劉雅林， 謝蘭蘭， 王麗云， 趙瑞杰， 許 峰， 王文勝

(河北省邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河北 邢臺 054000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是老年性癡呆癥中最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，臨床上常見的病理表現(xiàn)主要有記憶力下降、執(zhí)行功能障礙和行為改變等[1-2]。隨著我國老齡化的加劇，AD的發(fā)病率有明顯升高的趨勢，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量，因此，AD的改善和治療已成為我國亟待解決的社會問題。隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展，盡管在AD的發(fā)病機(jī)制和治療藥物的研究等方面有所突破，但仍然缺乏特異性的治療藥物與方法，AD的防治仍是醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題。海馬是神經(jīng)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)記憶通路關(guān)系密切相關(guān)的大腦組織，海馬神經(jīng)元的凋亡被認(rèn)為是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的重要因素[3-4],因此，如何減少海馬神經(jīng)元的凋亡以改善AD的認(rèn)知能力可能是防治AD的策略。

丁苯酞(butylphthalidle，NBP)是一種臨床上治療輕、中度急性缺血性腦卒中等疾病的常用藥，具有改善腦部供血、抗腦血栓形成、拮抗自由基損傷及抑制神經(jīng)元凋亡的作用[5-6]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是sirtuins去乙?；讣易宄蓡T，可通過使底物去乙?；瘡亩{(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡與衰老、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等過程。研究證實(shí)[7-8]，SIRT1可通過去乙?；饔眯揎桼elA/P65的殘基抑制核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的活性，從而減少神經(jīng)元凋亡，在神經(jīng)保護(hù)過程中發(fā)揮著重要作用。有研究指出[9]，丁苯酞可通過上調(diào)Bcl-2，并下調(diào)Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)抑制海馬神經(jīng)元凋亡，但其有無介導(dǎo)SIRT1/NF-κB信號通路參與這一過程并不清楚。因此，我們通過構(gòu)建AD大鼠模型，探討丁苯酞通過調(diào)控SIRT1/NF-κB信號通路對海馬神經(jīng)元凋亡的影響，以期為丁苯酞防治AD提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物 63只SPF級健康成年雄性SD大鼠(體重260～290 g)購于蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SCXK(蘇)2018-0006。飼養(yǎng)條件：溫度27 ℃，濕度45%～65%，通風(fēng)良好，自由攝食與飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器 丁苯酞購自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco；生理鹽水購自石家莊第四制藥廠；蘇木素和伊紅購自武漢博士德生物公司；水合氯醛購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司；抗Bcl-2和Bax多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；抗β肌動蛋白(β-actin)和p-NF-κB p65 單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology；抗p-NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α,IκBα)和cleaved caspase-3多克隆抗體購自Cell Signaling;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒購自上海生工有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen。石蠟組織切片機(jī)購自Leica；流式細(xì)胞儀購自BD;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Forma Scientific；光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus。

2 方法

2.1AD大鼠模型的制備與實(shí)驗(yàn)分組 按照大鼠體重10 mL/kg的標(biāo)準(zhǔn)每天以5 mg/kg氯化鋁(AlCl3)灌胃聯(lián)合腹腔注射60 mg/kg D-半乳糖的方式構(gòu)建AD大鼠模型，給藥處理3個(gè)月。將63只SD大鼠隨機(jī)分為9組，每組7只，分別為對照(control)組：同時(shí)間給予等體積的生理鹽水灌胃；模型(model)組：上午7點(diǎn)以生理鹽水灌胃，下午給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞低劑量(low dose of NBP, NBP-L)、中劑量(middle dose of NBP, NBP-M)和高劑量(high dose of NBP, NBP-H)組：上午同時(shí)間給予25、50和100 mg/kg丁苯酞灌胃，下午同時(shí)間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；SIRT1激活劑(SRT1720)組：上午同時(shí)間給予終濃度為16 μmol/L的SIRT1激活劑SRT1720灌胃，下午同時(shí)間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；SIRT1抑制劑(sirtinol)組：上午同時(shí)間給予終濃度為80 μmol/L的SIRT1抑制劑sirtinol灌胃，下午同時(shí)間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞中劑量+SIRT1抑制劑(NBP-M+sirtinol)組：上午同時(shí)間給予50 mg/kg丁苯酞和終濃度為80 μmol/L的SIRT1抑制劑sirtinol灌胃，下午同時(shí)間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞中劑量+ddH2O(NBP-M+ddH2O)組：上午同時(shí)間給予50 mg/kg丁苯酞和等量蒸餾水灌胃，下午同時(shí)間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射。

2.2HE染色 給藥處理結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，斷頭取腦組織。參照Paxinos第3版大鼠腦解剖圖定位海馬區(qū)，取海馬區(qū)組織，以冷凍切片機(jī)制備片厚20 μm的組織冠狀切片。將制備的海馬區(qū)組織切片浸泡于二甲苯中10 min后，更換二甲苯再浸泡10 min，再依次分別置于濃度為100%、 95%、90%、80%和70%的乙醇中浸泡10 min。經(jīng)蒸餾水洗滌后，以蘇木素染色1 min，1%鹽酸分化10 s和伊紅染色2 min;再依次經(jīng)70%、80%、90%和95%梯度的乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片。采用光學(xué)顯微鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)及密度。

2.3流式細(xì)胞儀檢測 取海馬組織，以0.25%胰蛋白酶消化，并以DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)終止消化，以12 000×g離心10 min收集細(xì)胞后，采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞。以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再參照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書按步驟分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙啶，避光條件下充分混勻后，上流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Western blot檢測 取海馬組織，研磨成漿后，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并參照BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白進(jìn)行定量。調(diào)整上樣蛋白濃度為50 μg，加入等量的2×上樣緩沖液，經(jīng)沸水浴變性5 min后，行SDS-PAGE。電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上后，浸泡于含5%脫脂奶粉的封閉液中常溫孵育1 h。再分別與封閉液稀釋的特異性Ⅰ抗(1∶1 000)室溫孵育3 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。經(jīng)封閉液洗膜后，以化學(xué)發(fā)光劑顯色曝光，分別以SigmaScan Pro 5軟件采集圖像，以β-actin為內(nèi)參照，GraphPad Prism 5軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丁苯酞改善AD大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)

對照組大鼠海馬神經(jīng)元排列緊密整齊，層次清楚，神經(jīng)元核呈圓形，形態(tài)正常；模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂，可見疏松區(qū)，神經(jīng)元核固縮，小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生；與模型組相比，丁苯酞低、中和高劑量組海馬組織病理變化有明顯改善，神經(jīng)元排列較有序，部分神經(jīng)元核呈圓形，數(shù)目明顯增多，見圖1。

Figure 1.The morphology of hippocampal neurons of rats in each group was observed by HE staining. The scale bar=50 μm.

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元HE染色結(jié)果

2 丁苯酞抑制AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡

與對照組相比，模型組海馬神經(jīng)元的凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中和高劑量組海馬神經(jīng)元的凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；且丁苯酞中、高劑量組的作用顯著大于低劑量組(P<0.05)，而丁苯酞中、高劑量組間的作用無顯著差異(P>0.05),見圖2。

3 丁苯酞對SIRT1/NF-κB信號通路的影響

Western blot進(jìn)一步檢測海馬組織中SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白SIRT1、p-NF-κB p65和p-IκBα的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組中SIRT1蛋白表達(dá)顯著降低，而p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；丁苯酞低、中和高劑量組中SIRT1蛋白表達(dá)較模型組顯著升高，而p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達(dá)顯著低于模型組(P<0.05)，見圖3。

4 激活SIRT1/NF-κB信號通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡

與模型組相比，給予SIRT1激動劑SRT1720處理后，SIRT1表達(dá)顯著升高，而p-NF-κB p65和p-IκBα的表達(dá)顯著降低(P<0.05);SRT1720組細(xì)胞凋亡率較模型組顯著降低(P<0.05)；SRT1720組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組，而Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.Effect of butylphthalide (NBP) on apoptosis of hippocampal neurons in AD rats. A：the apoptosis rate of each group was detected by flow cytometry; B：the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-L group.

圖2 丁苯酞對AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

Figure 3.Effect of butylphthalide (NBP) on the expression of SIRT1/NF-κB signaling pathway related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-L group.

圖3 丁苯酞對SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

5 抑制SIRT1/NF-κB信號通路促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡

與模型組相比，給予SIRT1抑制劑sirtinol處理的大鼠海馬組織中SIRT1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，而p-NF-κB p65、p-IκBα、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖5。

6 丁苯酞通過調(diào)控SIRT1/NF-κB信號通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡

與模型組相比，給予50 mg/kg丁苯酞處理后，細(xì)胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；而給予SIRT1抑制劑sirtinol處理后，丁苯酞對海馬神經(jīng)元凋亡和Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的抑制作用及對Bcl-2蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用均顯著減弱(P<0.05)，見圖6。

討 論

丁苯酞具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，其可通過激活Nrf2-ARE途徑增加抗氧化酶活性并減輕神經(jīng)功能缺損、腦含水量和皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡引起的腦損傷[10]；通過激活A(yù)kt/mTOR信號抑制神經(jīng)元凋亡和自噬，改善反復(fù)腦缺血再灌注損傷小鼠的認(rèn)知損傷[11]，還可通過p38 MAPK通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡進(jìn)而改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[12]。SIRT1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；福瑥V泛表達(dá)于成熟組織中，可通過去乙?；饔谜{(diào)控基因表達(dá)，在抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等生理病理過程中發(fā)揮著重要作用[13-15]。在AD病變過程中，SIRT1可通過抑制NF-κB信號通路或增強(qiáng)α-分泌酶的活性減少β-淀粉樣蛋白的病理沉積；其激活可改善腦室注射鏈脲酶素導(dǎo)致的海馬區(qū)認(rèn)知障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，被認(rèn)為是預(yù)防和改善AD的重要靶基因[16]。研究證實(shí)[7,9,17]，丁苯酞可通過上調(diào)Bcl-2，并下調(diào)Bax和caspase-3的表達(dá)抑制AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡；SIRT1可通過抑制NF-κB活性減少神經(jīng)元凋亡，丁苯酞可通過上調(diào)SIRT1表達(dá)抑制海馬神經(jīng)元凋亡，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷；但丁苯酞是否通過激活SIRT1/NF-κB途徑發(fā)揮抑制海馬神經(jīng)元凋亡進(jìn)而改善AD神經(jīng)損傷尚需充分認(rèn)識。

Figure 4.Effect of activation of SIRT1/NF-κB signaling pathway on apoptosis of hippocampal neurons. A: the protein expression of SIRT1, p-NF-κB p65 and p-IκBα was detected by Westem blot; B: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; C: the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 激活SIRT1/NF-κB信號通路對海馬神經(jīng)元凋亡的影響

Figure 5.Effects of inhibiting SIRT1/NF-κB signaling pathway on apoptosis of hippocampal neurons. A: the protein expression of SIRT1, p-NF-κB p65 and p-IκBα was detected by Westem blot; B: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; C:the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖5 抑制SIRT1/NF-κB信號通路對海馬神經(jīng)元凋亡的影響

Figure 6.Effects of butylphthalide (NBP) on apoptosis of hippocampal neurons regulated by SIRT1/NF-κB signaling pathway. A: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; B: the protein expression of Bcl-2,Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-M+ddH2O group.

圖6 丁苯酞調(diào)控SIRT1/NF-κB信號通路對海馬神經(jīng)元凋亡的影響

腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合AlCl3灌胃是構(gòu)建AD大鼠模型常用方法[18-20]。我們采用上述方法造模并給予丁苯酞作用后，HE染色檢測模型組神經(jīng)元較對照組出現(xiàn)了嚴(yán)重缺失和核固縮等病理改變；而給予丁苯酞處理的大鼠海馬組織中神經(jīng)元的病理變化較模型組有顯著改善；流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測到丁苯酞可抑制AD大鼠模型中海馬神經(jīng)元凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)，而上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相吻合[9]。Western blot進(jìn)一步檢測丁苯酞可上調(diào)AD大鼠模型中SIRT1蛋白表達(dá)，下調(diào)p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達(dá)，提示SIRT1/NF-κB信號通路在丁苯酞改善AD神經(jīng)損傷過程中發(fā)揮著重要作用。以SIRT1激活劑SRT1720上調(diào)SIRT1表達(dá)并抑制NF-κB活性后，觀察到海馬神經(jīng)元的凋亡率顯著降低，同時(shí)Bax和cleaved caspase-3表達(dá)受到抑制，而Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)；而以SIRT1抑制劑sirtinol作用后得到與之相反的結(jié)果，這一結(jié)果與研究報(bào)道的上調(diào)SIRT1表達(dá)可通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)及caspase-3活性抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制相一致[21]。同時(shí)觀察到sirtinol可顯著減弱丁苯酞對海馬神經(jīng)元凋亡和Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的抑制作用,及對Bcl-2蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，這一結(jié)果提示，丁苯酞可通過SIRT1/NF-κB途徑上調(diào)Bcl-2，并下調(diào)Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)抑制海馬神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，SIRT1/NF-κB信號通路在AD海馬神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，激活SIRT1/NF-κB信號通路,下調(diào)Bax和cleaved caspase-3,并上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)可能是丁苯酞抑制海馬神經(jīng)元凋亡的機(jī)制之一。