劉晶晶，龐葉洲，張敬澤

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所，杭州 310058）

茄（Solanum melongenaL.）是世界上最主要的蔬菜作物之一，我國(guó)是世界上最大的茄子生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1]。茄子在浙江省的種植面積達(dá)到26 667 hm2（根據(jù)浙江省農(nóng)業(yè)廳2018年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)），是受到消費(fèi)者們歡迎的蔬菜產(chǎn)品之一。但近年來(lái)，茄子黃萎病在浙江一些地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，尤其在大棚溫室條件下，該病害的發(fā)生嚴(yán)重影響了茄子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

茄子黃萎病是由土傳病原輪枝菌（Verticilliumspp.）引起的。國(guó)內(nèi)的一些研究報(bào)道認(rèn)為，茄子黃萎病主要是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的。然而，大麗輪枝菌寄主廣泛，依據(jù)致病性被劃分為落葉型和非落葉型2種致病株系[2]，而依據(jù)寄主的抗性遺傳，該病原菌又被劃分為1號(hào)生理小種和2號(hào)生理小種2類小種[3-4]。大麗輪枝菌的1號(hào)生理小種只在缺少抗病基因Ve1的寄主上具有致病性，而2號(hào)生理小種能夠克服抗病基因Ve1介導(dǎo)的抗病性。利用特異性引物，病原菌生理小種能被鑒定，為抗病品種的選擇和利用提供了重要信息。但迄今為止，在浙江危害茄子的病原菌致病型和生理小種類型尚未見報(bào)道。

大麗輪枝菌產(chǎn)生黑色多細(xì)胞微菌核，長(zhǎng)期存活于土壤中，使茄子黃萎病成為最難防治的土傳病害之一。雖然利用抗病品種防治黃萎病是最經(jīng)濟(jì)和有效的手段，但生產(chǎn)上還缺乏免疫或高抗的優(yōu)良茄子品種。一些研究認(rèn)為：作物輪作對(duì)此病害的防治是有效的，但由于農(nóng)業(yè)栽培面積的限制，這項(xiàng)技術(shù)還不能被廣泛應(yīng)用[5]；多菌靈、三環(huán)唑苯來(lái)特和托布津類殺菌劑被認(rèn)為可以有效防治輪枝菌引起的病害[6-7]，但迄今還沒(méi)有注冊(cè)用于防治該類病害的殺菌劑[8]。另外，病原菌一旦進(jìn)入寄主木質(zhì)部，殺菌劑便失去了對(duì)病原菌的抑制作用。同時(shí)，殺菌劑的廣泛使用也使得人們對(duì)環(huán)境和健康問(wèn)題開始擔(dān)憂。利用微生物進(jìn)行生物防治的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，大量的生防真菌和細(xì)菌已被發(fā)現(xiàn)和深入研究[9-12]，生物防治被認(rèn)為是最有希望替代化學(xué)殺菌劑的方法之一。本實(shí)驗(yàn)室也篩選出了5株多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）株系[13]。其中，體外拮抗活性試驗(yàn)結(jié)果表明，株系ShX301具有最好的抑制效果，該株系被用于棉花黃萎病生防研究，取得了良好的效果。然而，體外篩選拮抗最好的株系與植物體內(nèi)接種試驗(yàn)的結(jié)果有時(shí)沒(méi)有直接的可比性，有研究顯示，一些在體外培養(yǎng)基上對(duì)病原菌無(wú)效的株系卻在植物體內(nèi)試驗(yàn)中是有效的[14]。因此，還需要測(cè)定其余4個(gè)株系在植物體內(nèi)防治病害的試驗(yàn)效果，從而進(jìn)一步評(píng)價(jià)和比較ShX301的生物防治潛力。另外，一些報(bào)道認(rèn)為，多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)[15-16]和脂肽類抗生素[17-19]，它們是拮抗病原菌的主要物質(zhì)；但這些揮發(fā)性物質(zhì)是否含有脂肽類化合物成分，在這5個(gè)株系中還沒(méi)有被分析。因此，本研究觀察了茄子黃萎病在浙江省紹興市上虞區(qū)大棚溫室內(nèi)的發(fā)生情況，鑒定了致病病原菌種類，測(cè)定了病原菌致病型和生理小種；利用獲得的多粘類芽孢桿菌進(jìn)行了茄子黃萎病的防治研究，并通過(guò)測(cè)定多粘類芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果，以及利用

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）全細(xì)胞原位檢測(cè)技術(shù)測(cè)定了多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽化合物，揭示了它們的主要拮抗機(jī)制。這為茄子黃萎病的生物防治提供了可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害觀察

為了明確茄子黃萎病害在大棚溫室內(nèi)的發(fā)生情況，于2017—2018年在浙江省紹興市上虞區(qū)崧廈鎮(zhèn)進(jìn)行了病害定點(diǎn)觀察。選擇不同的茄子栽培品種，包括杭茄2010、秀峰紫長(zhǎng)茄、杭茄一號(hào)、杭茄六號(hào)、紫光、紫軒、引茄等，進(jìn)行病害觀察和癥狀描述。同時(shí)，采集具有典型癥狀的樣品，用于室內(nèi)茄子黃萎病病原菌的分離。

1.2 病原菌分離鑒定和致病性試驗(yàn)

用采集的樣品進(jìn)行茄子黃萎病病原菌的分離。采用水瓊脂培養(yǎng)基（water agar media,WA）對(duì)病株進(jìn)行組織分離和培養(yǎng)，依據(jù)形態(tài)學(xué)和微菌核特征進(jìn)行病原菌鑒定。選擇代表性的株系進(jìn)行單孢分離純化。將獲得的單孢子株系分裝在含有20%甘油的離心管（1.5 mL）中，在－70℃條件下保存。

為了用分離的菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn)，選用杭茄2010作為測(cè)試品種。將茄子種子催芽后，播種到含有營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的塑料盆中，放置在28℃光照16 h和22℃黑暗8 h交替的培養(yǎng)箱中，4葉期后用于接種。用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth,PDB）制備分生孢子懸浮液，采用切根接種法接種，觀察不同分離株系的病害發(fā)生情況。

1.3 病原菌致病型的測(cè)定

為了明確分離所得的茄子黃萎病病原菌的致病型，用特異性引物對(duì)INTD2f/INTD2r和INTNDf/INTNDr對(duì)病原菌的基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增[20]。以非落葉型菌株BP2、TX9及落葉型菌株VD084、VD991為參照株系。病原菌基因組DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法[20]。所用引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 病原菌生理小種的測(cè)定

為了鑒定病原菌生理小種類型，采用大麗輪枝菌1號(hào)生理小種的特異性引物對(duì)vdr1/vdr2[3]和2號(hào)生理小種特異性引物對(duì)vdR2F/vdR2R[4]對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；蚪MDNA提取方法和引物合成同1.3。

1.5 多粘類芽孢桿菌對(duì)病原菌拮抗活性的室內(nèi)測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)方法[10,13]，室內(nèi)測(cè)定本實(shí)驗(yàn)室篩選的5株多粘類芽孢桿菌菌株（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）對(duì)分離于茄子上的病原菌菌絲的抑制效果。多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液的制備：將菌株接種在改良的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（酵母粉1 g，牛肉膏3 g，蛋白胨 5 g，蔗糖10 g，pH 7.2）中，在 200 r/min、30℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h。首先將含有病原菌的菌餅接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基平板中心，然后在距離平板中心2.5 cm的十字交叉線上放置4個(gè)含有多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液細(xì)胞的濾紙片（直徑8 mm）。將平板放置在27℃黑暗條件下培養(yǎng)。以不含細(xì)菌細(xì)胞的濾紙片作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。

為了室內(nèi)測(cè)定多粘類芽孢桿菌對(duì)病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果，將制備的大麗輪枝菌孢子懸浮液（1×106CUF/mL）200 μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，在無(wú)菌通風(fēng)櫥中除去多余水分后，接種含有多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液細(xì)胞的濾紙片于平板中央。將平板放置在27℃黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d后，測(cè)量抑菌圈直徑；以接種無(wú)細(xì)菌細(xì)胞的濾紙片作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。

為了明確多粘類芽孢桿菌株系是否產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，以及揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用[16]，采用間隔培養(yǎng)皿進(jìn)行測(cè)定。制備含有PDA的間隔培養(yǎng)皿平板，將含有大麗輪枝菌菌絲的菌餅（直徑5 mm）接種在一室中心，另一室涂布100 μL多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液（1×108CUF/mL），將培養(yǎng)皿放置在26℃黑暗條件下培養(yǎng)。于接種3、5和7 d后，測(cè)量菌落直徑。以涂布滅菌水的處理作為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 茄子黃萎病防治試驗(yàn)

選用茄子品種杭茄2010作為接種植物，用分離于茄子上的大麗輪枝菌SY1-1株系制備微菌核。首先，從20個(gè)培養(yǎng)皿上刮取在PDA上培養(yǎng)40 d左右的微菌核，然后與土壤基質(zhì)[V（田間土壤）∶V（蛭石）∶V（營(yíng)養(yǎng)土）=1∶1∶1]混合均勻，分裝在塑料小盆中，使基質(zhì)中微菌核的數(shù)量達(dá)115個(gè)/g[21]。將種子催芽后播種于含有微菌核土壤基質(zhì)的塑料小盆中，并將塑料小盆置于可容納20個(gè)小盆的塑料盤中。以播種不含有病原菌種子的土壤基質(zhì)小盆作為對(duì)照。然后，每個(gè)小盆接種10 mL（1×108CFU/mL）生防菌（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）的發(fā)酵液。以僅接種生防菌發(fā)酵液或不含生防菌的培養(yǎng)液的處理作為對(duì)照。每個(gè)處理為1盤（20個(gè)植株），且每個(gè)處理重復(fù)3次。將塑料盤置于28℃光照16 h和20℃黑暗8 h交替的培養(yǎng)室中，觀察黃萎病的發(fā)病和發(fā)展情況。50 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病害嚴(yán)重度（disease severity,DS）比率。茄子黃萎病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則第34部分：殺菌劑防治茄子黃萎病》（NY/T 1464.34—2010）（0級(jí)：無(wú)病害癥狀；1級(jí)：病葉數(shù)小于10%；3級(jí)：病葉數(shù)在11%～25%之間；5級(jí)：病葉數(shù)在26%～50%之間；7級(jí)：病葉數(shù)大于50%，且未死亡；9級(jí)：植株死亡），統(tǒng)計(jì)病害嚴(yán)重度比率[22]。

1.7 促進(jìn)植物生長(zhǎng)試驗(yàn)

已有研究證實(shí)，5株多粘類芽孢桿菌株系（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）對(duì)棉花有促進(jìn)生長(zhǎng)作用[13]。為了評(píng)價(jià)這些株系是否對(duì)茄子植物也有促進(jìn)生長(zhǎng)作用，進(jìn)行如下試驗(yàn)。將杭茄2010種子催芽后，播種于含有上述土壤基質(zhì)（見1.6節(jié)）的塑料小盆中，每個(gè)小盆接種10 mL（1×108CFU/mL）生防菌發(fā)酵液。用無(wú)菌培養(yǎng)液作為對(duì)照。植物生長(zhǎng)條件如上所述（見1.6節(jié)）。每個(gè)處理包含20個(gè)植株（1盤），且每個(gè)處理重復(fù)3次。50 d后，測(cè)量待測(cè)茄苗莖和根的長(zhǎng)度、植物地上部和地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，分析不同生防株系對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。

1.8MALDI-TOF-MS檢測(cè)

用MALDI-TOF-MS檢測(cè)和分析生防株系（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）的脂肽化合物。在30℃條件下，待生防菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落溶解于含有基質(zhì)溶液的離心管（2.0 mL）中?；|(zhì)液含有10 mg/mL氰基-4-羥基肉桂酸、30%乙腈和0.1%三氟乙酸（TFA）。溶液被混勻后，在5 000 r/min下離心2 min，然后吸取1 μL溶液樣品滴加在MALDI-TOF MTP 384靶盤（Bruker公司，德國(guó)）上，用配置智能光束激光器的ultrafleXtremeTMMALDI-TOF質(zhì)譜儀（Bruker公司，德國(guó)）記錄數(shù)據(jù)。測(cè)量是在反射操作模式和離子源加速電壓20 kV條件下進(jìn)行的。質(zhì)譜分布在0.1～2.0 kDa間的低質(zhì)量范圍區(qū)。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和測(cè)定的脂肽系列質(zhì)譜峰，分析不同株系間產(chǎn)生的脂肽化合物及其對(duì)大麗輪枝菌可能的拮抗機(jī)制。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害觀察的結(jié)果

對(duì)茄子黃萎病定點(diǎn)觀察表明，在溫室大棚中，零星的病株都出現(xiàn)于2017和2018年1月中旬（每年11月下旬移栽于大棚中）。依據(jù)這2年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)：病害發(fā)生1周后，大棚溫室中不同栽培品種的病害發(fā)病率在0.08%～1.1%之間；3周后，不同品種間發(fā)病率在4%～8%之間；隨后，隨著氣溫的上升，發(fā)病率趨于穩(wěn)定，沒(méi)有顯著增加（直至6月中旬采收結(jié)束）。

如圖1所示：茄子黃萎病癥狀首先出現(xiàn)在下部葉片邊緣，呈V字形的褪綠黃斑（圖1A），隨后病斑擴(kuò)大，明顯不受葉脈限制（圖1B）。有時(shí)，侵染的病害僅發(fā)生在葉片的一邊，而另外一邊葉片繼續(xù)生長(zhǎng)，形成半葉癥狀（圖1C）。隨著病害的發(fā)展，病葉下垂，早期被侵染的葉片也開始出現(xiàn)壞死（圖1D）。由于病害向上擴(kuò)展，同一病株上部侵染的病葉邊緣經(jīng)常向內(nèi)卷曲，而下部嚴(yán)重侵染的葉片向下披垂（圖1E）。早期侵染的植株出現(xiàn)矮化，整個(gè)植株呈現(xiàn)枯萎狀，但病葉很少脫落（圖1F），最終整個(gè)植株死亡。

2.2 病原菌分離鑒定和致病性試驗(yàn)結(jié)果

用WA培養(yǎng)基進(jìn)行病原菌的組織分離培養(yǎng)，依據(jù)菌落特征、輪枝形態(tài)和微菌核產(chǎn)生情況，選擇和確定病原菌的菌落。隨后，轉(zhuǎn)移它們到PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，在典型癥狀的病株上都能分離到大麗輪枝菌。選擇來(lái)源于不同地點(diǎn)和不同品種上的菌落進(jìn)行單孢分離，獲得7個(gè)單孢株系[SY1-1（杭茄2010）、SY1-2（秀峰紫長(zhǎng)茄）、SY1-3（紫光）、SY2-1（紫軒）、SY2-2（引茄）、SY3-1（杭茄一號(hào)）、SY3-2（杭茄六號(hào)）]。用這些單孢株系進(jìn)行植株接種試驗(yàn)，結(jié)果顯示：接種2周后，葉片表現(xiàn)黃萎病癥狀；接種3周后，所有植株都能顯示黃萎病典型癥狀。證實(shí)它們都是致病菌。

2.3 病原菌致病型鑒定結(jié)果

圖1 茄子黃萎病癥狀Fig.1 Symptoms of Verticillium wilt of eggplant

用大麗輪枝菌落葉型特異性引物對(duì)擴(kuò)增7個(gè)分離于茄病植株上的分離株系（SY1-1、SY1-2、SY1-3、SY2-1、SY2-2、SY3-1、SY3-2），電泳結(jié)果（圖2）顯示：分離于茄子上的7個(gè)株系和落葉型菌株（VD084和VD991）顯示一個(gè)長(zhǎng)度為460 bp的電泳條帶。相似地，用大麗輪枝菌非落葉型特異性引物對(duì)擴(kuò)增上述株系，僅2個(gè)非落葉型菌株（BP2和TX9）產(chǎn)生長(zhǎng)度為1 160 bp的電泳條帶。這些結(jié)果表明，7個(gè)從茄子病株上分離的菌株均屬于落葉型株系。

2.4 病原菌生理小種的鑒定結(jié)果

用黃萎病菌生理小種1號(hào)和生理小種2號(hào)特異性引物對(duì)擴(kuò)增分離于茄子病株上的7個(gè)菌株（SY1-1、SY1-2、SY1-3、SY2-1、SY2-2、SY3-1、SY3-2），電泳結(jié)果顯示，用生理小種1號(hào)特異性引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物沒(méi)有電泳條帶（圖3A），而用生理小種2號(hào)特異性引物對(duì)擴(kuò)增出一個(gè)長(zhǎng)度約250 bp的電泳條帶（圖3B）。這些結(jié)果表明，7個(gè)從茄子病株上分離的株系均屬于2號(hào)生理小種。

2.5 對(duì)病原菌菌絲及孢子萌發(fā)的抑制效果

5株多粘類芽孢桿菌對(duì)茄子大麗輪枝菌的菌絲抑制作用試驗(yàn)的結(jié)果（表1）顯示：多粘類芽孢桿菌株系對(duì)茄子大麗輪枝菌的菌絲都有顯著的抑制作用，且株系ShX301在接種10 d后顯示出最好的抑制效果（85.23%）（P＜0.05），其次是株系Hb6。對(duì)病原菌孢子萌發(fā)抑制效果顯示，5株多粘類芽孢桿菌對(duì)茄子大麗輪枝菌的分生孢子萌發(fā)都有顯著的抑制作用，其中株系ShX301的抑制效果最顯著（P＜0.05），平均抑制直徑超過(guò)33 mm。這些結(jié)果與前期的研究報(bào)道[13]相似。

2.6 揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

圖2 落葉型和非落葉型特異性引物PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agrose geleletrophoresis ofPCR products of defoliating and nondefoliating pathotype isolates obtained with specific primers

用間隔培養(yǎng)皿測(cè)定5株多粘類芽孢桿菌（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)果顯示，5株多粘類芽孢桿菌都產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，它們對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)都有顯著的抑制作用（P＜0.05）（圖4）。其中，株系Hb6在接種后3、5和7 d顯示最好的抑制效果，且在接種后3和7 d與其他4個(gè)株系間存在顯著差異。

圖3 生理小種1號(hào)和生理小種2號(hào)特異性引物PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agrose gel eletrophoresis of PCR products amplified with race-1 and race-2 specific primers

2.7 對(duì)茄子黃萎病的防治效果

圖4 5株多粘類芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of volatile metabolites produced by five strains of P.polymyxa on hyphal growth of V.dahliae

接種試驗(yàn)結(jié)果表明，5株多粘類芽孢桿菌株系在一定程度上能夠延遲茄子黃萎病的發(fā)病時(shí)間，降低病害發(fā)病率和嚴(yán)重度比率。接種30 d后，僅接種微菌核的處理開始出現(xiàn)癥狀，35 d后，接種“微菌核+ShX302”和“微菌核+ShX303”的處理開始出現(xiàn)癥狀，隨后，接種“微菌核+Hb1”和“微菌核+Hb6”的處理依次開始出現(xiàn)癥狀。而接種“微菌核+ShX301”的處理直到39 d后才開始出現(xiàn)癥狀。統(tǒng)計(jì)接種50 d后發(fā)病率和病害嚴(yán)重度比率的結(jié)果（表2）表明，多粘類芽孢桿菌株系ShX301、Hb6、Hb1、ShX302和ShX303分別使病害發(fā)病率降低30%、25%、23.33%、15%和13.3%，使病害嚴(yán)重度比率減少20.02%、17%、16%、8.76%和6.94%。然而，雖然菌株ShX301對(duì)茄子黃萎病具有最好的防治效果，但與株系Hb6的發(fā)病率間無(wú)顯著差異（P＞0.05），而與其他3個(gè)株系在發(fā)病率間存在顯著差異。

2.8 對(duì)植物生長(zhǎng)促進(jìn)試驗(yàn)結(jié)果

為了評(píng)價(jià)多粘類芽孢桿菌對(duì)茄子生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，將5株多粘類芽孢桿菌株系（ShX301、Hb6、Hb1、ShX302和ShX303）用于接種試驗(yàn)。結(jié)果（圖5）顯示，接種50 d后，與對(duì)照相比，所有株系都顯著促進(jìn)了植株的生長(zhǎng)和生物量的增加。菌株ShX301與其他菌株相比較，顯著促進(jìn)了植株莖的伸長(zhǎng)（P＜0.05），增長(zhǎng)率為59.24%，也促進(jìn)了植株地上和地下部生物量的增加，其中：地上部鮮質(zhì)量為（10.25±0.96）g、干質(zhì)量為（1.15±0.19）g，地下部鮮質(zhì)量為（1.06±0.14）g、干質(zhì)量為（0.21±0.05）g（表3）。其次，菌株Hb6對(duì)茄子生長(zhǎng)的促進(jìn)作用也較顯著。

表2 接種50 d后5株多粘類芽孢桿菌對(duì)茄子黃萎病的防治效果Table 2 Inhibitory efficacy of five P.polymyxa strains against Verticillium wilt of eggplant 50 d after inoculation

圖5 接種50 d后5株多粘類芽孢桿菌對(duì)茄苗生長(zhǎng)的促進(jìn)效果Fig.5 Effects of five P.polymyxa strains on the growth promotion of eggplant seedlings 50 d after inoculation

表3 5株多粘類芽孢桿菌對(duì)茄子生長(zhǎng)促進(jìn)作用的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results for five P.polymyxa strains promoting eggplant plant growth

2.9MALDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果

5株多粘類芽孢桿菌株系（ShX301、Hb6、Hb1、ShX302和ShX303）的MALDI-TOF-MS分析結(jié)果揭示，所有株系共有1個(gè)顯著主峰區(qū)，質(zhì)荷比（m/z）范圍在860～1 050之間（圖6），由系列峰構(gòu)成，它們被歸屬于已知的殺鐮孢菌素（fusaricidins）[23]。然而，株系Hb1還具有另外2個(gè)明顯的峰區(qū)，其質(zhì)荷比（m/z）范圍在1 140～1 200和1 580～1 680之間（圖6A），分別由系列峰構(gòu)成，分別歸屬為多黏菌素（polymyxins）和十三肽素（tridecaptins）[23-27]。雖然株系Hb1擁有多黏菌素和十三肽素，但與其他株系相比較，并沒(méi)有增加其對(duì)大麗輪枝菌的抑制活性，這也與其他研究報(bào)道[17-19]一致。多黏菌素具有一個(gè)窄的抗菌譜，主要對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌具有抗菌活性[25-26]，十三肽素也主要抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的活性[27]。顯然，多粘類芽孢桿菌對(duì)大麗輪枝菌的抑制活性物質(zhì)是殺鐮孢菌素。

圖6 多粘類芽孢桿菌非核糖體脂肽的MALDI-TOF-MS分析圖Fig.6 MALDI-TOF-MS analysis of nonribosomal lipopeptides produced by P.polymyxa strains

殺鐮孢菌素是由一類拮抗真菌的環(huán)脂肽化合物構(gòu)成的[28]，可抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和許多真菌[29-30]。MALDI-TOF-MS分析結(jié)果（表4）顯示，5株多粘類芽孢桿菌株系都產(chǎn)生系列殺鐮孢菌素A（m/z為883,[M+H]+）、B（m/z為897,[M+H]+）、C（m/z為947,[M+H]+）、D（m/z為961,[M+H]+）和LI-F類抗生素[23]，但系列峰的強(qiáng)度明顯不同。

3 討論

茄子黃萎病發(fā)生在我國(guó)許多地區(qū)，但由于茄子栽培方式、環(huán)境條件和使用品種的不同，病害危害程度和表現(xiàn)的癥狀有所變化。對(duì)大棚溫室內(nèi)茄子黃萎病發(fā)生和發(fā)展觀察結(jié)果表明，病害在1月中旬左右開始發(fā)生，持續(xù)發(fā)展到2月底或3月初。這時(shí)期大棚溫室氣溫在22～28℃之間，適合于病原菌生長(zhǎng)發(fā)育，也有利于病害的發(fā)生和發(fā)展。而到3月中旬后，氣溫開始迅速回升，白天氣溫通常超過(guò)30℃，此時(shí)氣溫已不利于病原菌生長(zhǎng)，同樣抑制了病害的發(fā)展。這一觀察結(jié)果與已有報(bào)道[20]相一致，也為病害防治提供了依據(jù)。同時(shí)，我們系統(tǒng)描述了茄子黃萎病發(fā)生和發(fā)展的癥狀變化，為田間病害識(shí)別和診斷提供了參考。另外，對(duì)病原菌的致病型和生理小種鑒定表明，所有分離系均屬于落葉型株系和2號(hào)生理小種，為合理利用和選育抗病品種提供了理論依據(jù)。

一些研究顯示，生防菌體外活性測(cè)定與植物體內(nèi)試驗(yàn)不完全一致。體外測(cè)定的無(wú)活性株系，在植物體內(nèi)試驗(yàn)顯示具有很高的活性[14]。本實(shí)驗(yàn)室成員前期研究表明，室內(nèi)篩選出的株系ShX301對(duì)大麗輪枝菌顯示最高活性[13]，隨后，用ShX301進(jìn)行防治棉花黃萎病和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的體內(nèi)試驗(yàn)，顯示其具有生防菌和促生菌的潛力。然而，由于對(duì)其他4個(gè)株系（Hb6、Hb1、ShX302和ShX303）未進(jìn)行植物體內(nèi)試驗(yàn)，不能說(shuō)明ShX301在植物體內(nèi)條件下也是活性最好的株系。因此，本文用這5個(gè)株系對(duì)分離于茄子上的大麗輪枝菌進(jìn)行了體外和體內(nèi)系統(tǒng)試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)它們的生物防治和促生長(zhǎng)潛力。研究結(jié)果表明，ShX301仍然是它們中最好的生物防治和促生長(zhǎng)株系。該株系已保存在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC 11638），為其利用和開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

表4MALDI-TOF-MS對(duì)多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液的測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results for culture filtrates of P.polymyxa strains by MALDI-TOF-MS

雖然已有的研究揭示了5株多粘類芽孢桿菌的生防潛力，但其對(duì)大麗輪枝菌的作用機(jī)制還不清楚。因此，本文通過(guò)測(cè)定多粘類芽孢桿菌株系揮發(fā)性物質(zhì)和脂肽化合物成分來(lái)揭示其可能的作用機(jī)制。一些研究顯示，多粘類芽孢桿菌（P.polymyxaSb3-1）能通過(guò)釋放出揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)抑制病原菌長(zhǎng)孢輪枝菌（V.longisporum）的生長(zhǎng)[15]，一些化合物已經(jīng)被鑒定[16]。我們的研究結(jié)果也證實(shí)，5個(gè)株系都能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，它們能顯著抑制病原菌生長(zhǎng)，但不同株系間沒(méi)有顯著差異。多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生2類肽類抗生素：一類是多黏菌素（polymyxins）、多肽菌素（polypeptins）、十三肽素（tridecaptins）、gavaserin、saltavalin和喬利肽菌素（jolipeptin），它們主要拮抗細(xì)菌；而另一類是系列LI-F抗生素、谷纈菌素（gatavalin）和殺鐮孢菌素（fusaricidins），它們主要拮抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌[17-19]。MALDI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)，殺鐮孢菌素是多粘類芽孢桿菌拮抗大麗輪枝菌的主要拮抗物質(zhì)，而多黏菌素和十三肽素對(duì)大麗輪枝菌沒(méi)有拮抗活性。殺鐮孢菌素是一類肽抗生素，是具有5-胍基-3-羥基十五烷酸基結(jié)合到一個(gè)自由氨基上的一類環(huán)縮酚酸肽。目前，在多粘類芽孢桿菌中已報(bào)道12個(gè)殺鐮孢菌素，主要包括LI-F03a（殺鐮孢菌素C）、LI-F03b（殺鐮孢菌素D）、LI-F04a（殺鐮孢菌素A）、LI-F04b（殺鐮孢菌素B），以及a和b類似物L(fēng)I-F05到LI-F08[23]。一些研究報(bào)道表明，不同的殺鐮孢菌素類型對(duì)不同病原菌真菌的抗菌活性是不同的，如殺鐮孢菌素A、B、C和D對(duì)尖孢鐮刀菌和番茄灰葡萄孢（Botrytis cinerea）具有顯著的拮抗活性[31-32]，而LI-F類抗生素LI-F03、LI-F04、LI-F05、LI-F07和LI-F08對(duì)一些細(xì)菌和真菌具有不同的抗菌活性水平[29]。MALDITOF-MS分析結(jié)果顯示，5個(gè)多粘類芽孢桿菌株系都產(chǎn)生系列殺鐮孢菌素A、B、C和D及LI-F類抗生素，但他們對(duì)病原菌的拮抗活性明顯不同，可能涉及有效化合物成分及其含量。雖然系列峰的強(qiáng)度在株系間存在差異，但因MALDI-TOF-MS不具有定量分析的功能，峰的強(qiáng)度與化合物含量間沒(méi)有相關(guān)性。因此，本研究也為進(jìn)一步鑒定殺鐮孢菌素對(duì)大麗輪枝菌作用的主要成分及揭示其拮抗機(jī)制提供了重要信息。