羅 維， 艾 磊， 李 顯， 王博發(fā)， 周 越△

(1北京體育大學運動生理學教研室， 北京 100084； 2南京體育學院運動健康科學系， 江蘇 南京 210014；3江蘇省體育科學研究所， 江蘇 南京 210033)

國際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，2017年全球糖尿病患者人數(shù)達4.25億，預計2045年將達6.29億，每6秒就有1位患者因糖尿病死亡，其中大部分患者為2型糖尿病[1-2]。胰島素抵抗是2型糖尿病的最主要病理特征，其不僅貫穿于2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的全過程，還是心腦血管疾病、乳腺癌和阿爾茲海默癥等疾病的共同病理基礎[3-6]。胰島素抵抗是指單位濃度的胰島素細胞效應減弱，其實質為胰島素激活的葡萄糖轉運及靶細胞的糖代謝降低，在分子水平是胰島素信號轉導受損的結果[7]。

目前，防治胰島素抵抗的基礎研究仍以動物模型為主，但其缺點是實驗周期長，需要投入較大人力和物力[8]，而從細胞和分子水平進行深入研究有助于更好地探索胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的分子機制，是進行胰島素抵抗和相關疾病病理機制探索及藥物研發(fā)的重要途徑[9-10]。構建穩(wěn)定的胰島素抵抗離體細胞模型有利于直觀快捷地探討胰島素抵抗的發(fā)病機理并進行相關藥物篩選[11]。

骨骼肌是胰島素作用的靶器官，胰島素刺激下人體80%以上的葡萄糖攝取在骨骼肌中完成[12-13]，因此骨骼肌為胰島素抵抗發(fā)生的主要部位。C2C12細胞是由C3H小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞永生化而來的細胞株，因其形態(tài)特性均一，且可無限代培養(yǎng)，是體外研究骨骼肌胰島素抵抗發(fā)病機制和降糖藥物作用機制的理想細胞模型[14]。鑒于目前關于建立C2C12細胞胰島素抵抗模型的研究報道實驗條件不一，方法各異，且胰島素抵抗效果不穩(wěn)定[15]，本課題組在離體胰島素抵抗模型建立中進行了較長時間的研究，通過采用不同濃度葡萄糖干預C2C12細胞不同時長，實時收集細胞檢測其基礎和胰島素刺激下的熒光標記葡萄糖2-NBDG攝取水平及胰島素信號通路相關蛋白的表達水平，探索高糖刺激與C2C12細胞胰島素抵抗之間的量效關系，期望構建穩(wěn)定可重復的離體骨骼肌細胞胰島素抵抗模型，促進胰島素抵抗和相關疾病的病理機制探索及相關藥物研發(fā)與篩選，進而推進胰島素抵抗等慢性疾病的防治研究。

材 料 和 方 法

1 實驗對象及分組

小鼠骨骼肌成肌細胞C2C12購自北京協(xié)和細胞庫。C2C12細胞傳代到足夠細胞量后統(tǒng)一凍存，選取同一代細胞作為實驗對象。于1 mL無糖分化液中分別溶入7.2 mg和10.8 mg D-葡萄糖(Aladdin，G116307)配制葡萄糖濃度為40 mmol/L和60 mmol/L的分化液，正常分化液中葡萄糖濃度為25 mmol/L。

待C2C12細胞密度達到70%～90%時隨機分為對照(control)組、40 mmol/L葡萄糖(40)組和60 mmol/L葡萄糖(60)組，誘導分化，其中，對照組分化液中葡萄糖濃度為25 mmol/L，40組分化液中葡萄糖濃度為40 mmol/L，60組分化液中葡萄糖濃度為60 mmol/L，每組設置48個復孔，分別在誘導分化1、3、5和7 d后收集細胞進行相關檢測，收集細胞時每組12個復孔，再于組內隨機分為胰島素組和PBS組，分別加入200 nmol/L胰島素和等量PBS，繼續(xù)孵育30 min后收集細胞，檢測不同濃度葡萄糖干預不同時長對骨骼肌細胞胰島素敏感性的影響。

2 主要試劑

無糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，Gibco)；馬血清(horse serum，HS， HyClone)；葡萄糖轉運探針2-NBDG(江蘇凱基生物技術有限公司)；細胞培養(yǎng)用胰島素(上海碧云天生物技術有限公司)；抗葡萄糖轉運子4(glucose transporter 4， GLUT4)抗體(Abcam)；抗β-actin抗體(北京中山金橋生物技術有限公司)。

3 主要方法

3.1小鼠骨骼肌C2C12細胞的生長與分化培養(yǎng) C2C12細胞采用細胞生長液(25 mmol/L 葡萄糖、DMEM培養(yǎng)基、10% FBS、青霉素和鏈霉素各100 mg/L)，于5% CO2、37 ℃細胞孵育箱中孵育，依細胞生長狀態(tài)1～2 d傳代1次。實驗用細胞以每皿1.0×106個的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿或以每孔4×105個的密度接種于24孔培養(yǎng)板，待細胞生長至70%～90%融合度時，按方法1中分組方式隨機分為3組，將生長液更換為分化液(DMEM培養(yǎng)基、2% HS、青霉素和鏈霉素各100 mg/L)，誘導分化，隔24 h更換分化液。每天在相差顯微鏡下觀察多核肌管形成并采集圖像。

3.22-NBDG法檢測不同干預對C2C12細胞基礎糖攝取和胰島素刺激糖攝取的影響 2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)是天然D-葡萄糖衍生物，通過葡萄糖轉運體進入細胞，2-DG第2位氧原子被熒光基團NBD取代形成2-DG的熒光類似物, 即2-NBDG。2-NBDG激發(fā)波長為460 nm, 發(fā)射波長為540 nm, 能夠被熒光酶標儀探測。C2C12細胞接種于24孔培養(yǎng)板，按方法3.1中實驗條件處理后，分別用不同濃度葡萄糖干預1、3、5和7 d 后收集細胞進行檢測。收集細胞后常溫PBS洗1次，每孔加入1 mL含2%牛血清白蛋白的無糖DMEM培養(yǎng)基，孵育3 h后再組內隨機分為胰島素組和PBS組，分別用胰島素或PBS干預30 min，避光條件下每孔加入3 μL 2-NBDG，孵育30 min，預冷PBS洗2遍，以熒光酶標儀讀數(shù)并統(tǒng)計相對熒光值。制作2-NBDG濃度和熒光值標準曲線，計算細胞攝取2-NBDG的濃度。

3.3Western blot檢測不同干預對GLUT4蛋白表達量的影響 不同濃度葡萄糖處理5 d和7 d后收集細胞，刮下細胞轉移至2 mL EP管，4°C離心留沉淀，每管加入裂解液150 μL，混勻，置冰上裂解25 min；取10 μL裂解的蛋白液加入蛋白定性液，分光光度計檢測蛋白濃度；剩余蛋白液加入等體積2×loading buffer，100 °C加熱10 min，4 °C 離心取上清。Wes-tern blot 蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)100 V電壓電泳和60 V電壓電轉后取出NC膜，麗春紅預染剪下對應條帶,封閉2 h后分別加入對應 I 抗，抗GLUT4 抗體的濃度為1 ∶2 000，抗β-actin抗體的濃度為1∶5 000。孵育過夜，加入 II抗，孵育2 h。X射線曝光膠片顯影。顯影后的膠片掃描導入Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行灰度分析。

3.4免疫熒光組化檢測不同干預對GLUT4蛋白分布的影響 細胞誘導分化5天后，用1 mL 4%多聚甲醛固定細胞30 min，5%羊血清封閉1 h；5%羊血清配制GLUT4抗體，濃度為1 ∶100，孵育過夜，5%羊血清配制山羊抗兔紅色II抗，濃度為1 ∶200，孵育2 h；配制DAPI工作液加入細胞培養(yǎng)皿500 mL，避光儲存于4 °C。激光共聚焦顯微鏡采集圖像，觀察細胞膜上GLUT4的分布情況。

4 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用Levene檢驗進行方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學顯著性。Origin 7.5軟件繪制圖表。

結 果

1 不同濃度葡萄糖干預不同時長對C2C12細胞形態(tài)的影響

在倒置相差顯微鏡下觀察以不同濃度葡萄糖干預的C2C12細胞形態(tài)的變化，對照組誘導分化第3天出現(xiàn)匯聚融合現(xiàn)象并有細小肌管形成，第5 天肌管數(shù)量明顯增加、體積明顯變大，第7 天形成大量粗大的肌管(圖1中紅色箭頭標示處)；40組誘導分化第5 天開始出現(xiàn)細小肌管，第7 天肌管數(shù)量增多；而60組直到第7 天才開始出現(xiàn)細小肌管，同時未見明顯增殖。以上形態(tài)學結果提示，高糖干預明顯抑制C2C12細胞的生長分化，且存在劑量和時間依賴性，60 mmol/L葡萄糖干預5 天肌管明顯減少，干預7 天抑制作用進一步加強，見圖1。

2 不同濃度葡萄糖干預不同時長對C2C12細胞糖攝取能力的影響

不同濃度葡萄糖干預第1 天，3組細胞2-NBDG基礎攝取量無顯著差異(P>0.05)，且以200 nmol/L胰島素刺激后，3組細胞2-NBDG攝取量均明顯增加(P<0.01)；干預3 d后，3組細胞2-NBDG基礎攝取量仍無顯著差異(P>0.05)，但以胰島素刺激后，對照組2-NBDG攝取量明顯增加(P<0.01)，40組2-NBDG攝取量也明顯增加(P<0.05)，而60組2-NBDG攝取量未見明顯增加(P>0.05)；干預5 d后，3組細胞胰島素刺激的2-NBDG攝取量變化趨勢與第3天基本一致，同時60組細胞2-NBDG基礎攝取量顯著低于對照組(P<0.01)；干預7 d后，3組細胞的2-NBDG基礎攝取量和胰島素刺激的2-NBDG攝取量與第5 天趨勢基本一致，見圖2。以上葡萄糖攝取結果提示，高糖干預明顯降低C2C12細胞基礎和胰島素刺激的糖攝取能力，且存在劑量和時間依賴性，以60 mmol/L葡萄糖干預5 d出現(xiàn)明顯抑制，干預7 d抑制效果進一步加強。

Figure 1.The morphological changes of the C2C12 cells treated with glucose at different concentrations were observed under phase contrast microscope. The scale bar=100 μm.

圖1 不同濃度葡萄糖干預不同時長對C2C12細胞形態(tài)的影響

3 不同濃度葡萄糖干預不同時長對C2C12細胞 GLUT4蛋白表達的影響

檢測不同濃度葡萄糖干預5 d和7 d后細胞基礎GLUT4蛋白表達和200 nmol/L胰島素刺激的GLUT4蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，干預5 d和7 d后對照組胰島素刺激的GLUT4水平均顯著高于基礎GLUT4水平(P<0.05)，而5 d后，60組胰島素刺激的GLUT4水平與基礎GLUT4水平的差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，7 d后甚至低于基礎GLUT4水平。40組在第5天后與60組變化趨勢一致，但第7天后，與對照組相比基礎GLUT4水平顯著降低，胰島素刺激后顯著增加(P<0.01)，見圖3。以上結果提示，高糖干預明顯降低C2C12細胞的基礎和胰島素刺激的GLUT4蛋白表達，且存在劑量和時間依賴性，60 mmol/L葡萄糖干預5 d明顯抑制GLUT4的蛋白表達，干預7 d抑制效果進一步加強。

4 不同濃度葡萄糖干預5 d對C2C12細胞膜上 GLUT4蛋白分布的影響

3組細胞進行細胞膜GLUT4免疫熒光染色，隨機選取3個14 mm×14 mm視野采集圖像，并計算相對熒光水平。40組細胞膜上GLUT4熒光水平低于對照組，但差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)。60組細胞膜的GLUT4熒光水平顯著低于對照組(P<0.01)，見圖4。以上結果提示高糖干預5 d明顯降低C2C12細胞膜 GLUT4表達量，且存在劑量依賴性，以60 mmol/L葡萄糖干預抑制效果最明顯，說明60 mmol/L葡萄糖干預不僅導致細胞中GLUT4蛋白表達降低，同時抑制GLUT4蛋白向細胞膜的轉運，抑制C2C12細胞葡萄糖的攝取。

Figure 2.The changes of glucose uptake in the C2C12 cells treated with glucose at different concentrations. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group;##P<0.01vscontrol group.

圖2 不同濃度葡萄糖干預不同時長對C2C12細胞葡萄糖攝取能力的影響

Figure 3.The changes of GLUT4 protein expression in the C2C12 cells treated with glucose at different concentrations for 5 d (A) and 7 d (B) respectively. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsPBS group.

圖3 不同濃度葡萄糖干預不同時長對C2C12細胞GLUT4蛋白表達的影響

Figure 4.The changes of GLUT4 fluorescence intensity in C2C12 cell membrane treated with glucose at different concentrations for 5 d. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖4 不同濃度葡萄糖干預5 d對C2C12細胞膜GLUT4蛋白分布的影響

討 論

建立離體胰島素抵抗模型既有利于在細胞和分子水平深入探討胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展機制，又有利于在體外進行胰島素抵抗防治藥物的研發(fā)和篩選，骨骼肌是胰島素抵抗發(fā)生的主要部位，因此建立穩(wěn)定可重復的骨骼肌細胞胰島素抵抗模型至關重要[16]。雖目前國內外關于C2C12細胞胰島素抵抗模型的建立已多有研究，主要通過棕櫚酸、游離脂肪酸和碳酸鑭等進行誘導，但采用的誘導方法、誘導藥物的作用濃度及作用時間均有所差異, 尚無法確定一個統(tǒng)一的標準，且胰島素抵抗效果也不穩(wěn)定[17]。

本研究嘗試以高糖誘導建立胰島素抵抗模型，一方面與棕櫚酸和游離脂肪酸等的間接作用相比，長期高糖是導致胰島素抵抗和2型糖尿病的直接原因，也是體內胰島素抵抗和2型糖尿病的主要特征，以高糖干預建立胰島素抵抗離體模型對于胰島素抵抗的在體研究具有更好的參考意義[18-19]；另一方面本研究通過以不同濃度葡萄糖刺激C2C12細胞并分別在干預1、3、5和7 d后實時收集細胞進行相關檢測，建立高糖刺激與C2C12細胞胰島素抵抗之間的量效關系，以確保該建模方式的穩(wěn)定性、可信性和可重復性。

胰島素抵抗實質為胰島素激活的靶細胞糖代謝降低及葡萄糖轉運能力下降，在分子水平是胰島素信號轉導受損的結果[7]。因此，本研究不僅通過測定細胞的葡萄糖攝取量來判斷胰島素抵抗，而且對細胞胰島素信號通路中關鍵因子GLUT4表達水平和分布進行分析，同時實時觀察細胞形態(tài)的變化，以期更加全面的分析和驗證胰島素抵抗模型是否成功建立。

作為新生肌肉的細胞來源，衛(wèi)星細胞的增殖和分化在骨骼肌質量維持和重塑中發(fā)揮關鍵作用，這對于提高機體胰島素敏感性尤為重要，反之則進一步加快胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)展進程[20-21]。本研究中，從形態(tài)學上觀察到60 mmol/L葡萄糖干預3 d后明顯抑制成肌細胞的生長分化，且存在劑量和時間依賴性，隨著干預時間延長，對成肌細胞生長分化的抑制更加明顯，這將導致細胞葡萄糖攝取能力減弱，加快胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)展進程。

為進一步驗證不同濃度葡萄糖干預不同時長對成肌細胞糖攝取能力的影響，本研究通過2-NBDG法檢測不同干預對成肌細胞基礎糖攝取和胰島素刺激糖攝取的影響。2-NBDG通過葡萄糖轉運蛋白進入細胞，檢測細胞中熒光強度能較好地反映一定時長內細胞的糖攝取能力，是目前研究離體胰島素敏感性的常用手段[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖干預可明顯降低C2C12細胞基礎和胰島素刺激的糖攝取能力，且存在劑量和時間依賴性，以60 mmol/L葡萄糖干預5 d出現(xiàn)明顯抑制，干預7 d抑制效果進一步加強，說明60 mmol/L葡萄糖干預5 d后導致細胞葡萄糖攝取能力和胰島素敏感性顯著下降，產(chǎn)生胰島素抵抗。

作為胰島素信號通路的最終效應蛋白，GLUT4對于維持機體葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有關鍵作用，是研究胰島素抵抗的重要靶點，胰島素抵抗發(fā)生時GLUT4的激活明顯減少[23]。由于在本研究的形態(tài)學和糖攝取能力檢測中，60 mmol/L葡萄糖干預成肌細胞5 d后產(chǎn)生明顯胰島素抵抗現(xiàn)象，因此我們檢測了不同濃度葡萄糖干預第5 天和第7 天的基礎和胰島素刺激的GLUT4蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)60 mmol/L葡萄糖干預成肌細胞5和7 d后，胰島素刺激均無法使細胞的GLUT4激活增加，即出現(xiàn)胰島素信號轉導通路受損，尤其是7 d后，基礎GLUT4水平也顯著低于正常細胞，說明60 mmol/L葡萄糖干預成肌細胞5 d后導致胰島素信號轉導通路受損，到第7 天后，受損程度進一步加深。

GLUT4屬于跨膜蛋白，只有在細胞外膜上才能轉運葡萄糖進入細胞[24]，因此本研究進一步檢測了不同濃度葡萄糖干預5 d后細胞膜上GLUT4蛋白的分布，結果發(fā)現(xiàn)60 mmol/L葡萄糖干預成肌細胞5 d后不僅導致GLUT4蛋白表達下降，同時抑制GLUT4從胞漿轉運到細胞外膜，導致細胞膜上GLUT4的分布減少和對胰島素敏感性降低。以上研究中，40 mmol/L葡萄糖也一定程度抑制成肌細胞增殖分化，導致成肌細胞葡萄糖攝取能力和GLUT4激活水平下降，但效果不如60 mmol/L葡萄糖明顯和穩(wěn)定。

綜上所述，本研究通過高糖刺激能成功構建較為穩(wěn)定的小鼠骨骼肌細胞離體胰島素抵抗模型，以60 mmol/L葡萄糖干預5 d產(chǎn)生胰島素抵抗，通過形態(tài)學觀察并檢測基礎和胰島素刺激的葡萄糖攝取能力以及GLUT4蛋白表達與分布能較好地評價骨骼肌細胞離體胰島素抵抗水平。