鄔瑜錦，徐凱，宋居榮，趙倫，文靜，易斌，馬朝芝，沈金雄，傅廷棟，涂金星

（華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院/作物遺傳改良國家重點實驗室，湖北 武漢，430070）

我國食用植物油的自給率正持續(xù)下降，消費的植物油大約65%依賴進口[1]。油菜是我國主要的油料作物之一，不僅在我國食用油生產(chǎn)中占有主導地位，同時也是我國動物飼料蛋白的重要來源，因此提高產(chǎn)量一直是油菜育種的首要目標[2,3]。油菜的產(chǎn)量構(gòu)成因素中，單位面積的成苗率反映作物幼苗的活力和均勻性，是影響油菜產(chǎn)量的重要因素之一。成苗率是保證作物生產(chǎn)力的前提，同時也是影響作物種植密度的原因之一，而子葉黃化致死與成苗率有關。葉色突變不利于植物的正常發(fā)育，影響植物的正常生長。葉色突變體可以通過人工誘變、自發(fā)突變、基因沉默突變和插入突變獲得。葉色突變體的分類方法有很多，按照葉色突變顏色不同，可以將葉色突變體分為白化、白黃、白綠、淡黃綠、淡綠、黃化、條紋、常綠、斑葉、紫葉和類病斑類型[4]。

葉片黃化致死可能的原因有很多，涉及的主要通路可以分為四大類：（1）葉綠素生物合成和降解途徑。在高等植物中，葉綠素生物合成通路十分復雜，以谷氨酸為前體，由27 個基因編碼的15 種關鍵酶參與，經(jīng)過19步反應，最終形成葉綠素a和葉綠素b[5]。Willianm 等研究發(fā)現(xiàn)，當編碼葉綠素合成途徑中類原卟啉原氧化酶（HEMF）的基因被破壞時，玉米幼苗即使在光下也會一直表現(xiàn)為黃化，最終死亡[6]。（2）血紅素代謝途徑。葉綠素的合成途徑和血紅素合成途徑有重疊的部分，細胞內(nèi)合成四吡咯之后，會根據(jù)細胞內(nèi)血紅素和葉綠素的含量分別進行兩種合成途徑。所以血紅素合成途徑和葉綠素合成途徑會通過四吡咯相互反饋調(diào)節(jié)，當細胞內(nèi)血紅素含量升高，會通過反饋抑制調(diào)節(jié)降低葉綠素合成，降低葉綠素含量[7]。血紅素加氧酶（HO）是血紅素合成途徑中的關鍵酶，在擬南芥中，其編碼基因突變會限制血紅素合成，進一步導致葉綠素水平降低，葉片黃化[8]。（3）葉綠體發(fā)育途徑。葉綠體是由質(zhì)體分化形成，其發(fā)育分化在復雜的質(zhì)核基因協(xié)同調(diào)控下完成[9]。該過程中的任一基因突變均會導致葉綠體發(fā)育異常，進而導致葉色變異。葉綠體發(fā)育主要包括光形態(tài)建成途徑、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運及利用、類囊體分化以及葉綠體分裂等過程。例如，在葉綠體發(fā)育和分化早期，質(zhì)體核糖體蛋白起關鍵作用，水稻中突變體al1和asl2的突變體葉綠體發(fā)育分化異常，幼苗白化致死[10,11]。（4）葉綠體蛋白修飾和降解。葉綠體是半自主性細胞器，該細胞器正常運行涉及多種蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)錄、運輸和代謝降解。Xu 在甘藍型油菜中發(fā)現(xiàn)一個黃化致死基因，該基因編碼PSⅡ系統(tǒng)中的Ftsh1 水解酶，降解PSⅡ系統(tǒng)中光受損的D1 蛋白，該基因的突變導致光系統(tǒng)中D1 蛋白受損后不能及時更換，阻礙光合作用的正常運行[12]。

黃化致死性狀可以作為形態(tài)標記用于良種的繁育和篩選，同時，這類資源也是基礎研究的優(yōu)良材料。隨著CRISPR-Cas9 技術的不斷發(fā)展，人們對于致死基因有了更好的應用。在水稻中，致死基因Ospds在CRISPR-Cas9技術中首次應用，編輯苗在T0代就可以觀察到預期表型，提高編輯檢測效率[13]。之后在玉米、擬南芥、小麥、煙草等作物中都開始將致死基因應用于CRISPR-Cas9 技術中[14～17]。由于甘藍型油菜基因組十分復雜，關于黃化致死基因的研究和利用較少。甘藍型油菜黃化致死基因的研究不僅豐富了甘藍型油菜種質(zhì)資源，而且對于提高基因編輯效率檢測以及推進分子育種的創(chuàng)新具有潛在應用前景。

本實驗以恢復系輪回選擇群體的自交后代中分離的黃化致死突變體ytl為實驗材料，對ytl突變體進行葉綠素含量測定以及葉綠體透射電鏡觀察，分析黃化致死的生物學機制，利用遺傳分析和圖位克隆，對BnaC09.YTL進行定位，隨后對雙親中定位區(qū)間內(nèi)的候選基因進行比較測序和表達量測定分析，為鑒定出目的基因、進一步研究該基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

黃化致死突變體ytl（yellow to lethal）來源于恢復系輪回選擇群體的自交后代，將同一株系后代中正常表現(xiàn)單株YTL 作為野生型對照。利用位點雜合單株（命名為自交一代S1）套袋自交獲得分離群體，命名為自交二代S2。取群體S2 中777 個黃化致死單株進行突變體的遺傳分析和基因定位。所有材料均種植于華中農(nóng)業(yè)大學和甘肅省臨夏回族自治州和政縣試驗基地，田間材料種植與管理按照常規(guī)油菜種植方法進行。

1.2 葉綠素含量測定

自交一代S1 的株系種子播種7 d 之后，選取野生型與突變體ytl單株的子葉去除葉脈剪成小碎片，稱取0.3 g，野生型和突變體各3 個重復。放入20 mL 的浸提液（丙酮∶乙醇=8∶1）中。室溫避光48 h，期間多次搖晃之后吸取上清，使用紫外分光光度計測量在470 nm、646 nm 和663 nm 的吸光度值，按下列公式計算[18,19]:（mL），A：葉片鮮重（g）。

1.3 葉綠體透射電鏡分析

群體S1 代的種子播種7 d，切割黃化致死表型單株和野生型單株相同位置的新鮮子葉，并固定在0.1 mol/L 鹽酸緩沖溶液（pH=7.2）和2.5%戊二醛的溶液中，葉片抽真空至管底。使用0.2 mol/L 的磷酸緩沖液（pH=7.2）洗滌3 次，隨后進行固定2 h。用緩沖溶液洗滌3 次，每次10 min；利用酒精濃度分別為30%、50%、70%、80%、90%進行逐步脫水，每次30 min，最后一次用100%濃度的酒精洗滌兩次。樣品用酒精與SPI-812 樹脂混合液按梯度3∶1、3∶2、3∶3 進行浸透和置換，每次3 h。使用SPI-812包埋至樣品材料硬化，用Leica UC6 切片機進行超薄切片制備，使用2.6%（m/V）檸檬酸鉛和2%（m/V）乙酸鈾酰雙染色。制備完成的樣品在華中農(nóng)業(yè)大學公共電鏡平臺日立Hitachi-7650 透射電鏡下鏡檢照相。

1.4 突變體ytl的遺傳分析

S2 代的種子在溫室培養(yǎng)條件下，溫度為22℃，濕度50%～60%，光周期設計為光照時間16 h，黑暗時間8 h。播種7 d 后觀察分離比，統(tǒng)計野生型和突變體個體的數(shù)目，計算分離比和卡方檢驗。

1.5 BSA結(jié)合油菜60K SNP芯片分析

采用混合分組分析法（BSA），結(jié)合Illumina公司的油菜60K SNP 芯片進行差異分析。從S2 群體中選取子葉正常單株和黃化單株各36 株，CTAB 法提取子葉DNA，調(diào)整DNA 濃度至100 ng/μL。分別構(gòu)建3個黃化池和3個正常池。所有DNA 池及親本都采用甘藍型油菜60 K Illumina Infinium?SNP 芯片[20]進行分析。芯片雜交及掃描的方法與前人報道相同[21]。掃描后的SNP 數(shù)據(jù)在ZS11 參考基因組進行BLAST以確定差異富集位點。

1.6 突變體ytl的染色體定位

根據(jù)60K SNP 芯片的結(jié)果,提取差異富集區(qū)間DNA 序列信息，在Webset 網(wǎng)站（http://wsmartins.net/websat），設計和開發(fā)SSR（Simple sequence repeats）標記。引物的設計原則如下:擴增的片段長度為150～250 bp，Tm 值設定在50～56℃則，引物長度為20～30 bp；最終選擇二或三堿基重復類型，且重復次數(shù)為5～6 次的SSR 標記。選取黃綠混合池篩選有差異的SSR 標記，利用777 個黃化致死單株進行基因定位。根據(jù)ZS11 基因組注釋網(wǎng)站（http://cbi.hzau.edu. cn/bnapus/index. php）設計候選區(qū)間內(nèi)的10 個基因的特異性引物進行PCR 擴增。PCR 程序采用常規(guī)方法進行。

1.7 候選區(qū)間基因的表達量分析

取播種7d 后的野生型和突變體新鮮子葉約0.3 g 放置于液氮中，隨后放置于－80℃保存。使用普洛麥格（北京）生物技術有限公司植物總RNA 提取試劑盒（LS1040）提取植物的總RNA，對提取的RNA 進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取1μg RNA 進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄使用寶日醫(yī)生物技術有限公司PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（RR047A），操作步驟按照說明書進行。根據(jù)已公布的基因編碼區(qū)序列設計qRT-PCR 引物，模板使用稀釋50 倍的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使用SYBR Green Realtime Mix（TOYOBO, Japan）進行熒光定量反應，qRT-PCR 在Bio-rad CFX96 TouchTM 熒光定量PCR 儀中進行。BnaActin7 作為內(nèi)參對數(shù)據(jù)進行標準化，基因表達量的結(jié)果用2-ΔΔCT的方法計算[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃化致死突變體ytl的表型分析

黃化致死突變體ytl來源于恢復系輪回選擇群體的自交后代。突變體子葉表現(xiàn)為黃色，后期不轉(zhuǎn)綠，不能長出真葉，播種9～15 d后枯萎死亡（圖1A）。播種7 d 時，測定野生型YTL 和突變體ytl的光合色素含量。結(jié)果表明，在子葉時期，突變體ytl的葉綠素a、b 以及葉黃素和類胡蘿卜素含量均極顯著低于野生型YTL，與野生型相比，突變體ytl的總?cè)~綠素/類胡蘿卜素的比值顯著降低，野生型和突變體在葉綠素a/b 的比值中并沒有顯著性差異（表1）。因此黃化致死突變體的葉綠素含量顯著低于野生型。

表1 野生型YTL與突變體ytl光合色素含量Table 1 Contents of photosynthetic pigments in wild-type YTL and mutant ytl

選取播種7 d的ytl和YTL 植株進行葉綠體透射電鏡觀察，野生型葉肉細胞結(jié)構(gòu)完整，細胞內(nèi)脂肪粒較多，葉綠體發(fā)育正常、類囊體高度分化結(jié)構(gòu)正常、基粒片層垛疊數(shù)豐富。與之相比，突變體細胞發(fā)育遲緩、細胞內(nèi)淀粉粒含量較少、質(zhì)體發(fā)育不良，其內(nèi)部沒有垛疊的類囊體，結(jié)構(gòu)模糊、基粒片層稀疏（圖1B）。

圖1 野生型YTL和突變體ytl的表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics of wild-type YTL and mutant ytl

2.2 黃化致死突變體ytl的遺傳分析。

為了進行遺傳分析和圖位克隆，我們對自交二代S2播種后觀察統(tǒng)計分離比。卡方測驗結(jié)果表明，正常單株與黃化致死單株數(shù)之比為275∶104(χ2=1.20＜3.84），符合3∶1 的分離。初步判斷該性狀由一對隱性核基因控制。

2.3 黃化致死突變體ytl的基因定位

為了對黃化致死基因進行精細定位，從自交分離群體中各選取12 株黃化致死單株和正常表型單株構(gòu)建DNA 混池，對其進行60K SNP 芯片分析。結(jié)果顯示SNP 差異富集區(qū)間為C02 染色體5Mbp～10Mbp 以及C09 染色體20Mbp～25Mbp 和40Mbp～45Mbp（附圖1，詳見首頁OSID 碼），在這三個區(qū)間內(nèi)設計SSR 標記，尋找與性狀連鎖的標記。結(jié)果顯示只有C09 染色體20Mbp～25Mbp 區(qū)間的標記在兩親本之間存在穩(wěn)定的多態(tài)性。利用自交分離群體中的119 個黃化致死單株進行初定位，區(qū)間初定位在標記SSR-140 和SSR-158 之間，對應ZS11 物理位置1.7 Mbp。根據(jù)ZS11 基因注釋網(wǎng)站信息，在標記SSR-140 和SSR-158 之間又加密SSR 標記以及參照ZS11 的參考基因組設計InDel 標記（附表1，詳見首頁OSID 碼），進一步精細定位，對658 個黃化致死單株使用差異標記進行掃描。最終將該基因定位到標記SSR-140 和PBZIN-1 之間，對應甘藍型油菜ZS11 上198 kb 的物理區(qū)間，其中包括10 個注釋的ORF（開放閱讀框）（圖2 和表2），基因命名為BnaC09.YTL。對突變單株進行測序，與ZS11 的序列進行對比，結(jié)果顯示，BnaC09G0294400ZS、BnaC09G0294600ZS、BnaC09G0294700ZS、BnaC09G0294800ZS、BnaC09G0294900ZS、BnaC09G0295000ZS、BnaC09G0295200ZS這7 個 基因編碼區(qū)均沒有差異,BnaC09G0294300ZS的內(nèi)含子區(qū)有三處變異。BnaC09G0294500ZS、BnaC09G0295 100ZS在突變體ytl中擴增失敗。

表2 定位區(qū)間內(nèi)的基因及功能注釋Table 2 Gene names and their functional annotations in the target interval

圖2 黃化致死基因在C09染色體上的基因定位Fig.2 Gene mapping of yellow to lethal gene on C09 chromosome

2.4 候選基因的表達量分析

參考ZS11 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)網(wǎng)站（http://yanglab.hzau. edu. cn/BnTIR/eFP）發(fā)現(xiàn)BnaC09G0294600ZS和BnaC09G0295200ZS在子葉時期不表達，因此排除這兩個基因作為候選基因的可能性。首先對區(qū)間內(nèi)候選基因的時空表達進行分析，進一步設計特異性引物（附表2）對區(qū)間內(nèi)的候選基因進行表達量檢測，結(jié)果表明，子葉時期，在突變體ytl中候選基因均下調(diào)表達。在野生型和突變單株之間表達量有顯著性差異的基因為BnaC09G0294300ZS、BnaC09G0294400ZS、BnaC09G0294500ZS、BnaC09G0294700ZS和BnaC09G0294900ZS（圖3）。對比參考擬南芥中同源基因的注釋信息發(fā)現(xiàn)，BnaC09G0294300ZS屬于適應家族蛋白，該家族蛋白參與囊泡運輸，可能參與到質(zhì)核轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，進而影響葉綠體生長發(fā)育途徑[23]。BnaC09G0294400ZS參與蛋白質(zhì)泛素化調(diào)控，而蛋白質(zhì)泛素化調(diào)控途徑參與植物光形態(tài)建成[24]。BnaC09G0294500ZS沒有相關的注釋信息。BnaC09G0294700ZS在擬南芥中的同源基因是MAP 激酶，在擬南芥中與同家族的其他激酶調(diào)控植物根系生長速率[25]。BnaC09G029490 0ZS是過氧化物家族蛋白，在擬南芥中，參與植物受到寒冷脅迫時ROS 的清除反應[26]。BnaC09G029500 0ZS主要參與到乙烯的生物合成過程。BnaC09G02 94800ZS、BnaC09G0295100ZS沒有相關注釋信息的基因，但是由于這兩個基因的表達量在子葉時期差異較小，作為候選基因的可能性比較小。

圖3 候選基因表達量分析Fig.3 Candidate gene expression analysis

結(jié)合比較測序的結(jié)果，排除BnaC09G0294600 ZS、BnaC09G0294700ZS、BnaC09G0294800ZS、BnaC09G0294900ZS、BnaC09G0295000ZS、BnaC09G0295100ZS、BnaC09G0295200ZS作為候選基因的可能性。BnaC09G0294300ZS的表達量存在差異，該基因的內(nèi)含子區(qū)域也存在堿基變異。BnaC09G0294400ZS的編碼區(qū)沒有變異，但是表達量存在差異，有可能是啟動子區(qū)發(fā)生變化導致表達量的差異。BnaC09G0294500ZS的表達量存在顯著性差異，在突變體ytl中擴增失敗，有可能該基因在突變體中缺失。 綜上，BnaC09G0294300ZS、BnaC09G0294400ZS、BnaC09G0294500ZS是可能性最大的候選基因。

3 討論與結(jié)論

油菜成苗率提高能夠增加幼苗與雜草的競爭能力。出苗率和成苗率影響作物的密度，從而影響田間覆蓋的完整度和植株的健康程度，進而影響產(chǎn)量。黃化致死表型影響作物成苗率，降低單位面積作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。通過對黃化致死突變體的研究以期豐富甘藍型油菜的種質(zhì)資源，更好地服務于甘藍型油菜植物葉色的突變的基礎研究，為分子育種研究以及改良甘藍型油菜基因編輯系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

圖位克隆技術是正向遺傳學中分離基因的一種有效手段,該技術的關鍵之處就是篩選與目的基因相互連鎖的分子標記并找到足夠多交換單株。近年來,生物信息學和生物基因組學迅速發(fā)展,油菜多個品種的基因組序列相繼宣布,在基因定位中優(yōu)化了尋找標記的途徑，用以設計更加簡單有效的SNP、SSR、InDel 等標記。本研究使用油菜60K SNP芯片結(jié)合圖位克隆技術，將定位區(qū)間縮小到198 kb，標記兩側(cè)仍有交換單株，但后續(xù)的工作中，在區(qū)間內(nèi)還未開發(fā)出多態(tài)性標記，因此無法進一步縮小區(qū)間。

作物有機物積累和產(chǎn)量形成主要依靠葉綠體的光合作用，開展甘藍型油菜黃化致死突變體的基礎研究，能夠豐富油菜光合作用調(diào)控網(wǎng)絡，為提高油菜光合作用以及產(chǎn)量奠定理論基礎。隨著多組學的進步和不同物種基因組的不斷釋放，在模式植物擬南芥和水稻中，人們對于植物葉色突變體的關注逐漸增多，已經(jīng)鑒定出很多控制色素合成和代謝、葉綠體生物合成、光形態(tài)建成途徑中的關鍵基因。但在甘藍型油菜中，對于葉色突變體的研究和報道并不是很多。2000 年，甘藍型油菜中首個葉色突變體Cr被發(fā)現(xiàn)，該突變體在苗期葉色變黃，后期葉色逐漸恢復正常，之后被應用于甘藍型雄性不育雜交育種中[27]。2014 年，Zhu 等通過圖位克隆和遺傳轉(zhuǎn)化的方法確定了BnaC.HO1是控制BnaC.ygl葉色黃化的目的基因[7]。肖華貴等發(fā)現(xiàn)的甘藍型油菜黃化突變體NY在葉片發(fā)育后期甚至到衰老階段才會轉(zhuǎn)綠，在突變體發(fā)育階段，體內(nèi)的葉綠素含量以及光合速率均降低[28]。甘藍型油菜中，通過CRISPR-Cas9技術敲除Bn.YCO，轉(zhuǎn)基因后代由于葉綠素合成和類囊體膜的發(fā)育受阻，出現(xiàn)子葉白化以及后期真葉雜色表型，該基因有可能參與質(zhì)體轉(zhuǎn)錄途徑，并且該突變體中，參與核糖體組裝的相關基因下調(diào)表達[29]。由EMS 誘變得到的Bn.CDE1突變體，該突變體由單顯性基因控制，在發(fā)育時期表現(xiàn)為葉片和花蕾葉綠素合成不足，導致淺綠表型[30]。甘藍型油菜中研究的大多數(shù)葉色突變體為苗期表型黃化，后期葉色恢復正常，突變體均表現(xiàn)為葉綠素含量降低，葉綠體發(fā)育不正常。cyd1基因編碼FtsH1水解酶，該基因突變導致植物無法正常進行光合作用，子葉持續(xù)黃化不返綠，播種10 d 之后死亡[12]，與本研究突變體具有相同的表型。

本研究通過甘藍型油菜60K SNP芯片技術結(jié)合圖位克隆將突變體ytl定位在C09 染色體分子標記SSR-140 和PBZIN-1 之間，該區(qū)段內(nèi)的基因沒有報道過與黃化致死相關的表型，之后對候選基因進行表達量和比較測序分析，預測目的基因。10 個候選基因的表達量在突變體中均下調(diào)表達，可能是由于突變體長勢較弱，植株無法進行光合作用，自我供能不足，影響植株其他的調(diào)控途徑。比如BnaC09G 0294700ZS，在擬南芥中同家族的基因參與調(diào)控植物根系的生長速率，由于突變體不能進行自養(yǎng)，導致植株根系生長能力不足，相關基因表達下調(diào)。在候選區(qū)間內(nèi)的10 個基因中，BnaC09G0294300ZS在擬南芥中的同源基因報道參與植物囊泡的運輸，在葉綠體發(fā)育初期以及后期的正常運作階段涉及大量的蛋白質(zhì)的運輸，該基因編碼區(qū)不存在變化，但是表達量有差異，有可能是啟動子區(qū)發(fā)生變異，所以不排除其為候選基因。BnaC09G0294400ZS在擬南芥中的相關注釋是涉及到蛋白質(zhì)泛素化過程，有可能參與葉綠體的光形態(tài)建成途徑進而影響葉綠素的合成以及改變植物葉片顏色。蛋白質(zhì)泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后的修飾途徑之一，參與多個細胞的基本反應[24]。該基因的編碼區(qū)沒有變異，表達量存在差異，不排除啟動子區(qū)變異導致突變的可能。BnaC09G0294500ZS在擬南芥同源基因中沒有注釋信息，但是表達量存在差異，并且在突變體中擴增失敗，有可能該基因在突變體中缺失導致突變表型，該基因也有可能是目的基因。綜上，預測BnaC09G0294500ZS是目前候選區(qū)間內(nèi)可能性最大的目的基因，但該基因是否為目的基因還需要下一步的研究。