí)，利用不同菌株發(fā)酵降解羽毛，結(jié)果（圖8）顯示重組菌株R3-DacB完全降解羽毛的時(shí)間最短，相較于初始菌株M縮短了12 h。以上結(jié)果表明，信號(hào)肽對角蛋白酶的分泌表達(dá)有一定的影響，信號(hào)肽DacB能夠明顯提高角蛋白酶的表達(dá)活性。

圖6 不同重組菌株表達(dá)角蛋白酶的SDS-PAGE分析

圖7 重組菌株角蛋白酶酶活分析

3 討論

圖8 羽毛降解效果對比

羽羽毛廢棄物是家禽屠宰場中產(chǎn)量最高的自然角質(zhì)材料。根據(jù)調(diào)查，全世界羽毛廢棄物的日積累量約為5×106萬t，是巨大的資源庫，同時(shí)大量的廢棄物堆積也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。生物降解是最合理的處理方式，角蛋白酶是生物降解羽毛的關(guān)鍵酶，目前羽毛角蛋白降解菌的研究主要集中在細(xì)菌、真菌和放線菌。侯燕燕等［12]在新疆天然鹽堿地土壤中篩選出一 株高產(chǎn)角蛋白酶的耐鹽菌Bacillussp. K-18，其發(fā)酵液的角蛋白酶活力為96.7 U/mL。劉柏宏［13]篩選出一株地衣芽孢桿菌，通過對宿主菌株、調(diào)控元件及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，使角蛋白酶酶活比初篩菌株酶活提高了5倍。耿秀秀等［14]從新疆戈壁沙漠中篩選出一株能夠降解羽毛的戈壁異常球菌（Deinococcus gobiensis），成功構(gòu)建了表達(dá)角蛋白酶Dgker的重組菌株E.colipET22b-Dgker/BL21，其能夠在3 d內(nèi)完全降解羽毛。孫蓉等［15]篩選得到一株高效降解羽毛的菌株Bacillus subtilisBS10，并且以羽毛粉為底物測定酶活力，為（1.88±0.10）U/mL。本實(shí)驗(yàn)通過對篩選到的芽孢桿菌上的角蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)后其角蛋白酶酶活比初篩菌株提高了2.10倍。信號(hào)肽在蛋白質(zhì)分泌中起到的重要作用，陳景奇［16]通過篩選比較了6種信號(hào)肽，信號(hào)肽SPNprE使α-淀粉酶AmyLM2，酶活達(dá)到260 U/mL，為其自身信號(hào)肽的1.79倍。Guan等［17]篩選了19個(gè)Sec分泌途徑的信號(hào)肽，最終獲得SPYncM，使氨基肽酶的分泌效率比原始信號(hào)肽提高了1.2倍。本實(shí)驗(yàn)通過篩選比較了5種信號(hào)肽，信號(hào)肽SPDacB使角蛋白酶酶活達(dá)到226.34 U/mL，是自身信號(hào)肽SPKerK的3.32倍。研究表明，信號(hào)肽之所以能影響酶的分泌表達(dá)，可能是由于它的N區(qū)及疏水H區(qū)電荷分布的影響，還可能是由于信號(hào)肽N區(qū)稀有密碼子的缺失，從而增強(qiáng)酶的分泌表達(dá)［18]，H區(qū)疏水性殘基與信號(hào)肽其他區(qū)域相互作用也能夠影響酶的分泌［19]。同時(shí)很多實(shí)驗(yàn)表明信號(hào)肽的篩選能夠有效地提高目的蛋白的表達(dá)量，但到目前為止，最佳的信號(hào)肽仍無法預(yù)測，只能通過大量的篩選來確定目的蛋白的最佳信號(hào)肽。在未來的研究中，可在分子層面對信號(hào)肽進(jìn)行進(jìn)一步改造，也可通過研究枯草芽孢桿菌分泌途徑的機(jī)制或影響分泌的其他因素，不斷提高角蛋白酶分泌表達(dá)量，以達(dá)到能夠工業(yè)化應(yīng)用的目的［20]。

4 結(jié)論

本研究以羽毛為唯一碳源，從自然界中篩選到20株產(chǎn)角蛋白酶菌株，初篩獲得的菌株接種到含有羽毛粉的復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵篩選，最終獲得對羽毛降解能力較強(qiáng)的菌株M，其酶活為21.98 U/mL。通過形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列比對，構(gòu)建進(jìn)化樹，經(jīng)鑒定該菌株為芽孢桿菌（Bacillussp.）。克隆其角蛋白酶基因kerK，并進(jìn)行信號(hào)肽的篩選比較，成功在B. subtilisWB600中構(gòu)建重組菌株，發(fā)酵48 h，重組菌株R3-DacB發(fā)酵48 h時(shí)，發(fā)酵上清粗酶液中角蛋白酶活力為226.34 U/mL，是自身信號(hào)肽SPKerK的3.32倍。