韓妮莎，丁碩§，鄭月萍，魏琳燕，柯星星，劉宏波，劉娟，鄭志富*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州，311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州，311300；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州，450002）

植物細(xì)胞中合成的絕大多數(shù)脂肪酸被摻入到 甘油骨架中，生成的極性甘油脂（glycerolipids）是生物膜的主要成分，而中性甘油脂三酰甘油（triacylglycerol,TAG）則是油料植物種子或果實(shí)中的主要儲(chǔ)存物質(zhì)[1,2]。很多甘油脂及其代謝產(chǎn)物具有信號(hào)傳遞因子的作用，參與眾多與植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物脅迫或非生物脅迫相關(guān)聯(lián)的信號(hào)傳遞過(guò)程[3]。同時(shí)，TAG 代謝在維持植物細(xì)胞的能量和脂質(zhì)平衡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。已知油料植物種子在發(fā)育過(guò)程中形成的TAG 可為光合自養(yǎng)前的幼苗生長(zhǎng)提供所需的能量和碳源；TAG 的合成和轉(zhuǎn)化亦與花粉的形成和萌發(fā)密切相關(guān)[4,5]。因此，深入了解甘油脂代謝對(duì)油料作物產(chǎn)量與品質(zhì)性狀的改良至關(guān)重要。

1 甘油脂合成

甘油脂的從頭生物合成途徑（de novoglycerolipid biosynthesis）是最基本的代謝過(guò)程，在低等與高等真核生物間存在較高的保守性。已知植物細(xì)胞中存在三個(gè)甘油脂合成部位，分別分布于質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。植物已進(jìn)化出多種機(jī)制，使得甘油脂分子在不同亞細(xì)胞區(qū)間廣泛地發(fā)生交換[6,7]。在傳統(tǒng)的Kennedy途徑中（圖1），甘油脂從頭生物合成的第一、二步?；磻?yīng)分別由3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（Glycerol-3-phoshate acyltransferase, GPAT）和溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT）催化，形成的磷脂酸（Phosphatidic acid, PA）是極性甘油脂和中性儲(chǔ)存類甘油脂TAG生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵前體物質(zhì)[8]，它在磷脂酸磷酸酶（Phosphatidate phosphatase）的作用下，水解脫去磷酸生成1，2-二酰甘油（Diacylglycerol,DAG）。DAG 是TAG 的直接合成前體，它的脂?；荰AG 生物合成的最后一步反應(yīng)，該反應(yīng)至少受兩類酶的控制，它們分別是以脂酰輔酶A 和磷脂作為脂?；w的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶[9～12]，即DGAT（Acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase）和PDAT（Phospholipid:diacylglycerol acyltransferase）。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，人們不斷地發(fā)現(xiàn)更多的參與植物甘油脂代謝的遺傳因子和新的合成途徑。例如，有證據(jù)顯示，植物中存在一酰甘油（Monoacylglycerol，MAG）途徑[13]，這一途徑由依賴于脂酰輔酶A 作為?；w的一酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Monoacylglycerol acyltransferase，MGAT）所介導(dǎo)，將MAG 轉(zhuǎn)化為DAG，這說(shuō)明植物細(xì)胞中DAG 的合成并不像傳統(tǒng)上描述的那樣單一。另外還發(fā)現(xiàn)，參與Lands 循環(huán)（Lands cycle）的溶血磷脂酸膽堿酰基轉(zhuǎn)移 酶（Lysophosphatidylcholine acyltransferase，LPCAT）能影響種子中甘油脂的脂肪酸組分，這表明Lands 循環(huán)和Kennedy 途徑在甘油脂的合成中存在著復(fù)雜的互作關(guān)系[14,15]（圖1）。這些新發(fā)現(xiàn)的遺傳因子對(duì)植物甘油脂生物合成的貢獻(xiàn)，在過(guò)去并沒(méi)有被清晰地認(rèn)知。在目前已知的參與植物脂肪酸組裝（Fatty acid assembly）的一系列酶類當(dāng)中，只有極少數(shù)的酶被公認(rèn)為具有直接參與TAG 合成的功能，其中之一為催化TAG 合成途徑中最后一步?；磻?yīng)的DGAT。

圖1 真核生物中甘油脂的生物合成Fig.1 Glycerolipid biosynthesis in eukaryotes

2 GPAT基因的克隆與功能研究

GPAT 催化甘油脂生物合成途徑中的第一步?；磻?yīng)，該反應(yīng)被認(rèn)為是關(guān)鍵的限速步驟，它居于脂肪酸和甘油脂合成代謝的中心位置，起到銜接二者的作用。位于質(zhì)體中的GPAT 是可溶性的，由ATS1基因編碼，在甘油脂原核合成途徑中發(fā)揮重要作用。質(zhì)體外的GPAT 則是膜結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)甘油脂真核合成途徑中的第一步?；磻?yīng)。有關(guān)質(zhì)體中GPAT基因的克隆與功能已有較多研究[16～19]，但植物中膜結(jié)合GPATs 的研究相對(duì)滯后，一個(gè)重要原因是膜結(jié)合蛋白不易分離純化，且在體外難以重構(gòu)獲得具有活性的酶分子。長(zhǎng)期以來(lái)，這類GPAT，特別是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的GPAT 酶，是很多研究組關(guān)注的焦點(diǎn)，因?yàn)槟壳把芯空J(rèn)為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被認(rèn)為是TAG 生物合成的主要位點(diǎn)[20]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GPATs 的分離與鑒定對(duì)油脂合成的基因工程改良非常重要。但是，直到2001 年，真核生物中第一個(gè)編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GPAT 的基因才被克隆。Zheng 和Zou 基于低等和高等真核生物中甘油脂代謝具有相對(duì)保守性的設(shè)想，從研究面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）入手，分離鑒定了兩個(gè)編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GPAT 酶的基因，分別命名為GAT1和GAT2，這是首例報(bào)道真核生物細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GPAT基因的克隆工作[21]。在此基礎(chǔ)上，其它真核生物中的GPAT基因的克隆研究逐漸取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[20,22～26]

2.1 擬南芥GPATs的生化特性與生理功能

根據(jù)酵母Gat1p 和Gat2p 多肽中所含的保守?；D(zhuǎn)移酶特征序列（Conserved acyltransferase motifs），Zheng 等從擬南芥中克隆到7 個(gè)相關(guān)基因，由之組成的GPAT家族被命名為AtGPAT[20]。隨著擬南芥基因組序列的完善，Beisson 等發(fā)現(xiàn)其中還存在另一個(gè)與之相關(guān)的成員，稱之為AtGPAT8[27]。由這一家族編碼的GPATs，大小接近、氨基酸序列相似，且均含有兩個(gè)跨膜氨基酸序列和四個(gè)保守的?；D(zhuǎn)移酶特征序列[20]。體外蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)分析（In vitroimport assay）顯示，AtGPAT1 具有雙重亞細(xì)胞定位特性，即位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體[20]。反向遺傳學(xué)分析進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，AtGPAT1的突變嚴(yán)重延緩絨氈層細(xì)胞的程序性死亡，并影響花粉粒細(xì)胞內(nèi)膜的形成，從而導(dǎo)致雄性不育[20]。

后續(xù)一些研究顯示，除AtGPAT9 之外，AtGPAT家族其它成員優(yōu)先催化G-3-P 上sn-2 位置的?；磻?yīng)，而非sn-1 位置。目前大多認(rèn)為這一家族的酶是高等植物所特有的，其主要功能是參與聚酯的合成。遺傳分析發(fā)現(xiàn)，AtGPAT4、6和8基因在角質(zhì)合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，gpat4 gpat8雙突變體的莖和葉中角質(zhì)含量明顯下降，保衛(wèi)細(xì)胞角質(zhì)含量的降低影響了氣孔的正常結(jié)構(gòu)，造成干旱和病菌耐受性下降[28,29]。AtGPAT6參與花萼和花瓣角質(zhì)合成，與花藥發(fā)育、植物育性相關(guān)，gpat6突變體的花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)受到影響，種子結(jié)實(shí)率降低[30]。另外，AtGPAT5在擬南芥種皮和根中參與木栓質(zhì)合成[27]。AtGPAT7與AtGPAT5序 列 相 似 度 高，AtGPAT7參 與植物損傷修復(fù)[28]。進(jìn)一步的生化分析顯示，AtGPAT4、6 和8 結(jié)構(gòu)相似，是獨(dú)特的雙功能酶，兼具sn-2 ?；D(zhuǎn)移酶和磷酸酶活性，可將G-3-P 轉(zhuǎn)化為2-單?；?甘油（2-Monoacylglycerol，2-MAG）[27,31]。而AtGPAT5與AtGPAT1只有sn-2?；D(zhuǎn)移酶活性，而無(wú)磷酸酶活性。迄今，AtGPAT2 和AtGPAT3 的生化特性尚不清楚[28]。

與ATS1 一樣，AtGPAT9 屬于sn-1 GPAT，優(yōu)先在sn-1 位置上催化G-3-P 的酰化反應(yīng)。GPAT9 是膜結(jié)合蛋白，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與質(zhì)體外甘油脂的合成；其過(guò)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)不影響外表皮的角質(zhì)和蠟質(zhì)的含量。atgpat9突變體表現(xiàn)出雌雄配子純合致死現(xiàn)象[32,33]。

在擬南芥體內(nèi)，不同成員之間可能發(fā)生多種相互作用，但目前對(duì)這些互作復(fù)雜性的了解甚少，將來(lái)有必要運(yùn)用新一代基因編輯技術(shù)構(gòu)建多種不同的GPAT基因多突變體，進(jìn)一步深入研究GPAT基因在植物體內(nèi)的真實(shí)生物學(xué)功能。

2.2 油料作物GPATs基因?qū)τ椭铣傻挠绊?/h3>

除了模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）[20,30,34,35]，目前已在油菜（Brassica napus）[36～41]、花生（Arachis hypogaea）[42～46]和向日葵（Helianthus annuus）[47]等油料植物，水稻（Oryza sativa）[48]和玉米（Zea mays）[49～51]等單子葉植物，以及番茄（Solanum lycopersicum）[52～54]等植物中分離鑒定了多個(gè)與擬南芥GPAT基因同源的基因。這些植物中的GPAT基因表現(xiàn)出多種生理功能，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。關(guān)于GPAT基因在植物育性和抗逆方面的功能，陳文玲等[26]與Liu 等[17]作了綜述介紹。本文重點(diǎn)討論油料作物GPAT基因在甘油脂合成中的功能。

2.2.1 油菜GPAT4、GPAT6和GPAT9基因?qū)ΨN子油脂合成的影響 現(xiàn)有證據(jù)表明，BnGPAT4在油菜種子油脂合成過(guò)程中扮演著重要角色，其表達(dá)量變化對(duì)種子含油量產(chǎn)生顯著影響。Chen 等運(yùn)用RNAi技術(shù)下調(diào)甘藍(lán)型油菜BnGPAT4基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)受RNAi干擾的轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比，含油量下降了12.4%～24.1%；脂肪酸組分也發(fā)生了改變，油酸（C18∶1）下降了4.3%～16.5%，而亞油酸（C18∶2）和α-亞麻酸（C18∶3）則有不同程度的增加[37]。不過(guò)，目前并不完全清楚BnGPAT4 酶在植物體內(nèi)的生化特性，因此BnGPAT4基因調(diào)控油菜種子油脂合成的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步完善。

目前，與BnGPAT4 高度相似的BnGPAT6 在種子油脂合成過(guò)程中的功能并不清晰。耿宇等運(yùn)用RNAi 技術(shù)下調(diào)甘藍(lán)型油菜BnGPAT6基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因種子與野生型相比，萌發(fā)延緩1～2 d，發(fā)芽勢(shì)弱，真葉出現(xiàn)時(shí)間晚3～4 d，推測(cè)轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)遲緩可能與其種子中的三酰甘油含量較低有關(guān)[39]，但缺乏直接證據(jù)證明BnGPAT6基因?qū)ΨN子含油量產(chǎn)生影響。

另外，邢蔓等的研究顯示，BnGPAT9基因在擬南芥種子中的特異性表達(dá)可在一定程度上促進(jìn)種子的油脂合成，使得種子含油量提高了1.91%～2.56%，并使脂肪酸組分發(fā)生了一些變化[40]。但BnGPAT9是否構(gòu)成油菜種子油脂合成的關(guān)鍵基因，目前尚缺少有力的生化證據(jù)。我們實(shí)驗(yàn)室最近運(yùn)用酵母遺傳互補(bǔ)法對(duì)BnGPAT9 進(jìn)行了體內(nèi)酶學(xué)活性鑒定，這將在后續(xù)分析中介紹[55]。

上世紀(jì)七十年代，原輕工業(yè)部成立了全國(guó)家用電器工業(yè)科技情報(bào)站；1980年，北京家用電器研究所（2002年更名為中國(guó)家用電器研究院）被確定為全國(guó)家用電器工業(yè)科技情報(bào)站歸口單位。同年，我國(guó)家電行業(yè)第一本行業(yè)期刊《家用電器》創(chuàng)刊。1996年，根據(jù)中國(guó)輕工總會(huì)輕總息［1996］11號(hào)文件，全國(guó)家用電器工業(yè)科技情報(bào)站更名為全國(guó)家用電器工業(yè)信息中心，成為中國(guó)輕工業(yè)信息中心所屬33個(gè)全國(guó)輕工行業(yè)信息中心之一，并設(shè)置在中國(guó)家用電器研究院。

2.2.2 花生GPAT9基因?qū)τ椭铣傻挠绊?一些研究表明花生AhGPAT9在種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化與油脂合成或積累關(guān)系密切。華方靜等分析了10 個(gè)花生品種種子的含油量及AhGPAT9在這些品種種子發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)AhGPAT9的相對(duì)表達(dá)量與品種含油量存在一定的相關(guān)性。Krapt. st. 16 種子含油量高達(dá)55.80%，AhGPAT9在油分積累的主要時(shí)期的表達(dá)量亦較高；相反，在含油量較低（47.32%）的特21 品種中，AhGPAT9在油分積累的主要時(shí)期表達(dá)量較低。這些結(jié)果表明Ah-GPAT9在花生種子油脂積累過(guò)程中起著重要的作用[42]。另外，Lv 等對(duì)AhGPAT9基因在花生不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)AhGPAT9基因在發(fā)育種子中表達(dá)量高，在42 DAP 時(shí)達(dá)到峰值，這與花生籽粒的油脂積累速率一致[45]。為了進(jìn)一步明確AhGPAT9在花生種子油脂積累過(guò)程中的功能，Lv 等對(duì)AhGPAT9基因在花生中進(jìn)行過(guò)表達(dá)和反義表達(dá)，發(fā)現(xiàn)T3過(guò)表達(dá)株系種子平均含油量達(dá)54.24%，比野生型增加4.75%，但T3反義表達(dá)株系的含油量卻降至45.80%，比野生型下降3.69%。這些結(jié)果表明AhGPAT9基因在花生種子油脂合成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[45]。

另有研究調(diào)查了花生AhGPAT3和AhGPAT5基因與種子油脂合成的關(guān)系。郝翠翠等分析了AhGPAT3和AhGPAT5基因在花生種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)AhGPAT3和AhGPAT5基因在花生發(fā)育初期比較活躍[46]。但是這兩個(gè)基因是否在花生種子油脂合成過(guò)程中發(fā)揮某種作用并不清楚。

2.2.3 其他油料作物中GPAT9基因?qū)τ椭铣傻挠绊?除油菜和花生外，一些研究還分析了向日葵和大豆等油料作物中GPAT基因與種子油脂合成的關(guān)系。Payá-Milans 等分析了向日葵HaGPAT9-1和HaGPAT9-2基因在發(fā)育種子和營(yíng)養(yǎng)組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)HaGPAT9-1在種子TAG開(kāi)始積累時(shí)強(qiáng)烈表達(dá)，種子灌漿過(guò)程中HaGPAT9-1的表達(dá)模式與油脂積累速率相一致。相反，HaGPAT9-2基因在營(yíng)養(yǎng)組織中強(qiáng)烈表達(dá)。雖然HaGPAT9-2在種子發(fā)育早期和中期短暫表達(dá)，但與HaGPAT9-1相比，前者表達(dá)弱。這些結(jié)果表明HaGPAT9-1可能與向日葵種子的油脂積累有關(guān)[47]。不過(guò)，目前缺乏對(duì)HaGPAT9-1生化特性的了解，其在向日葵種子油脂合成中的真實(shí)功能并不清楚。

目前有關(guān)大豆GPAT基因的研究報(bào)道很少。陳錦玲等運(yùn)用RNA-Seq 分析了大豆（Glycine max）籽粒不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)變化，篩選獲得8 個(gè)與大豆油脂合成相關(guān)的候選基因，其中某些GPAT基因在大豆籽粒發(fā)育期間（20～50 d）表達(dá)量持續(xù)上升，與大豆籽粒油脂積累相符[56]。不過(guò)，其在大豆油脂合成中的真實(shí)功能尚不知曉。

綜上，目前有關(guān)GPAT基因在油料作物種子油脂合成過(guò)程中的功能研究，大多局限于基因表達(dá)量與含油量的關(guān)聯(lián)分析，而大部分GPAT 酶在這一過(guò)程中的生化特性并不清楚，因此，人們并不明確GPAT基因?qū)τ椭铣傻挠绊懢烤故侵苯有?yīng)還是間接效應(yīng)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的一個(gè)主要原因是很多實(shí)驗(yàn)室缺乏鑒定GPAT 酶的有效方法。因此，我們將在下文介紹目前GPAT 酶分析方法的研究進(jìn)展，以期為農(nóng)作物GPAT基因的功能研究提供參考。

3 GPAT 的酶活性測(cè)定及其基因的鑒定

3.1 體外酶學(xué)測(cè)定法

GPAT催化的脂酰化反應(yīng)，將3-磷酸甘油（Glycerol-3-Phosphate，G-3-P）轉(zhuǎn) 化 為 溶 血 磷 脂 酸（LPA）。因待測(cè)的蛋白提取液中常同時(shí)含有GPAT和LPAT，生成的LPA 可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為PA。因此，GPAT 的體外酶學(xué)測(cè)定法通常是測(cè)定源于G-3-P 的LPA 與PA 兩者的總形成量，并以此計(jì)算GPAT 酶的活性。目前常用的GPAT 體外活性測(cè)定法包括同位素標(biāo)記測(cè)定法和熒光偶聯(lián)酶學(xué)測(cè)定法。

3.1.1 同位素標(biāo)記測(cè)定法 目前，在GPAT 酶的體外活性測(cè)定中，常以放射性14C 或32P 同位素標(biāo)記的G-3-P 為底物[21,57,58]。反應(yīng)液中生成的同位素標(biāo)記的LPA 和PA 產(chǎn)物經(jīng)薄層層析法（TLC）[21]或高效液相色譜法（HPLC）[59,60]分離后，可用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定其總形成量（圖2）。例如，Zheng 和Zou 利用14C同位素標(biāo)記的底物測(cè)定了酵母Gat1p 和Gat2p 的酶活性。在含Tris-HCl、DTT 與MgCl2的緩沖液中加入棕櫚酰基-CoA 和14C 標(biāo)記的G-3-P，混合均勻后加入含GPAT 酶的酵母提取液；室溫反應(yīng)一定時(shí)間后，加入1%HClO4終止反應(yīng)；再用氯仿-甲醇萃取，汲取下層含反應(yīng)產(chǎn)物的有機(jī)相，并用1%HClO4洗滌有機(jī)相，最后將含14C 標(biāo)記產(chǎn)物的有機(jī)相在氮?dú)庀麓蹈伞Ｒ徊糠之a(chǎn)物可直接用于放射性閃爍計(jì)數(shù)，另一部分用于TLC 分析，在特定展開(kāi)劑系統(tǒng)，LPA 和PA 的Rf值相差很大，同位素掃描儀可直接對(duì)TLC 板上的分離物質(zhì)進(jìn)行掃描[21]。另外，Zheng等為了鑒定擬南芥GPAT基因的功能，在酵母gat1突變體中表達(dá)AtGPAT基因，利用同樣方法測(cè)定了酵母蛋白提取液中的GPAT 活性，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)AtGPAT基因具有GPAT 酶活性[20]。

圖2 利用放射性同位素標(biāo)記3-磷酸甘油底物測(cè)定GPAT酶活性Fig.2 Determination of GPAT enzyme activity with glycerol-3-phosphate substrate labeled with radioisotope

同位素標(biāo)記分析法直接對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，具有靈敏度高的特點(diǎn)。這種方法可有效地測(cè)定GPAT 酶對(duì)3-磷酸甘油底物的專一性及對(duì)脂?；w的偏好性[21]。但由于同位素的使用限制，該方法對(duì)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室而言并不適用（表1）。另外，植物中的膜結(jié)合GPAT 酶，其活性受膜脂組分的影響，因而體外酶學(xué)分析結(jié)果受反應(yīng)條件的影響較大，這在一定程度上限制了數(shù)據(jù)的可比性。

表1 GPAT的酶活性測(cè)定及其基因的遺傳互補(bǔ)法鑒定Table 1 Measurement of GPAT enzyme activities and identification of the genes by genetic complementation

3.1.2 熒光偶聯(lián)酶學(xué)測(cè)定法 Morita 等人建立了一種熒光偶聯(lián)酶學(xué)測(cè)定法（表1），用于分析細(xì)胞中產(chǎn)生的PA。該方法將脂質(zhì)提取物溶解于含有Triton X-100（非離子表面活性劑）的反應(yīng)液中，在特定細(xì)菌脂肪酶（對(duì)PA 底物高度專一）的作用下，將PA分子中的脂肪酸基團(tuán)解離出來(lái)，使PA 轉(zhuǎn)化為G-3-P。隨后，在G-3-P 氧化酶的作用下，G-3-P 被氧化，產(chǎn)生過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫與Amplex Red 反應(yīng)生成高熒光產(chǎn)物試鹵靈（Resorufin），其熒光強(qiáng)度可用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定[61]。

Hassaninasab 等人在測(cè)定酵母細(xì)胞PA 含量過(guò)程中，對(duì)上述方法進(jìn)行了改進(jìn)[62]。他們發(fā)現(xiàn)，在Morita 等人開(kāi)發(fā)的熒光偶聯(lián)酶學(xué)測(cè)定法中[61]，因使用了活性氧含量較高的Triton X-100 以及受脂肪酶未完全熱滅活的影響，反應(yīng)液中的背景熒光值很高，導(dǎo)致信噪比嚴(yán)重下降。相反，當(dāng)使用高純度的Triton X-100，并結(jié)合脂肪酶的充分熱滅活，其信噪比大幅提高[62]。

熒光偶聯(lián)酶學(xué)測(cè)定法具有較高的分析靈敏度，但該方法將產(chǎn)物PA重新水解生成底物G-3-P，步驟較為繁瑣，操作不簡(jiǎn)便。在反應(yīng)液中，除了產(chǎn)物L(fēng)PA與PA 外，常含其他磷脂，因此分析的可靠性取決于不同來(lái)源的細(xì)菌脂肪酶的底物專一性。該酶的價(jià)格普遍很高，因此制約了熒光偶聯(lián)酶學(xué)測(cè)定法的廣泛使用（表1）。

3.2 遺傳互補(bǔ)法

除了位于質(zhì)體的GPAT酶，其它已知GPAT酶屬于膜結(jié)合蛋白，不易分離純化，且其體外重構(gòu)十分困難[21]，這在一定程度上限制了GPAT 酶的體外分析。遺傳互補(bǔ)法，作為一種體內(nèi)酶學(xué)分析方法，具有簡(jiǎn)便易行的優(yōu)點(diǎn)，可以通過(guò)觀察目的基因的導(dǎo)入對(duì)生物體特定生理缺陷的恢復(fù)狀況，直觀地評(píng)估酶的功能。下面綜述細(xì)菌遺傳互補(bǔ)法和酵母遺傳互補(bǔ)法用于GPAT基因鑒定的研究進(jìn)展。

3.2.1 細(xì)菌的遺傳互補(bǔ) 大腸桿菌中，GPAT 酶是由PlsB基因編碼的膜嵌合蛋白[63～65]，該基因已被克隆[64]。在BB26-36 菌株中PlsB基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致該酶對(duì)G-3-P 底物的親和力下降。在不添加甘油或G-3-P 的培養(yǎng)基中，它不能正常生長(zhǎng)，因此它屬于甘油或G-3-P 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體[58,66]。利用這一生長(zhǎng)特性，人們已建立了一種基于BB26-36 菌株的細(xì)菌遺傳互補(bǔ)法，可用于鑒定GPAT基因（表1）。

BB26-36 菌株屬于革蘭氏陰性菌，在這類細(xì)菌細(xì)胞中，acyl-ACP 是?；磻?yīng)中的主要脂酰基供體，由細(xì)菌Ⅱ型脂肪酸合成酶FASII（Type II fatty acid synthase）產(chǎn)生。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加甘油時(shí)，甘油可以被細(xì)菌快速吸收，并在甘油激酶作用下快速地轉(zhuǎn)變?yōu)镚-3-P，成為?；磻?yīng)中的脂?；荏w。PlsB 和PlsC 以acyl-ACP 為 脂 酰 基 供 體，分 別 催 化G-3-P 的第一步與第二步酰化反應(yīng)，生成LPA 與PA[67]（圖3）。不過(guò)，一些細(xì)菌酰基轉(zhuǎn)移酶也可以利用脂?；?CoA 作為底物，它由?；?CoA 合成酶（FadD）產(chǎn)生[68]。

圖3 大腸桿菌plsB 突變體（BB26-36）的甘油營(yíng)養(yǎng)缺陷型特性Fig.3 Glycerol auxotrophy of the plsB strain of Escherichia coli（BB26-36）

利用上述細(xì)菌遺傳互補(bǔ)法，Lewin 等分析了?；D(zhuǎn)移酶的保守氨基酸殘基對(duì)GPAT 酶活性的影響[57]。根據(jù)不同酰基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列的相似性[69～72]，Lewin 等對(duì)?；D(zhuǎn)移酶四個(gè)保守區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行了定點(diǎn)誘變，并將發(fā)生氨基酸替換的PlsB 編碼基因?qū)氲紹B26-36 菌株中；通過(guò)檢測(cè)不同突變基因恢復(fù)BB26-36 在甘油營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下的生長(zhǎng)能力，評(píng)估高度保守區(qū)域的氨基酸殘基對(duì)GPAT 活性的調(diào)控作用[57]。研究發(fā)現(xiàn)，保守區(qū)I 的組氨酸和天冬氨酸、保守區(qū)III 的甘氨酸和保守區(qū)IV的脯氨酸在GPAT 催化中發(fā)揮重要作用，而保守區(qū)II 的苯丙氨酸和精氨酸以及保守區(qū)III 的谷氨酸和絲氨酸似乎對(duì)甘油3-磷酸底物的結(jié)合很重要[57]。

上述細(xì)菌遺傳互補(bǔ)法被證明可有效用于原核生物中GPAT基因的功能分析[57,58,73]。然而，另有一些研究表明，該法存在某些局限性，真核生物中的一些GPAT基因的異源表達(dá)無(wú)法彌補(bǔ)BB26-36 的生長(zhǎng)缺陷（表1）。一個(gè)可能原因是，真核生物中的膜結(jié)合GPAT 酶優(yōu)先使用脂?；?CoA 作為脂?；w，而在BB26-36 細(xì)胞中，?；?ACP 是主要的脂?；w，它可能不是真核生物中的膜結(jié)合GPAT 酶的適用底物[16,67,73,74]。

3.2.2 酵母的遺傳互補(bǔ) 作為細(xì)胞中最基本的代謝過(guò)程，甘油脂合成在低等與高等真核生物之間存在較高的保守性，因此基于酵母突變體的遺傳互補(bǔ)技術(shù)已被廣泛用來(lái)鑒定高等真核生物中參與甘油脂代謝的基因[8,67,75]。建立一個(gè)實(shí)用的酵母遺傳互補(bǔ)體系的主要挑戰(zhàn)是構(gòu)建一種具有特定生長(zhǎng)缺陷的突變株，這種生長(zhǎng)缺陷只有在特定的目標(biāo)基因?qū)氲那闆r下才得以消除。Zheng 和Zou 發(fā)現(xiàn)，Gat1p和Gat2p是釀酒酵母中兩個(gè)最主要的GPAT酶，同時(shí)敲除兩者的編碼基因GAT1和GAT2會(huì)導(dǎo)致酵母喪失生長(zhǎng)能力[21]。這一特性允許人們構(gòu)建條件致死型gat1Δgat2Δ 酵母雙突變體（圖4），理論上，只有當(dāng)導(dǎo)入編碼具有GPAT 酶活性的基因時(shí)，這種突變體才能恢復(fù)其在特定條件下的生長(zhǎng)能力。

圖4 四分體分析顯示GAT1和GAT2基因雙敲除能使酵母細(xì)胞喪失生長(zhǎng)能力[21]Fig.4 Simultaneous knockout of GAT1 and GAT2 genes renders yeast cells unable to grow as revealed by tetrad analysis

Zaremberg 等以W303 酵母菌株為遺傳材料，構(gòu)建了一個(gè)名為CMY228的條件致死型gat1Δgat2Δ酵母 雙 突 變 體，其 基 因 型 為（W303，gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT1 URA3]），該菌株攜帶的質(zhì)粒含GAL1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GAT1基因（源于酵母自身的基因）以及URA3選擇標(biāo)記，GAL1啟動(dòng)子受半乳糖誘導(dǎo)，葡萄糖抑制[77]?；贑MY228 的酵母遺傳互補(bǔ)體系曾被用于鑒定惡性瘧原蟲(chóng)中編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GPAT 的基因[78]。同時(shí)，我們亦構(gòu)建了一個(gè)以BY4742 為遺傳背景的gat1Δgat2Δ 酵 母 雙 突 變 體 菌 株，名 為NIU8（BY7472，gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT1 URA3]），其攜帶的質(zhì)粒與CMY228 中的一樣[79]。猶如CMY228，NIU8 菌株的生長(zhǎng)完全依賴于該質(zhì)粒的存在，換言之，GAL1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GAT1基因的表達(dá)是這兩個(gè)突變體生長(zhǎng)所必需的[79]。然而我們發(fā)現(xiàn)，NIU8 不但能在以半乳糖為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而且在葡萄糖存在的條件下，該菌株仍能生長(zhǎng)。我們推測(cè)，在受葡萄糖抑制條件下，GAT1基因的泄漏表達(dá)可能足以產(chǎn)生足夠高的GPAT活性來(lái)維持gat1Δgat2Δ雙突變體的生長(zhǎng)，這可能與GAT1基因編碼的GPAT 酶在酵母自身環(huán)境中具有很高活性有關(guān)[79]。在這種情況下，目標(biāo)基因的篩選會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象[79]（表1）。

多數(shù)情況下，酶在其自然細(xì)胞環(huán)境中具有較高的催化活性，而在異源細(xì)胞系統(tǒng)中其活性往往較低。于是，當(dāng)一個(gè)外源編碼GPAT 的基因與酵母自身GAT1基因的表達(dá)水平相同時(shí)，前者常會(huì)產(chǎn)生較低的GPAT 活性[20,21]。因此，Lei等假設(shè)，解決上述假陽(yáng)性問(wèn)題的一種途徑是，用一個(gè)異源GPAT基因替換質(zhì)粒中所含的酵母自身GAT1基因。當(dāng)該質(zhì)粒導(dǎo)入gat1Δgat2Δ 雙突變體時(shí)，異源GPAT基因在葡萄糖抑制條件下的泄漏表達(dá)不能產(chǎn)生足夠高的GPAT活性用以彌補(bǔ)突變體的生長(zhǎng)缺陷[79]。我們稱這種策略為“產(chǎn)能過(guò)剩消除策略”（the Eradication of Excess Capacity strategy）[79]?；谶@種假設(shè)，Lei 等在NIU8菌株的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個(gè)新的gat1Δgat2Δ 雙突變體菌株，名為ZAFU1（BY4742,gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2]），其中所含的質(zhì)粒攜帶一個(gè)受半乳糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子（GAL1）控制的擬南芥GPAT1基因及LEU2選擇基因[79]（圖5）。我們反復(fù)試驗(yàn)證明，ZAFU1 菌株能在含有半乳糖的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，而在葡萄糖的培養(yǎng)基中，即使延長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)間至幾個(gè)月，菌株仍未出現(xiàn)任何生長(zhǎng)跡象，因此有理由相信，基于ZAFU1 的遺傳互補(bǔ)體系出現(xiàn)假陽(yáng)性的頻率會(huì)非常地低（表1）。

圖5 攜帶擬南芥AtGPAT1的條件致死型gat1Δ gat2Δ雙突變體酵母的構(gòu)建流程Fig.5 A schematic diagram for construction of a conditional lethal gat1Δ gat2Δ double mutant of Saccharomyces cerevisiae carrying Arabidopsis AtGPAT1

在此基礎(chǔ)上，Lei 等構(gòu)建了適用于ZAFU1 遺傳互補(bǔ)體系的pYES2-Kan-yADH1 穿梭載體，該質(zhì)粒攜帶一個(gè)受葡萄糖誘導(dǎo)的酵母ADH1啟動(dòng)子及一個(gè)與之相鄰的多克隆位點(diǎn)DNA 片段，后者作為候選基因的插入位點(diǎn)[79]。Lei 等研究顯示，當(dāng)含已知GPAT基因的pYES2-Kan-yADH1質(zhì)粒導(dǎo)入ZAFU1突變體時(shí)，該菌株能在葡萄糖培養(yǎng)基中恢復(fù)生長(zhǎng)；相反，編碼其它脂類合成相關(guān)酶基因不能恢復(fù)ZAFU1 在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力。這些結(jié)果表明該酵母遺傳互補(bǔ)體系對(duì)GPAT基因的鑒定具有很高的專一性[79]。若目的基因在葡萄糖誘導(dǎo)條件下的表達(dá)能夠恢復(fù)ZAFU1 的生長(zhǎng)，則可以推斷該目的基因編碼的蛋白具有類似酵母G-3-P ?；D(zhuǎn)移酶的功能。Lei等利用該遺傳互補(bǔ)體系對(duì)擬南芥GPAT基因家族8位成員進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示在葡萄糖培養(yǎng)基中At-GPAT1、GPAT5或AtGPAT7的導(dǎo)入能使ZAFU1 菌株不同程度地恢復(fù)生長(zhǎng)，但AtGPAT2、AtGPAT3、AtGPAT4、AtGPAT6或AtGPAT8的表達(dá)未能彌補(bǔ)其生長(zhǎng)缺陷[79]。這一結(jié)果與GPATs的體外酶學(xué)分析結(jié)果相一致，AtGPAT1、AtGPAT5 與AtGPAT7 只具有將G-3-P 轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)PA 的?；D(zhuǎn)移酶活性，而AtGPAT4、AtGPAT6 與AtGPAT8 兼具?；D(zhuǎn)移酶與磷脂酶的活性，能將G-3-P經(jīng)LPA中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為MAG[27,31]。

由于外源GPAT基因在酵母中的表達(dá)產(chǎn)物活性較低，于是ZAFU1 的生長(zhǎng)速率受到該基因在葡萄糖誘導(dǎo)下的表達(dá)水平的影響很大。為了提高ZAFU1菌株的生長(zhǎng)速率及與此相關(guān)的目的基因篩選效率，陳丹丹等用長(zhǎng)片段酵母ADH1啟動(dòng)子替換pYES2-Kan-yADH1 質(zhì)粒中所含的短片段酵母ADH1啟動(dòng)子，使目的基因在葡萄糖誘導(dǎo)條件下的表達(dá)水平得到增強(qiáng)，從而進(jìn)一步優(yōu)化了基于ZAFU1 的酵母遺傳互補(bǔ)篩選體系[80]。該優(yōu)化后的篩選體系已被用于油菜和花生等作物的GPAT 編碼基因的鑒定[55,81]。段芊芊等鑒定了甘藍(lán)型油菜中的13 個(gè)候選GPAT基因，發(fā) 現(xiàn)BnGPAT1-1、BnGPAT4-1、BnGPAT4-2和BnGPAT9-1基因的異源表達(dá)能恢復(fù)ZAFU1 在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，表明這些基因具有類似酵母?；D(zhuǎn)移酶編碼基因GAT1或GAT2的功能[55]。姜竹等利用該遺傳互補(bǔ)體系對(duì)栽培花生中的13 個(gè)候選GPAT基因進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)AhGPAT5B和AhGPAT7A/B具有類似酵母?；D(zhuǎn)移酶編碼基因GAT1或GAT2的功能[81]。這些研究結(jié)果有助于深入了解作物甘油脂合成的分子調(diào)控機(jī)制。

值得指出的是，盡管酵母和植物之間在PA 生物合成途徑中存在較高的保守性，但因植物細(xì)胞比酵母具有更復(fù)雜的遺傳互作關(guān)系，通過(guò)酵母遺傳互補(bǔ)鑒定獲得的植物GPAT基因，需要進(jìn)一步在植物體內(nèi)進(jìn)行功能驗(yàn)證，以更加全面地了解其在植物體內(nèi)的真實(shí)功能。

4 展望

油料植物不僅是食用油的主要來(lái)源，而且是可持續(xù)地生產(chǎn)生物能源和化工原料的潛在工廠[82]。如何有效地提高可適用于不同用途的植物油脂的生產(chǎn)，已成為生物技術(shù)領(lǐng)域一個(gè)迅速增長(zhǎng)的研究熱點(diǎn)。在過(guò)去的幾十年里，人們對(duì)甘油脂的生物合成有了較為深入的了解，但是這一代謝途徑中仍存在某些未知因子。譬如，對(duì)脂肪酸組裝體系的了解尚不完善，下列問(wèn)題有待解決：（i）油料植物中TAG 合成的初始反應(yīng)和第二步甘油?；磻?yīng)究竟是由哪些基因編碼的酶直接控制的；（ii）極性和中性甘油脂的合成前體是否分別由不同的脂肪酸組裝體系控制。這些關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題的存在致使人們?nèi)噪y以有效地操控甘油脂的生物合成，從而制約油料作物的生產(chǎn)。

目前，通過(guò)提高已知GPAT基因在油料植物種子中的表達(dá)量以大幅增加種子含油量，并未獲得很大成功[39,40]，對(duì)這種現(xiàn)象至少有兩種不同的解釋。其一，這些已知GPAT 編碼基因可能并不直接參與油脂合成，這種觀點(diǎn)得到下面證據(jù)的支持，即對(duì)含油量不同的物種進(jìn)行全基因組的表達(dá)譜比較分析顯示，已知GPAT和LPAT基因的表達(dá)水平在這些物種之間沒(méi)有明顯差異[83,84]。我們推測(cè)，油料植物中或許存在某些新的酰基轉(zhuǎn)移酶和由之介導(dǎo)的TAG合成途徑，這是因?yàn)槟Ｊ街参飻M南芥基因組中仍有多個(gè)功能并不完全清楚的基因，其編碼的蛋白質(zhì)含有保守的脂肪酰基轉(zhuǎn)移酶特征序列。其二，雖然目前尚無(wú)證據(jù)表明植物中含有類似于酵母和哺乳動(dòng)物中存在的磷酸二羥丙酮（DHAP）途徑（圖1），但是植物中是否存在類似合成途徑，尚不清楚。在DHAP 途徑中，甘油脂合成的初始反應(yīng)是由DHAP?；D(zhuǎn)移酶（DHAPAT）催化的[21]。因此，將來(lái)有必要開(kāi)展下列研究：（i）調(diào)查那些未知的含保守?；D(zhuǎn)移酶特征序列的擬南芥蛋白是否具有GPAT 和LPAT 的功能，并調(diào)查其在甘油脂合成中的作用；（ii）探究油料植物中是否存在一類不含有已知?；D(zhuǎn)移酶特征序列的新型?；D(zhuǎn)移酶；（iii）探究植物中是否存在未知的TAG 合成途徑。這些研究將有助于我們深入了解甘油脂合成前體的來(lái)源，從而為有效提高油料作物種子含油量以及改造油的組分使之適應(yīng)各種不同的用途提供理論基礎(chǔ)。

另外，本文分析了GPAT 酶的體外與體內(nèi)測(cè)定方法，并重點(diǎn)綜述了酵母遺傳互補(bǔ)法的建立與應(yīng)用。我們認(rèn)為，對(duì)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室而言，酵母遺傳互補(bǔ)法是一種有效且簡(jiǎn)便的GPAT 鑒定方法，可快速用于植物GPAT 編碼基因的鑒定與結(jié)構(gòu)優(yōu)化。隨著大規(guī)?；蚪M測(cè)序的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的序列被注釋為候選?；D(zhuǎn)移酶基因，但迄今已鑒定的大多數(shù)膜結(jié)合的GPATs 與LPATs 共享四個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域[57]，運(yùn)用生物信息學(xué)工具難以有效區(qū)分這些序列究竟編碼哪種類型的?；D(zhuǎn)移酶，因而在不同物種中克隆的這些?；D(zhuǎn)移酶基因的生化功能不清楚?；跅l件致死型gat1Δgat2Δ雙突變體的酵母遺傳互補(bǔ)法可使GPATs 的酶學(xué)功能鑒定與結(jié)構(gòu)優(yōu)化工作變得簡(jiǎn)便易行，它可直觀地根據(jù)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)速度來(lái)評(píng)估異源表達(dá)產(chǎn)物GPAT 的酶活性大小。因而，上述酵母遺傳互補(bǔ)法的推廣與應(yīng)用將有助于促進(jìn)農(nóng)作物GPAT基因的克隆與功能研究以及油料作物的脂類代謝研究。