馬子華， 張景允， 楊 柳， 田 甜， 湯 雷， 鄭 璐， 蔡 爽， 韓 冰， 謝汝佳， 楊 婷， 楊 勤

(貴州醫(yī)科大學病理生理學教研室， 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550000)

慢性砷(arsenic，As)暴露可引發(fā)肝臟、皮膚、心血管、胃腸道以及神經(jīng)系統(tǒng)等相關疾病[1-2]，肝是砷毒性作用的主要靶器官[3]。印度加爾各達飲水型砷中毒76.6%患者發(fā)生肝臟腫大[4];貴州省燃煤型砷中毒患者中約28.6%死于肝硬化[5];流行病學研究結(jié)果也表明肝硬化和肝癌是砷中毒患者主要的死亡原因[6];張露露等[7]觀察砷可以誘導大鼠發(fā)生肝纖維化。肝纖維化是肝硬化的早期階段，并且有研究表明，肝硬化在肝纖維化階段有逆轉(zhuǎn)的可能[8]。但目前仍缺乏干預砷致肝損傷的臨床治療藥物，因此深入研究砷致肝纖維化發(fā)病機制及藥物干預治療對砷中毒肝硬化防治有重要意義。

氧化苦參堿(oxymatrine, OM)是一種豆科植物提取物，具有抗病毒和抗腫瘤等功效。已有研究表明OM對心肌纖維化有一定的干預治療效果[9]。最近臨床研究表明觀察到氧化苦參堿對慢性病毒性肝炎有一定的療效[10];還有學者用OM作用于肝癌細胞后，檢測到其可以通過影響細胞的能量代謝而抑制細胞增殖[11];我們前期研究也檢測到OM對砷致肝細胞損傷有一定的保護作用，但其中機制尚不清楚。

肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生及發(fā)展過程中的關鍵環(huán)節(jié)[12]。各種損傷因素可通過直接或者間接作用引起HSC激活和增殖，合成并分泌細胞外基質(zhì)增多，導致大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)在肝內(nèi)沉積而發(fā)生肝纖維化[13]。細胞自噬是真核細胞重要的降解/回收系統(tǒng)，通過降解異常多余的蛋白質(zhì)以及受損細胞器，實現(xiàn)細胞器的更新以及營養(yǎng)物質(zhì)的回收利用，在維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，細胞自噬參與了多種疾病的病理過程。有學者觀察到在多種肝臟疾病的病理過程中有細胞自噬的參與,例如病毒性肝炎、酒精性肝炎和急性肝損傷等[14-15]。但有關砷致肝損傷和肝纖維化發(fā)生中細胞自噬的變化國內(nèi)外尚不清楚，OM干預砷致肝纖維化過程中對HSC自噬的研究也未見相關報道。為此，本實驗擬用人肝星狀細胞株LX-2為研究對象，觀察染砷損傷肝細胞培養(yǎng)上清對人肝星狀細胞株LX-2細胞活性及自噬相關蛋白表達的影響，探討細胞自噬在砷致HSC活化中的作用，并觀察OM改善肝纖維化的可能機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝星狀細胞株LX-2(中國科學院上海生科院細胞資源中心)；人胎肝細胞株LO2(中國科學院昆明細胞庫)。亞砷酸鈉(分析純，Sigma)；氧化苦參堿(分析純，南京廣潤生物制品有限公司)；抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、自噬相關基因12(autophagy-related gene 12，Atg12)、自噬相關基因5(autophagy-related gene 5，Atg5)、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和β-肌動蛋白(β-actin)Ⅰ抗(Abcam)；MTT和DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) ELISA Kit(武漢華美生物工程有限公司)。全自動生化分析儀(Olympus)；全波長酶標儀(Thermo)；垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)； 凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)。

亞砷酸鈉染毒溶液的配制：精密稱取適量亞砷酸鈉溶于無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)中，過0.22 μm微孔濾膜制成亞砷酸鈉母液；染毒時稀釋使用。

氧化苦參堿溶液的配制：精密稱取適量氧化苦參堿溶于無菌PBS中，過0.22 μm微孔濾膜制成氧化苦參堿母液；使用時進行稀釋。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人胎肝細胞株LO2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

人肝星狀細胞株LX-2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2亞砷酸鈉上調(diào)LX-2細胞活性

2.2.1全自動生化分析儀檢測染砷LO2細胞培養(yǎng)上清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine ami-notransferase,ALT)水平 100 μmol/L亞砷酸鈉染毒LO2細胞24 h，細胞融合率達80%收取染砷LO2培養(yǎng)上清，低溫離心取上清，一部分使用全自動生化分析儀檢測AST和ALT水平，另一部分置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2MTT法檢測LX-2細胞活力 取對數(shù)期的LX-2細胞制成單細胞懸液，以每孔5 000個細胞均勻接種于96孔板中。將LX-2細胞分為對照組、LO2培養(yǎng)上清組及5%、10%、20%和30%染砷組，同時設置空白組，每組設置5個復孔。待細胞融合率達65%左右時，進行處理。將LO2正常培養(yǎng)上清與正常培養(yǎng)液按照3∶7比例混合后培養(yǎng)正常上清組LX-2細胞24 h，5%、10%、20%和30%染砷上清組分別按照相應比例與正常培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)各組LX-2細胞24 h。棄培養(yǎng)液，加入MTT(5 g/L)每孔20μL后培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO于37 ℃顯色10 min。酶標儀492 nm波長檢測吸光度(A)值。細胞相對活力(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2.2.3ELISA檢測染砷LO2細胞培養(yǎng)上清TGF-β1 細胞培養(yǎng)及提取上清同上。加樣37 ℃孵育2 h，棄液體，生物素標記抗體工作液37 ℃孵育1 h。棄液體并洗板甩干。辣根過氧化物酶標記親和工作液37 ℃孵育1 h。棄液體并洗板甩干。底物溶液37 ℃避光顯色20 min后加入終止液，5 min內(nèi)450 nm波長測量吸光度(A)值。

2.2.4Western blot檢測LX-2細胞活化情況 將細胞隨機分為對照組、LO2培養(yǎng)上清組、5%、10%和20%染砷組，培養(yǎng)方法同上。提取蛋白，10% SDS-PEGA蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Ⅰ抗[β-actin(1 ∶500)和α-SMA(1 ∶5 000)]，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后加入Ⅱ抗(1 ∶4 000)室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，ECL顯示特異性的條帶。

2.2.5分析間接染砷對LX-2細胞活性的影響 綜合2.2.2和2.2.4實驗結(jié)果，篩選出各間接染砷組中促進LX-2細胞活化最為顯著的濃度，將此濃度作為后續(xù)實驗間接染砷組的藥物濃度。

2.3氧化苦參堿干預上調(diào)LX-2細胞活性

2.3.1MTT檢測不同濃度OM處理后LX-2細胞活力的變化 取對數(shù)期的LX-2細胞制成單細胞懸液，以每孔5 000個均勻接種于96孔板中。將細胞分為對照組、間接染砷組及0.1、0.25、0.5、1和1.5 g/L OM干預組，同時設置空白組，每組設置5個復孔。待細胞融合率達65%左右時，進行處理。采用20%染砷上清組培養(yǎng)方法培養(yǎng)間接染砷組及0.1、0.25、0.5、1和1.5 g/L OM干預組24 h。棄培養(yǎng)液，對照組和間接染砷組正常培養(yǎng)，各濃度OM干預組加入相應濃度OM培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，加入MTT(5 g/L)后培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO于37 ℃顯色10 min。酶標儀492 nm波長檢測吸光度(A)值。細胞相對活力(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

2.3.2Western blot檢測活化標志蛋白及自噬相關蛋白 將細胞隨機分為對照組、間接染砷組、低劑量(0.25 g/L)OM干預組和高劑量(1 g/L)OM干預組。細胞融合率達65%時處理細胞，處理方法同2.3.1。收集細胞，提取蛋白。10%、15%SDS-PEGA蛋白分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Ⅰ抗[β-actin(1∶500)、α-SMA(1∶5 000)、Atg12(1∶3 000)、Atg5(1∶5 000)和LC3(1∶3 000)]，置4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后加入Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，ECL顯示特異性條帶。

2.3.3光學顯微鏡觀察油紅O染色 細胞分組及培養(yǎng)同2.3.2。棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定45 min后PBS漂洗，油紅O染色1 h，60%異丙醇漂洗10 s，PBS漂洗。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 亞砷酸鈉染毒LO2細胞培養(yǎng)上清中AST和ALT水平

100 μmol/L亞砷酸鈉作用于LO2細胞24 h，細胞融合率達80%時檢測培養(yǎng)上清中AST和ALT水平，結(jié)果顯示染砷組LO2培養(yǎng)上清中ALT和AST水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 亞砷酸鈉作用于LO2細胞24 h后培養(yǎng)上清中AST和ALT活性的變化

Table 1.The levels of AST and ALT in medium of LO2 cultured with arsenic for 24 h (Mean±SD.n=3)

NaAsO2 (μmol/L)AST (U/L)ALT (U/L)010.41±0.665.24±0.3410060.50±0.77*25.74±0.88*

*P<0.05vs0 μmol/L group.

2 亞砷酸鈉間接增強LX-2細胞活力及活化標志蛋白α-SMA的表達

將未染砷LO2細胞培養(yǎng)上清按照3 ∶7比例與正常培養(yǎng)液混合后培養(yǎng)LX-2細胞，染砷LO2細胞培養(yǎng)上清按5%、10%、20%和30%濃度加入LX-2細胞培養(yǎng)體系中，我們觀察到，與對照組相比較，LO2細胞培養(yǎng)上清組及5%和10%染砷組細胞活力和活化標志蛋白α-SMA表達水平均無顯著差異；20%染砷組與對照組相比較，細胞活力顯著增強(P<0.05)，活化標志蛋白α-SMA表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)；30%染砷組與對照組相比較，細胞活力顯著下降(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 不同濃度染砷LO2培養(yǎng)上清刺激后LX-2細胞活力的變化

Table 2.The effect of arsenic on the viability of LX-2 cells (%.Mean±SD.n=3)

GroupLX-2 cell viabilityControl100.0Normal LO2100.0±2.55% As113.0±40.410% As113.0±40.420% As121.0±30.6*30% As59.7±20.9*

*P<0.05vscontrol group.

根據(jù)實驗結(jié)果分析，20%染砷組藥物刺激LX-2細胞活化的作用顯著，因此將此濃度作為后續(xù)實驗間接染砷的濃度。

3 染砷LO2細胞培養(yǎng)上清中TGF-β1水平

100 μmol/L亞砷酸鈉染毒LO2細胞24 h，細胞融合率達80%培養(yǎng)上清中TGF-β1水平較對照組無顯著差異且呈陰性，見表3。

4 氧化苦參堿干預對間接染砷LX-2細胞活力的影響

不同濃度OM干預間接染砷LX-2細胞24 h，在濃度為0.1～1.5 g/L 范圍內(nèi)，LX-2細胞活力呈濃度依賴性下降(P<0.05)，見表4。

Figure 1.The protein expression of α-SMA in LX-2 cells cultred with different concentrations of arsenic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1 不同濃度染砷LO2培養(yǎng)上清刺激LX-2細胞對α-SMA表達影響

表3 染砷LO2培養(yǎng)上清中TGF-β1水平

Table 3.The level of TGF-β1 in medium of LO2 cells cultured with arsenic (Mean±SD.n=3)

GroupA valueTGF-β1Normal LO20.116±0.202-As LO20.121±0.235-

-: negative.

表4 不同濃度OM對LX-2細胞活力的影響

Table 4.The effect of OM on the viability of LX-2 cells (%. Mean±SD.n=3)

GroupLX-2 cell viabilityControl100.0As121.0±20.7*0.1 g/L OM92.0±43.6*0.25 g/L OM79.0±15.3*0.5 g/L OM70.0±15.3*1 g/L OM53.0±15.3*1.5 g/L OM43.0±20.0*

*P<0.05vscontrol group.

其中0.25和1 g/L OM干預組細胞相對活力分別約為80%和50%，后續(xù)實驗將0.25和1 g/L設為低、高劑量OM干預組藥物濃度。

5 氧化苦參堿干預對砷損傷肝細胞后間接刺激LX-2細胞活化過程中活化標志蛋白和細胞自噬相關蛋白表達水平的影響

與對照組相比較，間接染砷組α-SMA、Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)；低、高劑量OM干預后LX-2細胞α-SMA、Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ較間接染砷組顯著下調(diào)(P<0.05)，且高劑量OM干預組LC3-Ⅱ蛋白表達水平較低劑量OM干預組顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of α-SMA, Atg12, Atg5 and LC3-Ⅱ in activated LX-2 cells cultred with different concentrations of OM. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAs group;△P<0.05vslow-dose OM group.

圖2 OM干預對間接染砷LX-2細胞的α-SMA、自噬相關蛋白表達的影響

6 氧化苦參堿干預對砷損傷肝細胞后間接刺激LX-2細胞過程中脂滴變化的影響

與對照組相比，間接染砷組脂滴顯著減少，而低、高劑量OM干預組脂滴數(shù)量較間接染砷組顯著增加，見圖3。

Figure 3.Lipid droplets in LX-2 cells were observed by oil red O staining. Scale bar=100 μm. A: control group; B: As group; C: low-dose OM group; D: high-dose OM group.

圖3 各組油紅O染色脂滴

討 論

砷致肝纖維化的發(fā)病機制目前尚不清楚，特別是砷致HSC活化的機制是砷的直接還是間接作用國內(nèi)外尚無定論。本項工作采用100 μmol/L亞砷酸鈉染毒LO2細胞24 h，觀察砷致肝細胞損傷后對LX-2細胞活化及自噬相關蛋白表達的影響。在本實驗中，染砷24 h LO2細胞培養(yǎng)上清中AST和ALT含量較正常培養(yǎng)LO2細胞顯著增高，AST和ALT是肝細胞損傷的敏感指標，提示100 μmol/L亞砷酸鈉染毒24 h后存在LO2細胞損傷。使用染砷LO2細胞培養(yǎng)上清按照1 ∶4比例與正常培養(yǎng)液混合后共孵育LX-2細胞24 h后，檢測到其細胞增殖率及活化標志蛋白α-SMA表達水平均顯著上調(diào)，提示砷可通過損傷肝細胞間接促進HSC活化。因此，減輕砷致肝細胞損傷應該是改善砷致肝纖維化的有效途徑之一。

細胞自噬是細胞通過溶酶體降解自身錯誤、異常蛋白或細胞器以維持細胞穩(wěn)態(tài)的代謝過程。自噬體膜的延伸以及閉合主要依賴2個泛素系統(tǒng)，即Atg12和LC3，其中Atg12與Atg5結(jié)合后形成Atg12-Atg5復合物，此復合物是自噬泡的雙層骨架結(jié)構。目前，細胞自噬相關的研究主要集中在LC3這一系統(tǒng)中，但對于Atg12這一泛素化系統(tǒng)研究甚少。研究表明，細胞自噬發(fā)生時，LC3-Ⅱ表達水平顯著上調(diào)[16]，故現(xiàn)階段多將LC3-Ⅱ表達水平的變化作為判斷細胞自噬發(fā)生的標準。Virginia等[17]檢測到在HSC活化過程中LC3-Ⅱ的表達顯著升高，提示細胞自噬參與了HSC活化，但在此活化過程中Atg12系統(tǒng)的變化并未觀察。本研究在染砷間接活化LX-2細胞后，不僅觀察了LC3-Ⅱ的表達變化，還檢測了Atg12和Atg5表達水平的變化。我們檢測到間接染砷組LX-2細胞除了α-SMA表達水平顯著增加外，自噬相關蛋白Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ表達水平均顯著上調(diào)，提示細胞自噬Atg12和LC3 2個泛素化系統(tǒng)均參與了砷間接致HSC活化的過程。使用低、高劑量OM干預間接染砷活化的LX-2細胞24 h后，檢測到低、高劑量OM干預組細胞活力、活化標志蛋白α-SMA以及自噬相關蛋白Atg12、Atg5和LC3-Ⅱ表達水平較間接染砷組均顯著下調(diào)，且高劑量OM干預組LX-2細胞的自噬標志蛋白LC3-Ⅱ表達水平下降較低劑量OM干預組更為顯著，提示低、高劑量OM干預均可抑制間接染砷致HSC活化,且可能與干預細胞自噬的過程有關。

Wallace等[18]提出在HSC活化的過程中，肝細胞發(fā)生氧化應激損傷分泌的細胞因子、肝細胞的凋亡小體、內(nèi)皮細胞分泌的TGF-β等可促進HSC激活。為明確間接染砷活化HSC的原因，我們進一步用ELISA對染砷LO2培養(yǎng)上清中TGF-β1的含量進行檢測，但并未觀察到染砷LO2培養(yǎng)上清中TGF-β1的水平較對照組有顯著變化，提示在染砷損傷肝細胞間接致HSC活化及影響細胞自噬的機制中可能與TGF-β1并無直接關系。

近年來，有研究認為細胞自噬可降解儲存在HSC細胞內(nèi)的脂滴，從而為HSC活化提供能量[17，19]。本研究以油紅O染色觀察染砷間接致HSC活化及OM干預后細胞內(nèi)脂滴的變化。我們觀察到染砷間接活化LX-2細胞內(nèi)的脂滴數(shù)量較對照組細胞顯著減少，而經(jīng)低、高劑量OM干預24 h后LX-2細胞內(nèi)脂滴數(shù)量較間接染砷組顯著增多，提示染砷間接活化HSC細胞中的細胞自噬水平顯著增加，有可能通過降解儲存在HSC細胞中的脂滴為活化提供能量，促進HSC活化，而OM干預可能通過抑制這一過程達到減少HSC活化、減輕肝纖維化的效果。