董莉 許敏 陳華娟 郭婷 董永喜

[摘要] 目的 對芭蕉根提取物各組分促成骨細胞增殖及分化的有效組分進行篩選。方法 于2018年6月—2019年1月，采用人成骨肉瘤SaOS-2細胞，芭蕉根各組分組加入濃度為100 mg/L作用細胞48 h 后，用噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖，酶聯(lián)免疫法（ELISA）法檢測細胞上清液中堿性磷酸酶（ALP）、鈣離子（Ca2+）和骨鈣素（BGP）的含量。 結(jié)果 與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均可顯著促進細胞的增殖（P<0.05），分別使細胞增殖16.74%、5.57%、10.02%;升高細胞中 ALP的含量（P<0.005），分別使細胞中 ALP的含量增加58.11%、21.45%、39.57%;促進細胞中Ca2+、BGP 的分泌（P<0.01），其中B組分的作用最顯著。 結(jié)論 B組分為芭蕉根促成骨細胞增殖及分化的有效組分，其可能通過升高ALP、Ca2+的含量、促進BGP的分泌從而促成骨細胞增殖及分化。

[關鍵詞] 芭蕉根;有效組分;成骨細胞; 增殖及分化

[中圖分類號] R285 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-0742（2019）06（c）-0013-04

[Abstract] Objective To screen the effective components of the growth and differentiation of bone cells in the extracts of banana root. Methods From June 2018 to January 2019， human osteosarcoma SaOS-2 cells were used. The cells of the banana roots were added to the cells treated with 100 mg/L for 48 h， and then detected by MTT assay. Cell proliferation and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the contents of alkaline phosphatase （ALP）， calcium （Ca2+） and osteocalcin （BGP） in the supernatant. Results Compared with the blank control group， the B， C， and D components significantly promoted cell proliferation （P<0.05）， and the cells proliferated 16.74%， 5.57%， and 10.02%， respectively. The content of ALP （P<0.005） increased the content of ALP in cells by 58.11%， 21.45% and 39.57%， respectively， and promoted the secretion of Ca2+ and BGP in cells （P<0.01）. Most notable in group B. Conclusion Group B of component is an effective component of banana root promoting osteoblast proliferation and differentiation. It may promote osteoblast proliferation and differentiation by increasing the content of ALP and Ca2+ and promoting the secretion of BGP.

[Key words] Banana root; Effective components; Osteoblasts; Proliferation and differentiation

芭蕉根，為芭蕉科植物芭蕉Musa basjoo Sied.et Zucc.的干燥根莖，收載于《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標準》2003 年版[1-2]。具有清熱解毒，止渴利尿之功效。用于風熱頭痛，水腫腳氣，血淋，肌膚腫痛，丹毒。已收入國家藥品標準的以芭蕉根為原料開發(fā)的制劑品種骨康膠囊、腫痛舒噴霧劑具有滋補肝腎，強筋壯骨，通絡止痛之功效的功效，用于治療骨質(zhì)疏松、骨折、跌打損傷、瘀血腫痛等癥時療效顯著。有關芭蕉根促成骨細胞增殖的研究目前未見報道，因此該實驗于2018年6月—2019年1月選擇人成骨肉瘤細胞株SaOS-2， 觀察芭蕉根提取物的各個組分對成骨細胞增殖及分化的影響，篩選芭蕉根促成骨細胞增殖及分化的有效組分，探討其可能的作用機制，皆在為臨床應用提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 ?資料與方法

1.1 ?一般資料

人成骨肉瘤細胞SaOS-2，購自中科院上海細胞庫。芭蕉根藥材經(jīng)貴州醫(yī)科大學中藥標本館龍慶德教授鑒定鑒定為芭蕉Musa basjoo Sied.et Zucc.的干燥根莖。

1.2 ?主要試劑

McCOYs 5A 培養(yǎng)基（批號2018-16）;胎牛血清（批號：NZE3158）;噻唑藍（批號：M8345）;維生素D3注射液（批號：20180361）;堿性磷酸酶試劑盒（批號20180120）;鈣離子試劑盒（批號A038-4）;骨鈣素試劑盒（批號G053-9）。

1.3 ?方法

1.3.1 ?芭蕉根組分的制備 ?芭蕉根500 g，分別加10倍、8倍、8倍70%乙醇回流提取3次，每次2 h，過濾，合并濾液，回收乙醇并濃縮至浸膏。浸膏加蒸餾水制成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各個萃取液，剩余的水部分回收溶劑，揮干，干燥分別得A、B、C、D組分。

1.3.2 ?細胞增殖檢測 ?取對數(shù)生長期的SaOS-2細胞 以1×104個/孔將接種于96孔板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后?？瞻讓φ战M加不含藥培養(yǎng)基，藥物組每孔加入濃度為100 mg/L的各組分100 μL，陽性對照組為含30 mg/L維生素D3的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用噻唑藍在酶標儀在490 nm波長處檢測各組吸光度值。

1.3.3 ?ALP含量檢測 ?取對數(shù)生長期的SaOS-2細胞 以1×105個/孔將接種于24孔板中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后?？瞻讓φ战M加不含藥培養(yǎng)基，藥物組每孔加入濃度為100 mg/L的各組分100 μL，陽性對照組為含30 mg/L維生素D3的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明書測定ALP的含量。

1.3.4 ?Ca2+、BGP含量檢測 ?取對數(shù)生長期的SaOS-2細胞 以1×105個/孔將接種于24孔板中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后?？瞻讓φ战M加不含藥培養(yǎng)基，藥物組每孔加入濃度為100 mg/L的各組分100 μL，陽性對照組為含30 mg/L維生素D3的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明書測定Ca2+、BGP的含量。

1.4 ?統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料以（x±s）表示， 組間采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?對細胞增殖的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均可顯著促進細胞的增殖（P<0.05），分別使細胞增殖16.74%、5.57%、10.02%。見表1。

2.2 ?對ALP含量的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均能顯著升高細胞中 ALP的含量，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.005），分別增加58.11%、21.45%、39.57%，其中B組分使細胞中 AL含量升高至（1479.48±45.87）U/g，見表2。

2.3 ?對Ca2+、BGP含量的影響

結(jié)果顯示，與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均能顯著促進細胞內(nèi)Ca2+的分泌、升高細胞中BGP 的含量（P<0.01），其中B組分使細胞中Ca2+、BGP的含量分別升高至（179.61±16.83）μg/L和（19.15±3.07）μg/L，見表3。

3 ?討論

芭蕉根作為民間常用藥材，用于治療骨質(zhì)疏松、骨折等疾病，在臨床上發(fā)揮了較好的治療作用。芭蕉根含有蒽醌、皂苷、香豆素、多糖、黃酮、揮發(fā)油等化學成分[3-7]，具有抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖及α -葡萄糖苷酶抑制等多種藥理活性[8-10]，到目前為止，芭蕉根促成骨細胞增殖的研究基本上屬于空白。由于物質(zhì)基礎的不明確使得臨床上所有含有芭蕉根的藥物多為復方。缺乏芭蕉根有效組分/成分的研究，就缺乏對癥用藥的客觀、科學的依據(jù)，難以保證芭蕉根相關藥品的臨床藥效，嚴重制約了芭蕉根在防治骨科方面疾病作用的充分發(fā)揮以及相關產(chǎn)品的深度開發(fā)。

骨質(zhì)疏松癥是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)為特征，導致骨質(zhì)脆性增加和骨量流失的全身性骨代謝疾病。骨質(zhì)疏松多見于老年人及絕經(jīng)后的婦女，是現(xiàn)今社會面臨的醫(yī)療問題之一。目前的治療藥物主要有降鈣素、雌激素、羅鈣全、鈣制劑等。但大多存在著食欲減退、敏、惡心、頭昏等不良反應，且一旦停藥，會導致骨質(zhì)流失速度加快。中草藥抗骨質(zhì)疏松具有獨特的優(yōu)勢，既有強筋壯骨的、消腫止痛作用，又具備免疫調(diào)節(jié)效應，具有遠期療效好、副作用小等優(yōu)點。因此，從中草藥中研究發(fā)現(xiàn)抗骨質(zhì)疏松的藥效物質(zhì)，對抗骨質(zhì)疏松新藥的研發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義和科學價值。

ALP是成骨細胞分泌的一種外酶，可以破壞鈣化抑制劑，使得鈣和磷可與膠原分子的膠原氨基酸殘基相結(jié)合，從而加強成骨細胞的鈣化功能，因此它的表達是成骨細胞增殖分化的一個明顯特征[11-15]。因此，該實驗考察了芭蕉根不同組分對SaOS-2細胞中ALP含量的影響。結(jié)果顯示， 與空白對照組比較，藥物B、C、D組分均可顯著升高細胞中 ALP的含量（P <0.005），分別使細胞中 ALP的含量增加58.11%、21.45%、39.57%。Ca2+是細胞內(nèi)第二信使，在成骨細胞中發(fā)揮了至關重要的作用，成骨細胞的活性與成骨細胞內(nèi)鈣Ca2+濃度呈正相關，即Ca2+濃度的上升直接促進成骨細胞的增殖、分化[16-17]。BGP是成骨細胞分化時所分泌的一種非膠原蛋白質(zhì)， 是成骨細胞的特異性產(chǎn)物，為人體骨骼所釋放的一種激素， 由49個氨基酸構(gòu)成， 具有維持骨的正常礦化速率的作用，主要反映成骨細胞功能水平，特別是新形成的成骨細胞的活動狀態(tài)[18-19]。因此，檢測藥物對Ca2+及BGP的影響可反應藥物促成骨細胞增殖及分化的能力。該研究結(jié)果顯示， 藥物B、C、D組分均能顯著促進細胞內(nèi)Ca2+的分泌、升高細胞中BGP 的含量（P<0.01），其中B組分的作用最顯著。

該課題采用溶劑提取法對芭蕉根乙醇粗提取物，并通過水提醇沉和傳統(tǒng)的萃取方法，獲得芭蕉根A、B、C、D不同組分，且各組分通過高效液相色譜分析檢測顯示各個組分化學成分基本無明顯交叉，表明組分制備合理。該研究結(jié)果顯示B組分升高成骨細胞中 ALP、Ca2+、BGP含量的作用最顯著，推測芭蕉根B組分促成骨細胞增殖與分化的作用可能與其所富含的蒽醌、黃酮類化合物有關，而其有效成分還有待進一步的化學成分分離以及活性研究，以進一步闡明芭蕉根治療骨科疾病的藥效物質(zhì)基礎。

綜上所述，B組分為芭蕉根促成骨細胞增殖及分化的有效組分，該結(jié)果提示芭蕉根B組分可能通過升高細胞內(nèi)ALP、Ca2+的含量、促進BGP的分泌從而促成骨細胞增殖及分化。

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（收稿日期：2019-03-29）