金龍飛，周麗霞，曹紅星，楊耀東

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/海南省熱帶油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 文昌，571339）

作為植物重要的初生代謝物，油脂（主要成分是甘油三酯）是細(xì)胞膜的重要組分和細(xì)胞中的重要儲(chǔ)能物質(zhì)，同時(shí)也參與植物細(xì)胞信號(hào)傳遞、氣孔開閉、授粉受精、種子萌發(fā)、植株生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫等多個(gè)生物學(xué)過程[1]。植物油脂不僅是人類食用油的主要來源，也是肥皂、清潔劑、潤(rùn)滑油等非食品輕工業(yè)的重要原料和可再生生物能源[2]。隨著工業(yè)化的發(fā)展，全球?qū)χ参镉偷男枨笱杆僭鲩L(zhǎng)，預(yù)計(jì)到2030 年的需求量將達(dá)到3.2 億噸，較2012 年翻一番[3]。因此，提高植物油脂的產(chǎn)量以滿足日益增長(zhǎng)的植物油脂需求迫在眉睫。

植物油脂在細(xì)胞的質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，主要包括以下3 個(gè)過程：（1）脂肪酸合成，該反應(yīng)主要在質(zhì)體中進(jìn)行；（2）甘油三脂的合成，游離的脂肪酸被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行甘油三酯的組裝；（3）油體的形成；甘油三酯被包裹成油體并以油體的形式儲(chǔ)存在種子等儲(chǔ)油器官中[4]。糖酵解的產(chǎn)物乙酰-CoA是脂肪酸的合成前體，它首先在乙酰-CoA 羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACCase）的作用下與碳酸鹽合成丙二酰-CoA，然后在脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）復(fù)合體的作用下循環(huán)進(jìn)行縮合、還原、脫水和再還原反應(yīng)，以每次循環(huán)添加2個(gè)碳的方式進(jìn)行脂肪酸鏈的延伸，最終合成16碳的軟脂酸和18 碳的硬脂酸。隨后，合成的脂肪酸以脂酰CoA 的形式外運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)繼續(xù)延伸或者在硬脂酰脫飽和酶（stearoyl-ACP desaturase，SAD）和脂肪酸脫飽和酶（fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）的作用下脫氫合成不飽和脂肪酸。最后，脂肪酸通過真核磷脂生物合成途徑裝配形成甘油三脂。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成的甘油三酯不能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，通常與油體蛋白結(jié)合形成油體，以微粒體的形式儲(chǔ)存在種子等儲(chǔ)油器官中[5]。

目前植物甘油三酯合成途徑已經(jīng)初步闡明，大量編碼合成途徑中的關(guān)鍵酶基因在植物中已經(jīng)被克隆和功能鑒定，為油料作物的遺傳改良和分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。由于油脂的積累涉及多條代謝途徑，采用基因工程技術(shù)特異表達(dá)一個(gè)或者幾個(gè)合成酶基因往往無法大幅提高油脂的積累量。植物油脂的合成除了受到一系列酶的催化作用，還受到大量的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用[6～10]。研究表明，通過調(diào)控一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，激活合成途徑中的一系列基因表達(dá)，能夠使油脂含量大幅提高[11～15]。目前參與植物油脂合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要有WRINKLED1（WRI1）、DNA-BINDING WITH ONE FINGER（DOF）、LEAFY COTYLEDON1（LEC1）、LEAFY COTYLEDON2（LEC2）、FUSCA3（FUS3）、ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3（ABI3）和MYB89等[16]，其中WRI1是研究較多且調(diào)控機(jī)制相對(duì)明晰的轉(zhuǎn)錄因子。

1 WRI1的發(fā)現(xiàn)、起源和進(jìn)化分析

WRI1最早在擬南芥褶皺突變體中發(fā)現(xiàn)，該基因突變導(dǎo)致種子的油脂含量降低80%。由于種子在干燥后表面出現(xiàn)皺縮，由此將該基因命名為WRINKLED 1（WRI1）[17]。WRI1在植物中的功能比較多，包括調(diào)控油脂合成[10,18,19]、開花[20]、種子發(fā)育[21]、根系發(fā)育[22]、纖維發(fā)育[23]、結(jié)瘤[24]、逆境脅迫響應(yīng)[25]等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和大量作物的全基因組測(cè)序工作的完成，科研人員已經(jīng)在多種油料作物和其他經(jīng)濟(jì)作物中成功克隆了WRI1基因，包括單子葉植物的水稻、玉米、燕麥、二穗短柄草、油棕、椰子和雙子葉植物的擬南芥、油菜、棉花、油莎豆、亞麻薺、大豆、油梨、山杏、烏桕等（表1）。不同作物的WRI1同源基因數(shù)目差異較大，在擬南芥、玉米、二穗短柄草、椰子、棉花、蓖麻、油莎豆、大豆和山杏中鑒定1了個(gè)成員，在水稻、油菜和油梨中鑒定了2 個(gè)成員，而在油棕、燕麥、亞麻薺和烏桕中鑒定了3 個(gè)成員。WRI1在多個(gè)物種中的分離和功能鑒定，為明晰WRI1在植物油脂合成中的核心調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

表1 模式植物及油料作物中WRI1的鑒定Table 1 Identification of WRI1 in model plant and oil crops

Tang 等從64 種植物中鑒定WRI1及WRI1類似基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 個(gè)藻類中僅綠色鞭毛藻含有WRI1基因，在微單胞藻和團(tuán)藻中含有WRI1類似基因，而維管植物中都含有WRI1或WRI1類似基因[26]，這表明WRI1是維管植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的，而不為藻類所必需。對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，綠色鞭毛藻的WRI1不含內(nèi)含子，而維管植物的WRI1基因中有6～8 個(gè)內(nèi)含子[26]。晚期內(nèi)含子理論認(rèn)為，內(nèi)含子是植物在進(jìn)化過程中獲得的[27]。因此，植物WRI1轉(zhuǎn)錄因子可能起源于綠藻門。Tang 等對(duì)79 個(gè)WRI1和WRI1類似轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成、保守基序、啟動(dòng)子順式作用元件和系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)化過程中WRI1 的活化區(qū)域增加了大量的酸性氨基酸，多肽的兩端增加了大量基序，啟動(dòng)子區(qū)增加了大量與乙烯、赤霉素、光響應(yīng)組織特異表達(dá)相關(guān)的順式作用元件[26]。這些結(jié)構(gòu)的變化，是植物適應(yīng)外界環(huán)境的一種進(jìn)化機(jī)制。對(duì)79 個(gè)WRI1和WRI1類似基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，將其分為6個(gè)分支，其中團(tuán)藻、微單胞藻、綠色鞭毛藻單獨(dú)在分支I、II 和III 上，維管植物聚在分支IV、V 和VI 上[26]。這進(jìn)一步表明，WRI1和WRI1類似基因可能起源于綠藻門，而被子植物中的WRI1類似基因在系統(tǒng)發(fā)育上與綠藻門和非維管植物中的WRI1相似。

2 WRI1的表達(dá)特征及結(jié)構(gòu)特征

AtWRI1在擬南芥的花、胚珠和種子等器官中表達(dá)量較高，而在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)量較低；亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)其蛋白定位于細(xì)胞核[50]。在油棕中的研究發(fā)現(xiàn)EgWRI1-1在果肉中高表達(dá)，EgWRI1-2和EgWRI1-3在種子中高表達(dá)[32]。在烏桕中有2 個(gè)WRI1基因，其中TsWRI1-1主要在種子內(nèi)表達(dá)，Ts-WRI1-2主要果肉中表達(dá)[49]。油茶種子不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，WRI1在花后333 天（油脂大量積累期）的表達(dá)量顯著高于花后210天（油脂積累初期），差異倍數(shù)高達(dá)249[51]。不同發(fā)育時(shí)期核桃胚的轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn)，WRI1花后63～119 天（油脂大量積累期）的表達(dá)顯著高于花后49 天（油脂積累初期）[52]。這些研究結(jié)果表明WRI1主要在油脂積累的器官和組織高表達(dá)，在油脂快速積累的時(shí)期高表達(dá)。

AtWRI1含有7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子（圖1A），編碼的多肽含兩個(gè)長(zhǎng)度分別為69 和111 個(gè)氨基酸的APETALA2（AP2）結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/EREPB 家族中的AP2 亞族。另外，AtWRI1 內(nèi)部還含有3 個(gè)長(zhǎng)度分別為65、76 和65 個(gè)氨基酸的固有無序區(qū)（Intrinsically disordered regions，IDRs）功能域[17]。氨基酸功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)WRI1的轉(zhuǎn)錄激活功能域在第307-397 個(gè)氨基酸位點(diǎn)[53]，第99-101 個(gè)氨基酸位點(diǎn)的纈氨酸-酪氨酸-亮氨酸（VYL）是WRI1 與下游靶基因結(jié)合功能的位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變后導(dǎo)致AtWRI1 的功能缺失[31]；在水稻中的研究發(fā)現(xiàn)OsWRI1-1 在該位點(diǎn)是甘氨酸-半胱氨酸-亮氨酸（GCL），也具有WRI1控制脂肪酸合成的功能[37]。AtWRI1 的蛋白修飾位點(diǎn)有4個(gè)：第2和3氨基酸位點(diǎn)的賴氨酸是泛素化結(jié)合位點(diǎn)[54]，第78-92 個(gè)氨基酸位點(diǎn)是14-3-3 蛋白和BPM 的結(jié)合位點(diǎn)[55～57]，第70 個(gè)氨基酸位點(diǎn)蘇氨酸和第166 個(gè)氨基酸位點(diǎn)的絲氨酸是KIN10 激酶的磷酸化位點(diǎn)[58]。在IDR3 中還含有一個(gè)可被磷酸化的PEST-基序，該基序的缺失或磷酸化位點(diǎn)的突變都會(huì)增加WRI1 蛋白的穩(wěn)定，進(jìn)而增強(qiáng)油脂的合成[53]。在油棕WRI1-1 中的研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白碳端的PEST-基序出現(xiàn)缺失，但仍然能夠調(diào)控脂肪酸的合成并能恢復(fù)wri1突變體的表型缺失[31]（圖1B）。這些功能位點(diǎn)的鑒定是明確WRI1 互作網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)，是否還有其他重要的功能位點(diǎn)有待進(jìn)一步的發(fā)掘。為了研究WRI1上游的調(diào)控機(jī)制，對(duì)其啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行分析是必不可少的。Yeap 等在油棕EgWRI1-1的啟動(dòng)子上鑒定了2 個(gè)CTTAAT、2 個(gè)W-box 和1 個(gè)ABRE 元件[32]（圖1C）。唐躍輝等在麻瘋樹JcWRI1基因啟動(dòng)子上鑒定了胚乳特異表達(dá)、脫落酸響應(yīng)、光響應(yīng)和脅迫響應(yīng)等順式作用元件[59]。邵宇鵬等在大豆GmWRI1a基因啟動(dòng)子上鑒定了乙烯、茉莉酸、赤霉素3 種激素響應(yīng)元件[60]。這些研究表明WRI 調(diào)控植物油脂合成過程可能受到植物激素和逆境脅迫的影響。

圖1 WRI1的結(jié)構(gòu)特征[32,61,62]（A）AtWRI1的基因結(jié)構(gòu)，（B）AtWRI1的氨基酸結(jié)構(gòu)，（C）EgWRI1-1啟動(dòng)子順式作用元件Fig.1 Structural characteristics of WRI1 including gene structure of AtWRI1(A),amino acid structure of AtWRI1(B),ciselement in the promoter of EgWRI1-1(C)

3 WRI1在油脂合成中的功能

Ruuska 等通過對(duì)擬南芥wri1功能缺失突變體的內(nèi)含物分析發(fā)現(xiàn)，突變體中油脂含量降低了80%，糖含量增加了2 倍，而蛋白含量變化差異不大。采用基因芯片對(duì)突變體和野生型進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，發(fā)現(xiàn)突變體中35%的基因下調(diào)表達(dá)，其中大量是參與糖酵解和脂肪酸代謝相關(guān)的基因[63]，這表明WRI1可能通過調(diào)控糖酵解和脂肪酸的代謝控制植物油脂的積累。表達(dá)特征分析發(fā)現(xiàn)，WRI1在含油量高的燕麥和蓖麻中的表達(dá)量顯著高于含淀粉量高的小麥[64]；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)WRI1在高含油量的黃油莎草中的表達(dá)量是低含油量的紫油莎草14.3 倍[65]；油茶中的研究也發(fā)現(xiàn)WRI1在高含油量的品種中的表達(dá)量顯著高于低含油量的品種[66]。這些研究表明WRI1的表達(dá)量高低與含油量的高低密切相關(guān)。在棕櫚科親緣關(guān)系較近的糖料作物椰棗和油料作物油棕的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，WRI1在積累油脂的油棕果肉中的表達(dá)量是椰棗果肉的57 倍[30]，這表明WRI1的表達(dá)高低是決定光合產(chǎn)物流向糖類或油的關(guān)鍵因子。Baud 和Graham 進(jìn)一步對(duì)該突變體糖酵解相關(guān)酶活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變體中葡萄糖激酶和果糖激酶的活性大幅度降低[67]，表明WRI1通過調(diào)控糖酵解過程中的關(guān)鍵酶活性，參與對(duì)糖代謝的調(diào)控。大量的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)WRI1能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的油脂積累，降低WRI1的表達(dá)量則顯著抑制油脂的積累。例如，超量表達(dá)AtWRI1能夠提高擬南芥種子和幼苗中的甘油三酯含量；降低AtWRI1的表達(dá)量則導(dǎo)致蔗糖轉(zhuǎn)化合成脂肪酸受阻，種子中的甘油三酯含量降低[38]。在擬南芥wri1-7突變體中異源表達(dá)GhWRI1能夠恢復(fù)突變體的低含油量表型[68]，在陸地棉中超量表達(dá)GhWRI后轉(zhuǎn)基因棉花種子的油含量增加22%[69]，在麻瘋樹中超量表達(dá)JcWRI1后轉(zhuǎn)基因植株的種子大小和含油量都顯著高于野生型[51]。在高溫脅迫下，油菜BnWRI1及其下游靶基因下調(diào)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致種子中的糖含量增加，油脂含量降低[70]。AtWRI1還能改變油脂的脂肪酸組分，提高軟脂酸的含量[71]。這些研究表明WRI1是通過控制光合作用固定的碳的流向，調(diào)控油脂的合成。

4 WRI1的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機(jī)制

植物在適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境變化過程中，進(jìn)化出一套復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，即在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而達(dá)到基因的時(shí)空和組織差異表達(dá)[72]。這種精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制能夠保證在環(huán)境變化時(shí)，植物能夠?qū)⒎e累的光合產(chǎn)物用于合成代謝必需的物質(zhì)。目前，已明確的WRI1上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子主要 有LEC1、LEC2、FUS3、NF-YA3和MYB89等（圖2）。

圖2 WRI1調(diào)控植物油脂合成的模式圖Fig 2 Regulatory mechanism of WRI1 in plant oil biosynthesis

4.1 正調(diào)控因子

LEC1編碼核因子Y 蛋白的B 亞基（NF-YB），參與植物胚發(fā)生和脂肪酸的合成[73]。在擬南芥LEC1功能獲得性突變體tnp中，AtWRI1的表達(dá)量顯著增高[74]，在超量表達(dá)AtLEC1的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的At-WRI1的表達(dá)量也顯著高于野生型[75]，這表明AtLEC1可能正調(diào)控AtWRI1的表達(dá)。在單子葉植物玉米中的研究發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)ZmLEC1能夠顯著提高Zm-WRI1的表達(dá)量[28,76]。隨后，Pelletier 采用染色質(zhì)免疫沉淀和基因芯片技術(shù)證明WRI是LEC1下游的直接靶基因[77]。LEC1 能夠直接與WRI1的啟動(dòng)子互作，正調(diào)控WRI1的表達(dá)，參與油脂的積累。LEC2編碼一類B3功能域蛋白，參與植物胚發(fā)生和脂肪酸的合成[78]。在超量表達(dá)AtLEC2的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中AtWRI1的表達(dá)量顯著高于野生型，而在lec2功能缺失突變體中AtWRI1的表達(dá)量顯著低于野生型[50，79]。在大豆中也有類似的研究，在超量表達(dá)GmLEC2的大豆轉(zhuǎn)基因株系中GmWRI1的表達(dá)量顯著高于野生型[44]。上述研究表明LEC2也可能是正調(diào)控WRI1的表達(dá)促進(jìn)油脂的積累。FUS3也是LEC轉(zhuǎn)錄因子的成員之一，參與植物種子胚發(fā)育后期的調(diào)控[80]。在擬南芥fus3功能缺失突變體中，AtWRI1的表達(dá)量顯著低于野生型[81]；染色質(zhì)免疫沉淀和基因芯片實(shí)驗(yàn)證明WRI1是FUS3的直接靶基因[82]。FUS能夠直接正調(diào)控WRI1的表達(dá)，控制油脂的積累。NF-YA3編碼核因子Y 蛋白的A 亞基（Nuclear factor-Y），能夠特異地與CCAAT 結(jié)合[83]。在油棕中的研究發(fā)現(xiàn)EgWRI1-1在果肉中高表達(dá)，調(diào)控油脂的積累，而EgLEC1和EgLEC2在在果肉中卻檢測(cè)不到，這表明EgWRI1-1可能有獨(dú)立于LEC1和LEC2的上游調(diào)控機(jī)制[32]。EMSA 和酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證明EgNF-YA3能夠直接與EgWRI1-1互作，活化下游的脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)油脂的積累[32]。

4.2 負(fù)調(diào)控因子

LEC1、LEC2、FUS3、NF-YA3是WRI1的正調(diào)控因子，而MYB89和TCP則是WRI1的負(fù)調(diào)控因子。在超量表達(dá)AtMYB89的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中，At-WRI1的表達(dá)量顯著低于野生型；而在myb89功能缺失突變體中，AtWRI1的表達(dá)量顯著高于野生型，染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明MYB89 直接結(jié)合在AtWRI1的啟動(dòng)子上，抑制其表達(dá)[84]。

除了這些轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)RI1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，WRI1本身可能還存在一種負(fù)向自我調(diào)控機(jī)制。Snell 等把擬南芥不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子連上GUS報(bào)告基因載體和組成型表達(dá)擬南芥、燕麥、油莎草和馬鈴薯的WRI1基因的載體，在煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)增加WRI1的表達(dá)量能夠降低GUS 活性，這表明WRI1基因能夠負(fù)調(diào)控?cái)M南芥WRI1上游的轉(zhuǎn)錄活性[85]。而采用熒光電泳遷移率試驗(yàn)對(duì)WRI1及其上游啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行體外互作檢測(cè)，卻發(fā)現(xiàn)WRI1 并不能直接與其啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而推測(cè)WRI1可能是通過下游的靶基因?qū)ζ浔旧磉M(jìn)行負(fù)調(diào)控[85]，而具體是哪個(gè)靶基因還有待進(jìn)一步的研究。

5 WRI1的翻譯后水平調(diào)控機(jī)制

基因在行使生物學(xué)功能的過程中除了受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，還受到翻譯后水平的微調(diào)控，包括蛋白之間互作引起的蛋白穩(wěn)定性和活性改變，進(jìn)而避免生物體內(nèi)關(guān)鍵的生物學(xué)過程被過度激活[86～88]。目前已發(fā)現(xiàn)與WRI1 互作的蛋白主要有14-3-3 蛋白 、MEDIATOR15 （MED15） BTB/POZ-MATH1（BPM1）、KIN10 激酶和TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/ PROLIFERATING CELL FACTOR4（TCP4）等。

5.1 正調(diào)控蛋白

14-3-3 蛋白是一類高度保守并在真核生物中普遍存在的調(diào)節(jié)蛋白，通過識(shí)別特異的磷酸化序列與靶蛋白相互作用，參與多種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、各種代謝調(diào)控、物質(zhì)運(yùn)輸和光信號(hào)應(yīng)答等調(diào)控過程[89]。14-3-3 蛋白也能夠與AtWRI1 互作，調(diào)控油脂的合成。在擬南芥中超量表達(dá)14-3-3顯著提高轉(zhuǎn)基因植株AtWRI1的表達(dá)量和蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高種子的含油量[56]；在煙草葉片中瞬時(shí)共表達(dá)At-WRI1和14-3-3顯著提高煙草葉片的含油量[90]。14-3-3 蛋白與WRI1 互作區(qū)域與BPM 的重疊在一起。利用轉(zhuǎn)錄因子招募中介因子復(fù)合物來行使生物學(xué)功能是真核生物的一種保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制[91]。Kim 采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明擬南芥的中介復(fù)合物MED15 亞基能夠與AtWRI1 結(jié)合，在擬南芥中超量表達(dá)MED15能夠提高靶基因AtWRI1的表達(dá)量，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植株的含油量；而沉默MED15顯著降低AtWRI1的表達(dá)量和轉(zhuǎn)基因植株的含油量[54]。然而，在wri1功能缺失突變體中超量表達(dá)MED15也能夠提高AtWRI1的靶基因的表達(dá)量，這表明MED15可能與其他轉(zhuǎn)錄因子互作，活化下游脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，參與植物油脂合成的調(diào)控。

5.2 負(fù)調(diào)控蛋白

BPM1 是一類含有BTB/POZ 折疊和MATH 功能域的蛋白[92]，能夠作為CULLIN3（CUL3）介導(dǎo)的E3泛素連接酶的銜接蛋白[55]。Chen 等采用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)BPM1 能夠與AtWRI1 直接互作，而且AtWRI1 能夠與BPM 家族的其他成員（包括BPM3、4和5）互作；BPM1 對(duì)WRI1 進(jìn)行特異識(shí)別后，進(jìn)行蛋白泛素化降解，進(jìn)而通過調(diào)控WRI1 蛋白的積累量來參與植物油脂合成的調(diào)控。BPM1 與AtWRI1 的結(jié)合位點(diǎn)在第一個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域的78-92個(gè)氨基酸位點(diǎn)[55]。翻譯后的蛋白修飾，例如蛋白磷酸化，在植物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中也起著重要的作用[93]。K10 是一種蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶（SNF1-related protein kinase）的催化亞基，在植物能量信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的轉(zhuǎn)錄控制中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[94]。K10 介導(dǎo)At-WRI1 的70 位點(diǎn)的蘇氨酸和166 位點(diǎn)的絲氨酸的磷酸化降解，磷酸化的AtWRI1 蛋白降解速度顯著高于未磷酸化的；兩個(gè)位點(diǎn)突變后能夠增強(qiáng)AtWRI1蛋白的穩(wěn)定性，AtWRI1的表達(dá)量也上調(diào)2-3倍[58]，這表明K10 在翻譯后水平負(fù)調(diào)控AtWRI1 蛋白的積累，負(fù)調(diào)控油脂的合成。TCP是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在植物多個(gè)生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)TCP4參與植物油脂合成的調(diào)控[95]。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TCP4 能夠與AtWRI1 在體外和體內(nèi)互作，與單獨(dú)瞬時(shí)表達(dá)AtWRI1相比，瞬時(shí)共表達(dá)AtWRI1和TCP4的煙草葉片的甘油三酯的含量顯著降低，而且AtWRI1對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活的活性顯著降低[96]，這表明TCP4在翻譯后水平通過抑制AtWRI1的轉(zhuǎn)錄激活的活性而負(fù)調(diào)控植物油脂的合成。

6 WRI1下游的靶基因

轉(zhuǎn)錄因子通過對(duì)下游靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控而行使生物學(xué)功能，挖掘WRI1 下游的靶基因是研究其生物學(xué)功能的重要途徑。早期，通過對(duì)擬南芥wri1突變體種子發(fā)育的研究顯示約1%所測(cè)基因的表達(dá)水平明顯低于野生型，這些基因多數(shù)為參與碳水化合物或脂肪代謝的基因[67,97,98]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析也發(fā)現(xiàn)WRI1能夠與17個(gè)參與油脂合成的酶蛋白互作[51]。通過突變體和WRI1過表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，超量表達(dá)WRI1之后，編碼糖酵解后期相關(guān)酶基因，例如β-淀粉酶（β-Amylase，BAM）、蔗糖合酶（sucrose synthase，SUS2）、果糖激酶（fructokinase，F(xiàn)K）、葡萄糖激酶（glucokinase，GK）、磷酸甘油酸變位酶（phosphoglycerate mutase，PGAM）、質(zhì)體丙酮酸激酶α 亞基（plastid pyruvate kinase-α subunit，PKp-α）、質(zhì)體丙酮酸激酶β 亞基（plastid pyruvate kinase-β subunit，PKp-β）、丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）和編碼質(zhì)體脂肪酸合成相關(guān)酶基因，例如 乙 酰CoA 羧 化 酶（acetyl CoA carboxylase，ACCase）、?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP1）、β-酮脂酰-ACP 合酶（β-Ketoacyl-ACP synthase，KASI、KASII、KASIII）、烯酰-ACP 還原酶（enoyl-ACP reductase，EAR）、脂酰-ACP 硫酯酶A（fatty acyl-ACP thioesterase A，F(xiàn)ATA）、脂酰-ACP 硫酯酶B（fatty acyl-ACP thioesterase B，F(xiàn)ATB）、脂肪酸合成酶2（fatty acid biosynthesis 2，F(xiàn)AB2）、?；??；d體蛋白1（acyl-acyl carrier protein，AAD1）、AAD5、脂酰-ACP硫酯酶B 長(zhǎng)鏈酰CoA 合成酶（long-chain acyl-CoA synthetase，LACS）、溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶（lysophosphaditic acid acyltransferase、LPAAT）、生物素羧基載體蛋白亞基（biotin carboxyl carrier protein，BCCP2）和生物素結(jié)合域蛋白（biotin attachment domain-containing，BADC）等相關(guān)基因（圖2）上調(diào)表達(dá)，而在wri1突變體中這些基因下調(diào)表達(dá)[50,63,97,99]。對(duì)這些候選的靶基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在靠近起始密碼位點(diǎn)附近的區(qū)域大多含有一個(gè)AW 盒[CnTnG(n)7CG]或15 個(gè)堿基的[CAAAAG(T/G)AGG(G/A)GTTT]元件[97]。對(duì)Pl-PKb1基因的AW 盒進(jìn)行點(diǎn)突變后，AtWRI1不能活化Pl-PKb1的表達(dá)[97]，這表明AtWRI1通過與啟動(dòng)子含有AW 盒的糖酵解和脂肪酸合成相關(guān)基因互作調(diào)控油脂的合成。但這些靶基因大都是通過表達(dá)分析預(yù)測(cè)，僅有少部分靶基因與WRI1的互作關(guān)系被證實(shí)，明確WRI1與下游靶基因的互作關(guān)系是研究WRI1調(diào)控植物油脂合成機(jī)理的關(guān)鍵。

7 展望

自1998 年WRI1首先在擬南芥褶皺突變體中被發(fā)現(xiàn)以來，圍繞WRI1在脂肪酸合成中的生物學(xué)功能挖掘展開了大量的研究，基本明確了WRI1的上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯后水平的修飾以及下游的靶基因等一系列網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，但對(duì)其精準(zhǔn)的調(diào)控機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。例如，雖然LEC1、LEC2、FUS3、NF-YA3和MYB89已確定是WRI1的上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，但是它們?cè)赪RI1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)還不明確。大量關(guān)于WRI1的研究都是基于模式植物擬南芥開展的，而在其他大宗油料作物，例如大豆、油菜、花生、油茶、油棕、油橄欖中的研究相對(duì)較少；在油料作物中的研究也都集中在種子器官產(chǎn)油的大豆、油菜和花生等油料作物上，在非種子產(chǎn)油器官的油料作物，例如油棕、油橄欖、烏桕和油梨等油料作物中的研究還少見報(bào)道，尤其是在非種子產(chǎn)油器官油料作物中是否還有其他的上游調(diào)控因子調(diào)控WRI1的表達(dá)，還需要深入探究。因此，開展非種子器官產(chǎn)油的油料作物中WRI1的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制研究，能夠逐步深化其在油脂合成中的調(diào)控機(jī)理。

非編碼RNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在油脂合成中也起著重要的作用，而且非編碼RNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控屬于精細(xì)水平的調(diào)控，能精準(zhǔn)地調(diào)控生物學(xué)過程[100]。例如miR1202 通過靶向調(diào)控FAD3控制柳枝稷不飽和脂肪酸的合成[101]，miR854 通過靶向調(diào)控KCS控制油菜脂肪酸碳鏈的延長(zhǎng)[102]，miR156c、miR397 和miR444b 通過靶向調(diào)控ACC1、LACS9和LACS4而調(diào)控油棕脂肪酸的合成[76]，miR319 通過控制靶基因TCP，而TCP 能夠與WRI1 蛋白互作，進(jìn)而調(diào)控脂肪酸的合成[96]。是否也存在非編碼RNA 直接參與WRI1 介導(dǎo)的脂肪酸合成調(diào)控機(jī)制？利用在線 軟 件psRNATarget （http://plantgrn. noble. org/psRNATarget/home）對(duì)可能調(diào)控AtWRI1的miRNA 進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)20 個(gè)候選的miRNA，包括miR156、 miR164、 miR780、 miR816、 miR838、miR854、miR5021 和miR5998 等。這 些miRNAs 是否能在轉(zhuǎn)錄后水平靶向調(diào)控WRI1的表達(dá)，進(jìn)而控制油脂的合成，還需要采用煙草共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和5’RACE技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

WRI1下游的靶基因大都是通過分析過表達(dá)和突變體中的差異表達(dá)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，WRI1與靶基因的互作關(guān)系沒有明確。大多數(shù)的研究表明WRI1正調(diào)控油脂的合成，最近的研究發(fā)現(xiàn)WRI1能夠與BADC互作抑制油脂的合成[99]，這表明WRI1可能在油脂合成中存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。除了AW 盒之外，WRI1是否還存在其他的結(jié)合位點(diǎn)？因此挖掘WRI1的潛在靶基因，并進(jìn)行功能驗(yàn)證是明確WRI1 調(diào)控油脂合成機(jī)制的關(guān)鍵。闡明上述問題將有助于系統(tǒng)地闡明WRI1對(duì)調(diào)控植物油脂合成的生物學(xué)功能，深化對(duì)植物油脂調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，并為后續(xù)開展油料作物分子育種提供理論依據(jù)。