徐盛春，鄭華章，馮志娟，劉娜，張古文，胡齊贊，龔亞明*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，杭州 310021；2.余姚市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)總站，浙江 余姚 315400）

豌豆（Pisum sativumL.）為二倍體（2n＝2x＝14）豆科植物，是世界第二大食用豆類作物[1]。菜用豌豆，也稱甜豌豆，屬豌豆的專用型品種，主食嫩莢和籽粒，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，深受消費(fèi)者喜愛。據(jù)統(tǒng)計，我國菜用豌豆產(chǎn)品遠(yuǎn)銷日本、美國、歐洲等地，市場前景廣闊。然而，目前菜用豌豆專用品種缺乏，結(jié)構(gòu)單一，已影響了菜用豌豆整體產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步提升，生產(chǎn)上亟須優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)菜用豌豆新品種來支撐該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而品種選育的重要基礎(chǔ)是豐富的種質(zhì)材料，因此，對菜用豌豆種質(zhì)資源搜集、鑒定與保存已成為育種工作者的重要工作內(nèi)容之一。

我國具有豐富的豌豆種質(zhì)資源，目前已知的達(dá)5 000余份[2]，并隨著新種質(zhì)的不斷發(fā)掘，豌豆種質(zhì)資源規(guī)模日益龐大，給其保存、評價、研究和利用帶來了諸多困難，影響了育種效率。因此，構(gòu)建豌豆核心種質(zhì)成了研究和利用其遺傳資源的便捷途徑，對豌豆核心種質(zhì)的研究也日益受到重視[3]。然而，與其他作物相比，對豌豆核心種質(zhì)的研究仍較少，特別是針對菜用豌豆類型的核心種質(zhì)構(gòu)建及評價方法尚未見報道。

核心種質(zhì)構(gòu)建的主要目的是以盡可能少的種質(zhì)數(shù)量，最大限度地代表整個種質(zhì)群體的遺傳多樣性[4]；通過對核心種質(zhì)的優(yōu)先評價和利用，可提高整個種質(zhì)資源庫的管理和利用水平[5]。然而，目前核心種質(zhì)構(gòu)建方法仍處于不斷摸索與完善中[6-9]，主要有實(shí)測群體農(nóng)藝性狀和計算機(jī)模擬群體2大類。雖然計算機(jī)模擬在成本節(jié)省方面具有一定優(yōu)勢，但實(shí)測群體性狀數(shù)據(jù)在遺傳多樣性方面則更具優(yōu)勢，可真實(shí)展現(xiàn)表型性狀[10-12]。因此，本研究基于菜用豌豆田間實(shí)測群體農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)，進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建方法研究，確定適合菜用豌豆種質(zhì)資源群體的核心種質(zhì)構(gòu)建策略，以期為大規(guī)模開展其種質(zhì)資源研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用180份菜用豌豆種質(zhì)材料，選擇肥水條件一致地塊進(jìn)行播種，每份種質(zhì)材料隨機(jī)播種5 m2，行距60 cm，株距30 cm，每穴播種3粒；田間統(tǒng)一管理，鮮莢采收期每份種質(zhì)隨機(jī)選擇10株進(jìn)行產(chǎn)量性狀測定，包括單株莢數(shù)、每莢粒數(shù)、豆莢長、豆莢寬、豆莢厚、百莢鮮質(zhì)量、百粒鮮質(zhì)量及產(chǎn)量，所測數(shù)據(jù)用于后續(xù)核心種質(zhì)構(gòu)建。

1.2 核心種質(zhì)構(gòu)建方法

采用最小距離逐步取樣（least distance stepwise sampling,LDSS）法構(gòu)建核心種質(zhì)[13]。首先，根據(jù)取樣比例計算核心樣品規(guī)模；然后，計算群體內(nèi)各種質(zhì)樣本間的遺傳距離并進(jìn)行聚類分析，尋找遺傳距離最小的組，并隨機(jī)保留一個樣本進(jìn)入下一輪聚類，其余樣品去除。對保留的樣本重新計算遺傳距離并進(jìn)行聚類分析，用同樣的方法對群體進(jìn)行縮減。繼續(xù)循環(huán)聚類，直到剩余樣本數(shù)達(dá)到取樣比例規(guī)定的規(guī)模，以此構(gòu)成核心種質(zhì)群體。

1.3 遺傳距離和聚類方法選擇

本試驗(yàn)選擇5種常用的距離計算方法計算樣本間的遺傳距離，分別為：歐氏距離（Euclidean distance）、馬氏距離（Mahalanobis distance）、曼哈頓距離（city block distance）、夾角余弦距離（cosine distance）和相關(guān)系數(shù)距離（correlation coefficient distance）。采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group average method）進(jìn)行聚類，以從原始群體中按一定比例完全隨機(jī)選取核心樣本組成的核心種質(zhì)作為對照。

1.4 核心種質(zhì)代表性評價

采用極差符合率（coincidence rate of range,CR）和變異系數(shù)變化率（variable rate of coefficient of variation,VR）2個較為有效的常用參數(shù)評價核心種質(zhì)的代表性。計算公式[14]如下。其中：n是數(shù)量性狀總數(shù)，RC(i)是核心種質(zhì)第i個性狀的極差，RI(i)是原始群體第i個性狀的極差。，其中：n是數(shù)量性狀總數(shù)，CVC(i)是核心種質(zhì)第i個性狀的變異系數(shù)，CVI(i)是原始群體第i個性狀的變異系數(shù)。

評價標(biāo)準(zhǔn)[14]為：極差符合率不小于80%，核心種質(zhì)才有代表性。在相同取樣比例下，極差符合率和變異系數(shù)變化率越大，核心種質(zhì)的代表性越強(qiáng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用MATLAB環(huán)境下的編程，對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜用豌豆產(chǎn)量性狀鑒定與數(shù)據(jù)搜集

對參試的180份菜用豌豆種質(zhì)樣本分別進(jìn)行產(chǎn)量數(shù)據(jù)鑒定，對單株莢數(shù)、每莢粒數(shù)、莢長、莢寬、莢厚、百莢鮮質(zhì)量、百粒鮮質(zhì)量及產(chǎn)量等性狀進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果（表1）顯示，各種質(zhì)材料間的生物學(xué)性狀差異顯著，其中單株莢數(shù)和百莢鮮質(zhì)量2個指標(biāo)的變異范圍最大，最高值與最低值相差近2倍。而莢長變異范圍最小，但最大值與最小值相比，仍高出17%左右。上述結(jié)果表明，該批豌豆材料遺傳多樣性豐富，可有效用于核心種質(zhì)構(gòu)建策略研究。

表1 180份菜用豌豆種質(zhì)田間性狀Table 1 Field characters of 180 vegetable pea germplasms

2.2 不同遺傳距離和取樣比例下菜用豌豆核心種質(zhì)代表性研究

以上述菜用豌豆種質(zhì)材料為樣本，利用最小距離逐步取樣法（LDSS），分別采用不同遺傳距離（歐氏距離、馬氏距離、曼哈頓距離、夾角余弦距離和相似系數(shù)距離）和取樣比例（5%～40%）進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建，以評價其代表性。結(jié)果表明：在5個不同遺傳距離計算條件下，核心種質(zhì)隨著菜用豌豆群體取樣比例的增大，均表現(xiàn)為CR逐漸增大，趨近于100%；用歐氏距離、馬氏距離和曼哈頓距離構(gòu)建的核心種質(zhì)，隨取樣比例的增大，VR總體上呈逐漸減小的趨勢（表2）。在相同取樣比例下，用歐式距離構(gòu)建的核心種質(zhì)的CR和VR最高（極個別除外）；在25%取樣比例下，用歐式距離構(gòu)建的核心種質(zhì)的CR已超過95%。

2.3 核心種質(zhì)不同構(gòu)建策略比較

為進(jìn)一步了解LDSS方法在歐式距離下構(gòu)建核心種質(zhì)的合理性與代表性，將其與完全隨機(jī)法策略構(gòu)建的核心種質(zhì)比較，兩者均采用25%取樣比例。將上述2種策略構(gòu)建的核心種質(zhì)分別進(jìn)行主成分分析，以第1主成分和第2主成分為坐標(biāo)軸繪出各樣品在群體中的分布圖（圖1）。結(jié)果表明：LDSS方法結(jié)合歐式距離在25%取樣比例下抽取的核心樣品均勻分布于整個群體中，且大部分極端或特殊性狀的種質(zhì)材料入選了核心種質(zhì)群體；采用完全隨機(jī)法在同樣比例下構(gòu)建核心種質(zhì)不僅表現(xiàn)為核心樣品分布不均，而且大部分極端樣品均未入選核心種質(zhì)。因此，LDSS方法結(jié)合歐式距離在25%取樣比例下構(gòu)建的核心種質(zhì)具有更好的代表性。為進(jìn)一步了解核心種質(zhì)所代表的原始群體特征，對LDSS法結(jié)合歐式距離在25%取樣比例下的菜用豌豆核心種質(zhì)及其所代表的原始群體分別進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的核心種質(zhì)并未改變原始群體結(jié)構(gòu)特征（圖2）。因此認(rèn)為，LDSS方法結(jié)合歐式距離在25%取樣比例下構(gòu)建的核心種質(zhì)是合理的。

3 討論

近年來，菜用豌豆日益受到國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛，但由于目前所選用的親本遺傳基礎(chǔ)狹窄，較難取得重大突破，致使其育種進(jìn)程緩慢，制約了豌豆產(chǎn)量和品質(zhì)的進(jìn)一步提高。因此，增加豌豆種質(zhì)資源遺傳多樣性成為重要措施。但面對不斷增加的種質(zhì)材料，如何對其進(jìn)行保存和有效利用，同樣對育種工作者提出了挑戰(zhàn)。因此，利用適宜構(gòu)建策略獲得的核心種質(zhì)庫，可為育種者提供有效的代表種質(zhì)，提高育種效率。核心種質(zhì)構(gòu)建策略主要包括取樣方法、取樣比例、評價方法等[15]，因作物不同、取樣方法不同，其代表性存在差異[16-20]，至今尚未形成一套明確的構(gòu)建理論以應(yīng)用于各類作物中。本研究針對豌豆群體遺傳背景復(fù)雜這一特點(diǎn)，采用LDSS方法取樣，以最大限度地去除原始群體中冗余和遺傳背景相近的材料，從而構(gòu)建出代表性強(qiáng)的核心種質(zhì)。

表2 菜用豌豆核心種質(zhì)評價參數(shù)比較Table 2 Comparison of evaluation parameters of core germplasm for vegetable pea

A.LDSS方法結(jié)合歐式距離在25%取樣比例下構(gòu)建的核心種質(zhì)；B.完全隨機(jī)法在25%取樣比例下構(gòu)建的核心種質(zhì)。A.Core germplasms with Euclidean distance combining 25%sampling ratio based on LDSS method;B.Core germplasms with 25%sampling ratio based on completely random method.

圖2 菜用豌豆原始群體和核心種質(zhì)聚類圖Fig.2 Cluster map of the original and core germplasms of vegetable pea

核心種質(zhì)構(gòu)建質(zhì)量往往受到遺傳距離影響。用歐式距離構(gòu)建核心種質(zhì)的有效性已在大豆[21]、郁金香[22]等植物上得到驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)，基于歐式距離構(gòu)建的核心種質(zhì)，在極差符合率和變異系數(shù)變化率上均優(yōu)于馬氏距離、曼哈頓距離、夾角余弦距離和相似系數(shù)距離等4類遺傳距離，與前期研究[21]一致。同時，合理的抽樣比例也是核心種質(zhì)構(gòu)建的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)前，抽樣比例研究的主要范圍為5%～10%[2-3]，但此類策略容易在一些作物中遺漏最佳取樣比例，鑒于此，本試驗(yàn)擴(kuò)大取樣比例范圍，為5%～40%。結(jié)果表明，采用LDSS方法結(jié)合歐式距離構(gòu)建的菜用豌豆核心種質(zhì)群體，在10%取樣比例下，其極差符合率均已超過80%，可以認(rèn)為已經(jīng)構(gòu)建了有代表性的核心種質(zhì)[14]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在取樣比例較小時，隨著取樣比例的升高，核心種質(zhì)的極差符合率急劇升高。然而，在取樣比例達(dá)到25%以后，極差符合率和變異系數(shù)變化率的變化開始減小。因此，本研究認(rèn)為，選擇25%作為最佳取樣比例，既能夠保證核心種質(zhì)的高代表性，又兼顧了保存核心種質(zhì)的經(jīng)濟(jì)性。主成分分析也表明：LDSS方法結(jié)合歐式距離在25%取樣比例下構(gòu)建核心種質(zhì)，核心樣品均勻分布于整個遺傳資源群體中；同時，又極大程度地保留了極端性狀的樣品入選為核心種質(zhì)。這類極端性狀材料往往可為菜用豌豆遺傳改良和優(yōu)勢基因挖掘提供種質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

根據(jù)上述結(jié)果，我們認(rèn)為，采用LDSS方法構(gòu)建菜用豌豆核心種質(zhì)的最佳遺傳距離為歐式距離，最佳取樣比例為25%。本研究所獲得的結(jié)果可以有效地構(gòu)建菜用豌豆核心種質(zhì)庫，優(yōu)化菜用豌豆種質(zhì)利用率，從而加快新品種選育進(jìn)程。