陳秋森，陳鳳瓊，劉漢林，褚霈宇，王華美，任春元，趙強(qiáng)，曹亮，于高波，張玉先

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶,163319）

菜用大豆又稱毛豆，是豆科大豆屬的栽培大豆種，屬于特用大豆[1,2]。作為世界上最大的菜用大豆生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，中國(guó)的菜用大豆栽培面積不斷增加，其病蟲(chóng)害也頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響了我國(guó)菜用大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[3,4]。目前防治病蟲(chóng)害的有效方式仍以施用農(nóng)藥為主。然而，由于菜用大豆是采收鮮莢，直接剝粒食用，農(nóng)藥的不當(dāng)使用會(huì)給人們的身體健康帶來(lái)巨大的隱患，同時(shí)對(duì)生態(tài)環(huán)境也有不利影響[5]，各國(guó)對(duì)菜用大豆農(nóng)藥殘留也都有嚴(yán)格要求[6]。因此，減少菜用大豆的農(nóng)藥殘留已成為保障菜用大豆產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全的基本要求，同時(shí)也是提高菜用大豆出口合格率的重要措施。

多菌靈和百菌清是常見(jiàn)的殺菌劑，可有效防治菜用大豆灰斑病、莢枯病、根腐病等真菌性病害的發(fā)生，廣泛應(yīng)用于菜用大豆的生產(chǎn)[7]，然而過(guò)量或不合理使用多菌靈和百菌清極易造成菜用大豆的農(nóng)藥殘留問(wèn)題。因此，降低菜用大豆中多菌靈和百菌清殘留在大豆生產(chǎn)中具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。

褪黑素是一種廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的多效性分子[8]，在干旱、低溫、鹽堿等非生物脅迫中均具有積極的調(diào)控作用[9]。近年來(lái)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素在降解植物農(nóng)藥殘留中也具有重要作用。陳媛媛等[10]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠緩解甜瓜幼苗三唑酮毒害的生理效應(yīng)。而Wei 等[11]研究也表明，褪黑素處理還可以提高蘋(píng)果對(duì)百草枯的耐受性。此外，近年來(lái)表達(dá)褪黑素合成相關(guān)基因被認(rèn)為可提高植物抗逆性，在擬南芥、水稻、番茄等植物中均已得到驗(yàn)證[12～14]。但是關(guān)于褪黑素對(duì)菜用大豆殘留殺菌劑的降解是否具有調(diào)控效應(yīng)鮮有報(bào)道。因此，本研究以菜用大豆為材料，以多菌靈和百菌清為殺菌劑，探究外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆殘留殺菌劑降解的調(diào)控效應(yīng)，以期為后續(xù)大豆農(nóng)藥殘留降解的研究和促進(jìn)殘留農(nóng)藥代謝試劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜用大豆品種浙鮮12，由國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心提供；褪黑素（C13H16N2O2），購(gòu)自Sigma Aldrich公司。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心人工氣候室進(jìn)行，盆栽，基質(zhì)為草炭土和蛭石（3∶1），播種前選取色澤均勻、顆粒飽滿、大小一致的種子，用5%的次氯酸鈉消毒，于2020 年5 月6 日進(jìn)行播種，播種后常規(guī)管理。待菜用大豆生長(zhǎng)至R3 期（初莢期，2020年7月3日）進(jìn)行處理與取樣。

將植株隨機(jī)分為4組：①百菌清處理：使用蒸餾水連續(xù)噴施3 d，第4 d噴施有效濃度為11.2 mmol/L的百菌清；②百菌清+褪黑素處理：100μmol/L 褪黑素進(jìn)行葉面噴施，連續(xù)處理3 d，第4 d噴施有效濃度為11.2 mmol/L 的百菌清；③多菌靈處理：使用蒸餾水連續(xù)噴施3 d，第4 d噴施有效濃度為13.1 mmol/L的多菌靈；④多菌靈+褪黑素處理：100μmol/L 的褪黑素進(jìn)行葉面噴施，連續(xù)處理3 d，第4 d噴施有效濃度為13.1 mmol/L 的多菌靈溶液。于殺菌劑處理24 h 后取樣，部分保存于-20℃，用于生理生化指標(biāo)的測(cè)定，部分保存于-80℃，用于基因表達(dá)量的測(cè)定。農(nóng)藥處理7 d 后取樣，-20℃保存用于測(cè)定農(nóng)藥殘留量。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 農(nóng)藥殘留量 參照任曉萍等[15]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中百菌清殘留量，參照郝露露等[16]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中多菌靈殘留量。

1.3.2 氧化損傷指標(biāo) 采用硫代巴比妥酸法[17]測(cè)定菜用大豆葉片中丙二醛（MDA）含量，參考劉俊等[18]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中過(guò)氧化氫（H2O2）含量。

1.3.3 抗氧化系統(tǒng) 采用比色法[19]測(cè)定菜用大豆葉片中的抗壞血酸（AsA）含量，參考Ma 等[20]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中的還原型谷胱甘肽（GSH）含量，采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性，采用紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性[21]。1.3.4 解毒系統(tǒng) 參考Sharma 等[22]的方法測(cè)定菜用大豆葉片中的非蛋白結(jié)合態(tài)巰基（NPT）含量，采用試劑盒方法測(cè)定（購(gòu)自睿信生物科技有限公司）ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定菜用大豆葉片中解毒相關(guān)基因（P450、GST22和ABC-C3）表達(dá)量[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用利用SPSS 21.0 軟件對(duì)各處理間顯著性進(jìn)行分析，最終利用Origin 2019軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)農(nóng)藥殘留量的影響

如圖1A 所示，經(jīng)褪黑素預(yù)處理后，菜用大豆葉片中多菌靈和百菌清殘留量均顯著降低。其中百菌清殘留量為單獨(dú)農(nóng)藥處理的56%，多菌靈殘留量為單獨(dú)農(nóng)藥處理的84%。非蛋白結(jié)合態(tài)巰基（NPT）主要包括谷胱甘肽及其共軛物和代謝產(chǎn)物。如圖1B 所示，與單獨(dú)多菌靈和百菌清處理相比，外源褪黑素預(yù)處理后菜用大豆葉片中NPT 含量均顯著上升，說(shuō)明外源褪黑素處理有效地促進(jìn)菜用大豆中NPT的形成，增強(qiáng)多菌靈和百菌清的降解代謝，減少菜用大豆體內(nèi)的農(nóng)藥殘留含量。

圖1 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中農(nóng)藥殘留量（A）和NPT含量（B）Fig.1 Pesticide residue（A）and NPT content（B）under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

2.2 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)GSH-AsA途徑的影響

外源褪黑素處理影響菜用大豆葉片中GSH 和AsA的含量（圖2）。在多菌靈和百菌清處理下，外源褪黑素預(yù)處理可顯著提高菜用大豆中GSH（圖2A）和AsA（圖2B）含量。其中，與單獨(dú)百菌清處理相比，褪黑素預(yù)處理后菜用大豆中GSH和AsA含量分別上升24.1%和72.5%；與單獨(dú)多菌靈處理相比，褪黑素預(yù)處理后菜用大豆中GSH和AsA含量分別上升40.5%和34.7%。由此可見(jiàn)，外源褪黑素處理可以通過(guò)提高GSH和AsA含量促進(jìn)GSH-AsA循環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)菜用大豆中殘留多菌靈和百菌清的降解。

圖2 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中GSH（A）和AsA含量（B）Fig.2 GSH（A）and AsA content（B）under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

2.3 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

外源褪黑素預(yù)處理可顯著提高菜用大豆葉片中抗氧化酶活性（圖3）。與單獨(dú)百菌清處理相比，褪黑素預(yù)處理后菜用大豆葉片中SOD 活性（圖3A）和CAT 活性（圖3C）均顯著上升，且分別上升14.5%和25.4%，而菜用大豆中POD 活性卻有所下降（圖3B），APX活性則無(wú)顯著性差異（圖3D）；與單獨(dú)多菌靈處理相比，預(yù)處理褪黑素后菜用大豆中SOD、POD、CAT 和APX 活性均顯著上升，其中SOD 活性提高最為顯著，比單獨(dú)多菌靈處理提高了4.5倍（圖3A），其次為POD 活性，比單獨(dú)多菌靈處理提高了102.2%（圖3B），而CAT 活性和APX 活性則分別提高了92.3%和38.7%（圖3C、D）。由此可見(jiàn)，外源噴施褪黑素可顯著增強(qiáng)菜用大豆中抗氧化酶活性，促進(jìn)活性氧的清除，進(jìn)而緩解農(nóng)藥處理造成的細(xì)胞損傷，降低菜用大豆體內(nèi)的農(nóng)藥殘留。

圖3 外源褪黑素處理下菜用大豆葉片中抗氧化酶活性Fig.3 Antioxidant enzyme activitiesunder exogenous melatonin treatment onvegetable soybean leaves

2.4 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)MDA 和H2O2含量的影響

外源褪黑素預(yù)處理對(duì)菜用大豆葉片中MDA 和H2O2含量的影響如圖4所示。在多菌靈和百菌清處理下，通過(guò)外源褪黑素預(yù)處理可顯著降低菜用大豆中MDA 含量（圖4A）。與單獨(dú)百菌清和多菌靈處理相比，預(yù)處理褪黑素可使菜用大豆中MDA含量分別降低了8.5%和8.9%?？梢?jiàn)外源褪黑素處理可以通過(guò)降低菜用大豆中MDA含量，從而抑制細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度的增加，緩解農(nóng)藥脅迫下菜用大豆細(xì)胞受到的損傷。此外，外源褪黑素預(yù)處理后，大豆體內(nèi)H2O2含量也顯著性降低（圖4B），與單獨(dú)百菌清處理相比，外源褪黑素預(yù)處理使菜用大豆體內(nèi)H2O2含量降低13.6%，與單獨(dú)多菌靈處理相比，預(yù)處理褪黑素使菜用大豆體內(nèi)H2O2含量降低8.0%。這說(shuō)明外源褪黑素處理可通過(guò)直接清除菜用大豆體內(nèi)活性氧來(lái)緩解農(nóng)藥對(duì)植株造成的氧化損傷，進(jìn)而促進(jìn)大豆體內(nèi)殘留農(nóng)藥的降解代謝。

圖4 外源褪黑素處理后菜用大豆葉片中MDA（A）和H2O2（B）含量Fig.4 MDA（A）and H2O2（B）contents under exogenous melatonin treatment on vegetable soybean leaves

2.5 外源褪黑素處理對(duì)菜用大豆體內(nèi)解毒系統(tǒng)的影響

細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物體內(nèi)重要的解毒酶，可以有效緩解農(nóng)藥處理對(duì)植物造成的損傷。外源褪黑素預(yù)處理影響菜用大豆體內(nèi)解毒系統(tǒng)（圖5）。經(jīng)外源褪黑素預(yù)處理后，菜用大豆葉片中解毒基因表達(dá)量顯著上升。與單獨(dú)百菌清處理相比，預(yù)處理褪黑素后菜用大豆葉片中P450和GST22的相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào)，其中P450相關(guān)基因表達(dá)量為單獨(dú)百菌清處理的14.5倍（圖5A），GST22相關(guān)基因表達(dá)量為單獨(dú)百菌清處理的1.3 倍（圖5B）。而ABC-C3相關(guān)基因表達(dá)量經(jīng)褪黑素預(yù)處理后反而低于單獨(dú)百菌清處理（圖5C），為此我們測(cè)定了菜用大豆葉片中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性進(jìn)行驗(yàn)證（圖5D），其結(jié)果與相關(guān)基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。與單獨(dú)多菌靈處理相比，外源褪黑素預(yù)處理后菜用大豆葉片中P450、GST22和ABC-C3相關(guān)基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，且分別比單獨(dú)多菌靈處理上調(diào)了182.2%、141.9%和413.4%（圖5A、B、C），此外，經(jīng)褪黑素預(yù)處理后ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性也比單獨(dú)多菌靈處理提高了36.2%（圖5D）。由此可見(jiàn)，外源褪黑素處理可調(diào)控菜用大豆中解毒基因的表達(dá)，進(jìn)而提高解毒酶活性，促進(jìn)菜用大豆體內(nèi)多菌靈和百菌清的代謝，從而降解菜用大豆中的農(nóng)藥殘留。

圖5 外源褪黑素處理后菜用大豆解毒系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.5 Expression of genes related to detoxification system of vegetable soybean treated with exogenous melatonin

3 討論

對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，農(nóng)藥是一種異源物質(zhì)，高劑量的農(nóng)藥導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（ROS）的過(guò)量產(chǎn)生，這些活性氧具有高度的活性和毒性，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[24]。Kanwar等[25]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理使番茄中的活性氧含量顯著降低，提高了作物對(duì)雙酚A 的解毒作用。在本研究中，預(yù)處理外源褪黑素降低了殺菌劑處理下菜用大豆中H2O2的含量，從而緩解了殺菌劑對(duì)菜用大豆造成的細(xì)胞毒性?？梢?jiàn)外源褪黑素處理可通過(guò)直接清除菜用大豆體內(nèi)的活性氧，從而有效緩解農(nóng)藥處理對(duì)菜用大豆造成的氧化損傷，提高菜用大豆對(duì)農(nóng)藥的耐受性。同時(shí)，在外源褪黑素處理下，菜用大豆中MDA 含量也顯著降低，說(shuō)明外源褪黑素可有效抑制菜用大豆的膜脂過(guò)氧化，降低農(nóng)藥處理對(duì)菜用大豆造成的細(xì)胞損傷。

植物細(xì)胞及其細(xì)胞器如葉綠體、線粒體和過(guò)氧化物酶體等通過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)保護(hù)自身免受活性氧的傷害。植物的抗氧化防御系統(tǒng)包括非酶抗氧化劑和抗氧化酶[26]。AsA-GSH 循環(huán)是非酶抗氧化劑防御的主要途徑，它們不僅可以直接清除一定范圍的ROS，而且在細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞器中維持氧化還原狀態(tài)，從而增強(qiáng)抗氧化能力，并減少由不同的非生物脅迫引起的氧化應(yīng)激[27]。Fatma 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，芥菜中AsA、GSH 含量提高可通過(guò)清除活性氧緩解鹽脅迫帶來(lái)的傷害；Xia 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理可以誘導(dǎo)干旱脅迫下獼猴桃中的AsAGSH 循環(huán)。在本研究中，多菌靈和百菌清處理下，外源褪黑素處理可以顯著提高菜用大豆中GSH 和AsA 含量，說(shuō)明外源褪黑素處理可以通過(guò)調(diào)節(jié)AsA-GSH 循環(huán)清除菜用大豆體內(nèi)活性氧，從而減少菜用大豆在農(nóng)藥處理下受到的傷害，降低農(nóng)藥殘留量。

逆境脅迫下，植物體內(nèi)的抗氧化酶活性顯著增強(qiáng)，SOD、POD、CAT 和APX 是植物酶促防御系統(tǒng)的四種重要抗氧化酶，能有效分解活性氧自由基，從而減少植物在逆境脅迫中受到的傷害[30]。Li 等[31]研究表明，外源褪黑素處理可以提高鹽脅迫下西瓜體內(nèi)的抗氧化酶活性；張明聰?shù)萚32]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理可以提高干旱脅迫下大豆體內(nèi)的抗氧化酶活性。在本研究中，外源褪黑素處理顯著提高了多菌靈處理下菜用大豆中4 種抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）的活性，并且顯著提高了百菌清處理下菜用大豆中SOD 和CAT 的活性，從而促進(jìn)了活性氧的清除，緩解了菜用大豆在多菌靈和百菌清處理中受到的傷害，促進(jìn)了殘留百菌清和多菌靈的降解。

褪黑素作為一種多效性分子，在植物體內(nèi)廣泛存在，可有效緩解植物面臨的多種非生物脅迫[33]。近年來(lái)，褪黑素在降解植物農(nóng)藥殘留中的作用引起了科研人員的廣泛研究。Ding 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理可以有效提高楊樹(shù)對(duì)甲基紫精的耐受性，而Liu 等[35]研究也發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理可有效降低黃瓜中吡蟲(chóng)啉的殘留量。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物遭受農(nóng)藥脅迫時(shí)，激活自身解毒機(jī)制以緩解脅迫帶來(lái)的損傷[36]。植物的解毒過(guò)程可分為三個(gè)階段。第一階段是由細(xì)胞色素P450 催化的酶促反應(yīng)及非酶過(guò)程；第二階段主要是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）與糖基轉(zhuǎn)移酶等的軛合反應(yīng)；在第三階段，代謝產(chǎn)物在ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控下被進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)外[37,38]。Yuan 等[39]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450 是生物體內(nèi)的重要代謝酶，能夠降解大多數(shù)外源有毒物質(zhì)；而李冬琴等[40]研究證明，水稻中GST活性提高有利于緩解鎘脅迫帶來(lái)的傷害；此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以提高植物對(duì)草甘膦的抗性[41]。本試驗(yàn)中，在百菌清處理下，外源褪黑素預(yù)處理可以顯著提高菜用大豆中P450、GST的相關(guān)基因表達(dá)量，但菜用大豆中ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因表達(dá)量經(jīng)褪黑素預(yù)處理后反而有所降低，因此，我們對(duì)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶活性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與ABC 相關(guān)基因表達(dá)量趨勢(shì)一致。而在多菌靈處理下，經(jīng)外源褪黑素預(yù)處理后菜用大豆中P450、GST、ABC的相關(guān)基因表達(dá)量均顯著提高。這說(shuō)明百菌清處理下，外源褪黑素處理可以通過(guò)誘導(dǎo)一相和二相解毒相關(guān)基因的表達(dá)以促進(jìn)菜用大豆中殘留百菌清的降解；而在多菌靈處理下，外源褪黑素處理則可以通過(guò)誘導(dǎo)菜用大豆解毒過(guò)程三個(gè)階段的相關(guān)基因表達(dá)以促進(jìn)其殘留多菌靈的降解。本研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)外源褪黑素處理，菜用大豆中NPT 含量顯著上升，促進(jìn)了菜用大豆體內(nèi)殺菌劑的降解，有效降低了菜用大豆中多菌靈和百菌清的殘留量。這一結(jié)果與Liu 等研究發(fā)現(xiàn)的外源褪黑素可有效降低黃瓜中吡蟲(chóng)啉殘留量的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

外源褪黑素處理可以直接清除菜用大豆體內(nèi)的活性氧，緩解殺菌劑處理對(duì)菜用大豆的細(xì)胞損傷，也可以通過(guò)提高菜用大豆中GSH-AsA含量和抗氧化酶活性，從而促進(jìn)活性氧的清除，增強(qiáng)菜用大豆中殘留百菌清和多菌靈的代謝。與此同時(shí)，在多菌靈和百菌清處理下，外源褪黑素預(yù)處理還可以通過(guò)誘導(dǎo)解毒相關(guān)基因的表達(dá)，提高解毒酶活性，促進(jìn)菜用大豆中殘留多菌靈和百菌清的降解代謝。綜上所述，外源褪黑素處理可以有效緩解殺菌劑處理對(duì)菜用大豆受到的細(xì)胞損傷，促進(jìn)菜用大豆對(duì)殘留殺菌劑的解毒作用，從而降低菜用大豆中多菌靈和百菌清的殘留量。