李 鵬， 劉詠梅， 劉振華

(承德市中心醫(yī)院兒科， 河北 承德 067000)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)屬于間質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重階段，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近些年的發(fā)病率及死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞在PF發(fā)生及發(fā)展過程中有重要作用，抑制肺成纖維細(xì)胞增殖及向肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其凋亡是影響PF發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[2-3]。高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2，HMGA2)是一種非組蛋白染色體蛋白，其表達(dá)與多種人類腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。也有研究顯示，在PF過程中HMGA2可隨PF程度增加表達(dá)量增加，可能是通過調(diào)節(jié)與上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)基因而在其中發(fā)揮作用[6]；沉默HMGA2表達(dá)可抑制人胚肺成纖維細(xì)胞膠原合成[7]。以上研究提示PF過程中HMGA2可能發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是TGF-β家族中最重要的亞型，在PF等疾病狀態(tài)下表達(dá)增加，是致纖維化關(guān)鍵性的細(xì)胞因子[8]。因此，本研究通過RNA干擾技術(shù)敲減HMGA2的表達(dá)，旨在探討抑制HMGA2表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞活力、凋亡、膠原(collagen，COL)合成及氧化應(yīng)激的影響，以期為PF的治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 試劑和儀器

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone；MTT和DCFH-DA均購自Sigma；TGF-β1購自Peprotech INC；細(xì)胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基；RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa；抗HMGA2、AKT和p-AKT抗體均購自Abcam。流式細(xì)胞儀購自Becton Dikinson；酶標(biāo)儀購自BIO-RAD。

2 細(xì)胞及培養(yǎng)

人胚肺成纖維細(xì)胞(human embryonic lung fibroblast，HELF)購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃恒溫、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)80%左右生長融合時(shí)，胰酶消化后傳代。實(shí)驗(yàn)為3～4代的細(xì)胞。

3 方法

3.1分組及轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為空白(blank)組、TGF-β1組、陰性對(duì)照(negative control,NC)組和HMGA2 siRNA(si-HMGA2)組。空白組細(xì)胞不經(jīng)特殊處理。TGF-β1組用含5 μg/L TGF-β1的DMEM培養(yǎng)基刺激細(xì)胞24 h；NC組和si-HMGA2組分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA及HMGA2的特異性siRNA 48 h后使用含5 μg/L TGF-β1的DMEM培養(yǎng)基刺激細(xì)胞24 h。siRNA轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。

3.2轉(zhuǎn)染效率的檢測 預(yù)冷RIPA裂解液(加蛋白酶抑制劑PMSF)提取按照3.1分組處理后的細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣40 μg總蛋白，經(jīng)10～12%的SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST緩沖液洗膜，將膜完全浸入稀釋好的 I 抗溶液中(1 ∶500稀釋的HMGA2及1 ∶1 000稀釋的β-actin)，4 ℃搖床中孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，加稀釋好的 II 抗(HRP標(biāo)記的抗體，稀釋比例1 ∶2 000)，37 ℃孵育30 min，洗膜，加ECL發(fā)光液覆蓋膜，待熒光較為穩(wěn)定后掃描，掃描后使用Image J分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度值分析。得出目的蛋白與內(nèi)參照蛋白吸光度值比值，即為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3細(xì)胞活力的檢測 收集生長至對(duì)數(shù)期的HELF，以每孔5×103個(gè)接種于96孔板，5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃孵育，使細(xì)胞單層覆蓋孔底部，棄去舊培養(yǎng)液，按照3.1分組處理細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，處理至規(guī)定時(shí)間后，每孔加10 μL的MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔中加入150 μL的DMSO，37 ℃孵育10 min，振蕩10 min以使結(jié)晶能夠充分溶解，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處各孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4細(xì)胞凋亡率檢測 收集按照3.1分組處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌后用適量胰酶-EDTA消化液消化，收集消化的細(xì)胞至EP管，4 ℃離心，PBS洗滌，500 μL的1×binding buffer重懸細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC及PI各5 μL和10 μL，室溫避光孵育15 min，上機(jī)前再加入1×binding buffer 300 μL，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量測定 采用熒光分子探針DCFH-DA法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。收集按照3.1分組處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞，PBS漂洗后，離心，棄上清，加入終濃度為5 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃孵育40 min，將加DCFH-DA的細(xì)胞渾濁液涂在蓋玻片上，PBS洗滌多余染料，蓋玻片倒扣在載玻片上，熒光倒置顯微鏡及Image Lab軟件測定熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6RT-qPCR檢測COL-I和COL-III的mRNA表達(dá) TRIzol法提取按照3.1分組處理至規(guī)定時(shí)間的細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，按照PCR試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)分析圖像，β-actin作為內(nèi)參照，根據(jù)2-△△Ct公式計(jì)算目的基因相對(duì)于β-actin的mRNA表達(dá)量。COL-Ⅰ(449 bp)的上游引物序列為5’- GCTCGTGGAAATGATGGTGC-3’，下游引物序列為 5’-CCTCGCTTTCCTTCCTCTCC-3’；COL-Ⅲ(386 bp)的上游引物序列為 5’-ACGGAAACACTGGTGGACAG-3’，下游引物序列為5’-GTAGTCTCACAGCCTTGCGT-3’；β-actin(500 bp)的上游引物序列為5’- GTGGGGCGCCCCAGGCACC-3’，下游引物序列為5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’。每孔設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.7AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的檢測 分組同3.1。AKT和p-AKT蛋白表達(dá)的Western blot檢測方法同3.2。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染si-HMGA2的HELF中HMGA2蛋白的表達(dá)

Western blot法檢測轉(zhuǎn)染si-HMGA2的HELF中HMGA2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，TGF-β1組的HMGA2蛋白表達(dá)明顯高于空白組和si-HMGA2組(P<0.05)，TGF-β1組和NC組間HMGA2蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，提示TGF-β1能夠誘導(dǎo)HELF中HMGA2的表達(dá)，且轉(zhuǎn)染si-HMGA2能夠有效敲減TGF-β1誘導(dǎo)的HELF中HMGA2的表達(dá)，見圖1。

Figure 1.Western blot was used to detect the protein expression of HMGA2 in the HELF transfected with si-HMGA2.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsTGF- β1 group.

圖1 Western blot檢測轉(zhuǎn)染si-HMGA2的HELF中HMGA2蛋白的表達(dá)

2 敲減HMGA2基因的表達(dá)可減弱HELF活力

MTT結(jié)果顯示，TGF-β1組的細(xì)胞活力明顯高于空白組和si-HMGA2組(P<0.05)，TGF-β1組和NC組間比較細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。表明敲減HMGA2基因的表達(dá)能夠明顯減弱TGF-β1誘導(dǎo)的HELF的活力。

3 敲減HMGA2基因的表達(dá)促進(jìn)HELF凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，空白組、TGF-β1組、NC組和si-HMGA2組的細(xì)胞凋亡率分別為(13.5±1.35)%、(2.7±0.26)%、(3.0±0.29)%和(10.9±1.07)%。TGF-β1組的細(xì)胞凋亡率明顯低于空白組和si-HMGA2組(P<0.05)，TGF-β1組和NC組間比較細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖3。提示敲減HMGA2基因的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的HELF凋亡。

4 敲減HMGA2基因的表達(dá)可降低HELF中膠原的mRNA表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，TGF-β1組COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的mRNA表達(dá)均明顯高于空白組和si-HMGA2組(P<0.05)，TGF-β1組和NC組間比較COL-Ⅰ和COL-Ⅲ mRNA表達(dá)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖4。提示敲減HMGA2基因的表達(dá)能夠有效降低TGF-β1誘導(dǎo)的HELF中膠原的合成。

Figure 2.The effect ofHMGA2gene knockdown on the viability of HELF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsTGF- β1 group.

圖2 敲減HMGA2基因的表達(dá)對(duì)HELF活力的影響

Figure 3.The effect ofHMGA2gene knockdown on the apoptosis of HELF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsTGF- β1 group.

圖3 敲減HMGA2基因表達(dá)對(duì)HELF凋亡的影響

5 敲減HMGA2基因表達(dá)可降低HELF中ROS的含量

熒光分子探針DCFH-DA法結(jié)果顯示，TGF-β1組細(xì)胞的ROS含量明顯低于空白組和si-HMGA2組(P<0.05)，TGF-β1組和NC組間比較細(xì)胞ROS含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖5。提示敲減HMGA2基因的表達(dá)能夠明顯提高TGF-β1誘導(dǎo)的HELF中ROS的含量。

6 敲減HMGA2基因的表達(dá)下調(diào)HELF中p-AkT的蛋白水平

Western blot檢測各組細(xì)胞AKT和p-AKT的蛋白水平，結(jié)果顯示，TGF-β1組細(xì)胞p-AKT的蛋白水平明顯高于空白組和si-HMGA2組(P<0.05)，TGF-β1組和NC組間比較p-AKT蛋白水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見圖6。提示敲減HMGA2基因的表達(dá)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。

討 論

TGF-β有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3種形式，其中以TGF-β1最為重要，是關(guān)鍵的致纖維化因子之一，在纖維化病變中表達(dá)高于正常組織，能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的積聚，并可促進(jìn)成纖維細(xì)胞COL-I和COL-III表達(dá)，TGF-β1濃度越高對(duì)COL-I和COL-III表達(dá)促進(jìn)作用越明顯，從而影響PF進(jìn)展[9-10]。此外，也有研究顯示，TGF-β1可抑制肺成纖維細(xì)胞凋亡[11]，以上研究提示抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成及促進(jìn)細(xì)胞凋亡對(duì)PF治療具有重要意義。

Figure 4.The effect ofHMGA2gene knockdown on the mRNA expression of COL-Ⅰ and COL-Ⅲ in the HELF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖4 敲減HMGA2基因的表達(dá)對(duì)HELF中COL-Ⅰ和COL-Ⅲ mRNA表達(dá)的影響

HMGA2編碼基因位于12q15染色體，是高遷移率蛋白家族成員之一，可通過蛋白-蛋白或蛋白-DNA作用方式改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，使DNA發(fā)生劇烈變性，進(jìn)而直接發(fā)揮抑制或促進(jìn)下游基因表達(dá)的作用，也可通過結(jié)合于其它的轉(zhuǎn)錄因子而間接調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)[12-13]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，HMGA2異常表達(dá)與多種人類腫瘤密切相關(guān)[14-15]。HMGA2在PF中的研究較少。有研究顯示，miR-221可靶向HMGA2調(diào)控TGF-β1/Smad3誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而抑制博來霉素誘導(dǎo)的PF[16]。RNA干擾是一種可特異性敲減靶基因表達(dá)的新技術(shù)，目前已成為常用的生物學(xué)研究手段，在基因功能研究、疾病治療等方面有廣泛的應(yīng)用[17-18]。有研究顯示，使用RNAi技術(shù)沉默HMGA2表達(dá)可抑制人胚肺成纖維細(xì)胞膠原合成[7]。本研究結(jié)果顯示，用RNAi技術(shù)敲減HMGA2的表達(dá)可減弱TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞活力和COL-I和COL-III的mRNA表達(dá)，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其部分研究結(jié)果與前人研究一致。

Figure 5.The effect ofHMGA2gene knockdown on ROS content in the HELF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖5 抑制HMGA2基因表達(dá)對(duì)HELF中ROS含量的影響

ROS是機(jī)體有氧代謝過程中的副產(chǎn)品之一，其過量產(chǎn)生可導(dǎo)致氧化應(yīng)激，是引起腫瘤、PF和糖尿病等多種疾病的根源[19-20]。有研究顯示，EW-7197可通過阻斷TGF-β/SMAD和ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制肝、腎和肺纖維化[21]；抑制PDE5A可通過降低ROS產(chǎn)生及RhoA/Rho激酶激活減弱博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化和肺動(dòng)脈高壓[22]；低劑量鎘可通過ROS上調(diào)HMGA2 mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)周期相關(guān)蛋白 cyclin D1 表達(dá)，引起細(xì)胞周期改變而誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5 增殖[23]。本研究結(jié)果顯示，敲減HMGA2的表達(dá)可增加TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞的ROS水平。這提示提高ROS水平可能是HMGA2誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞凋亡的一種途徑。

Figure 6.The effect ofHMGA2gene knockdown on the protein levels of p-AKT in the HELF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsTGF β1 group.

圖6 敲減HMGA2基因的表達(dá)對(duì)HELF中p-AKT蛋白水平的影響

PI3K/AKT信號(hào)是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，主要由PI3K和AKT分子及下游分子組成，AKT是PI3K信號(hào)下游的信號(hào)分子，AKT參與促細(xì)胞增殖、抑細(xì)胞凋亡的調(diào)控[24]。有研究表明，TGF-β1可激活PI3K/AKT信號(hào)，激活的PI3K/AKT信號(hào)可參與細(xì)胞增殖、生長等生理過程[25]。抑制PI3K/AKT信號(hào)可明顯阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞增殖[26]。本研究結(jié)果顯示，敲減HMGA2的表達(dá)可降低TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞p-AKT的蛋白水平，提示敲減HMGA2的表達(dá)可通過抑制PI3K/AKT信號(hào)抑制人胚肺成纖維細(xì)胞生長。

綜上所述，通過RNAi沉默HMGA2表達(dá)可抑制人胚肺成纖維細(xì)胞活力和膠原合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及ROS產(chǎn)生，從而對(duì)PF起抑制作用，機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)有關(guān)。提示在PF過程中HMGA2可能是一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)。