蘭彥芳　余剛　丁鵬　羅厚強(qiáng)

摘要：抗生素的不科學(xué)應(yīng)用致使腸球菌（Enterococcus）耐藥性越發(fā)嚴(yán)重，感染率日益升高。為減少武漢市馬源腸球菌耐藥現(xiàn)象的發(fā)生、降低其感染率，通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行分析，得出如下結(jié)論：①馬源腸球菌研究資料相當(dāng)匱乏;②馬源腸球菌耐藥性及致病性日益嚴(yán)重。針對(duì)以上結(jié)果提出以下對(duì)策：①對(duì)武漢市各地馬匹進(jìn)行腸球菌遺傳特性分析，比較不同環(huán)境對(duì)腸球菌進(jìn)化的影響，為馬源腸球菌的耐藥及致病機(jī)理研究提供參考;②對(duì)馬源腸球菌主要抗生素即氨基糖苷類和萬(wàn)古霉素耐藥的生物特性及遺傳背景進(jìn)行探索，為控制該病原菌耐藥基因的傳播提供理論依據(jù);③篩選馬源腸球菌主要毒力基因，并通過(guò)敲除方式探討其致病機(jī)理，為馬獸醫(yī)臨床提供參考。結(jié)合耐藥及毒力特征，制訂適合馬匹的用藥指南，降低馬獸醫(yī)臨床治療難度，為軍人運(yùn)動(dòng)會(huì)及馬術(shù)賽事的發(fā)展提供基礎(chǔ)和保障。

關(guān)鍵詞：馬源腸球菌（Enterococcus）;耐藥性;致病性;用藥指南;軍人運(yùn)動(dòng)會(huì)

中圖分類號(hào)：R378.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：1007-273X（2019）08-0005-04

腸球菌（Enterococcus）分布廣泛，正常存在于自然界中，屬于條件性致病菌[1，2]。腸球菌耐藥性復(fù)雜，抗生素的不科學(xué)應(yīng)用更加加重菌株的耐藥性，從而致使腸球菌引起敗血癥、皮膚軟組織感染及心內(nèi)膜炎、陰道感染等多種疾病，尤其當(dāng)家畜免疫力低下時(shí)更易發(fā)生。目前，家畜感染率逐漸升高，使得養(yǎng)殖業(yè)等損失慘重[3]。關(guān)于馬源腸球菌引起的疾病報(bào)道雖少，但部分地區(qū)馬產(chǎn)業(yè)亦受到了影響。因此，本文從武漢市馬源腸球菌遺傳特性、耐藥性和致病性三個(gè)方面進(jìn)行分析，挖掘馬源腸球菌耐藥及致病機(jī)理，從耐藥性和致病性兩者相關(guān)性出發(fā)對(duì)競(jìng)賽馬匹制訂合理的用藥指南，旨在為武漢市乃至我國(guó)馬匹疾病的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 ?研究背景

1.1 ?我國(guó)馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀

我國(guó)現(xiàn)代馬產(chǎn)業(yè)機(jī)構(gòu)主要由兩部分構(gòu)成：畜牧業(yè)發(fā)展的牧場(chǎng)和休閑俱樂部娛樂活動(dòng)。隨著時(shí)代不斷進(jìn)步，富貴階層人數(shù)逐漸增加，奧運(yùn)會(huì)等綜合賽事大量舉行（如第七屆世界軍人運(yùn)動(dòng)會(huì)馬術(shù)運(yùn)動(dòng)），馬術(shù)（賽馬）運(yùn)動(dòng)在中國(guó)開始逐漸流行，直接或間接參與馬術(shù)（賽馬）的馬匹及人群亦日漸增多，因此馬產(chǎn)業(yè)逐漸發(fā)展為我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展轉(zhuǎn)型的新的增長(zhǎng)點(diǎn)。

1.2 ?賽事馬匹的重要性

2019年世界軍人運(yùn)動(dòng)會(huì)將在武漢舉行，其中馬術(shù)比賽將在武漢商學(xué)院（以下簡(jiǎn)稱武商院）進(jìn)行，為此武商院已從歐洲購(gòu)買29匹軍運(yùn)會(huì)比賽用馬，這些馬匹不僅價(jià)值昂貴，更是因?yàn)榻?jīng)過(guò)調(diào)教和訓(xùn)練成為了專業(yè)“運(yùn)動(dòng)員”，而馬匹疾病的防治也成為世界軍人運(yùn)動(dòng)會(huì)馬術(shù)比賽順利完成的基礎(chǔ)保障之一。對(duì)此我們要更加重視，應(yīng)制訂科學(xué)、有效的預(yù)防和控制策略，以維護(hù)馬匹健康，助力軍運(yùn)會(huì)乃至今后馬產(chǎn)業(yè)更好地發(fā)展。

1.3 ?地理環(huán)境差異性

武漢市屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候區(qū)，具有雨量充沛，夏高溫，冬季稍涼濕潤(rùn)等特點(diǎn)，與歐洲氣候有差異，進(jìn)口馬匹易發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)及免疫力低下等不良現(xiàn)象，這些均為軍運(yùn)會(huì)競(jìng)賽馬匹感染致病性腸球菌創(chuàng)造了有利條件。此外，馬源腸球菌耐藥性復(fù)雜，最后一道防線-萬(wàn)古霉素已被突破[4]，因此可能嚴(yán)重威脅軍運(yùn)會(huì)馬匹健康，甚至給馬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。

2 ?研究現(xiàn)狀

2.1 ?腸球菌生物學(xué)特征

不同環(huán)境、不同地區(qū)來(lái)源的菌株其基因組均存在差異性，其在進(jìn)化關(guān)系中具有不同的特征[5]。因此，對(duì)腸球菌的遺傳背景進(jìn)行研究，尋找不同環(huán)境來(lái)源的菌株在進(jìn)化上的地位，可為馬源腸球菌的耐藥、致病機(jī)理及以后病原菌感染和致病機(jī)制研究工作提供參考。

Willems等[6]通過(guò)使用eBURST算法對(duì)腸球菌基因組MLST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)感染組分離出來(lái)的菌株屬于同一簇，稱為CC17，然而，這些傳染性分離株之間并沒有嚴(yán)格的親緣關(guān)系，而且已經(jīng)相當(dāng)多樣化[7]。在已測(cè)序菌株中，溶原噬菌體的多樣性是影響糞腸球菌種屬多樣性的重要原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)分離株獲得一個(gè)與esp基因相關(guān)的致病島（Pathogenicity island，PAI），并為該P(yáng)AI在進(jìn)化過(guò)程中可能發(fā)生糞腸球菌水平基因的轉(zhuǎn)移提供了證據(jù)。雖然目前糞腸球菌的毒力潛力低于其他球菌，如致病性鏈球菌和金黃色葡萄球菌，但它對(duì)抗生素的耐藥性使其成為最難治療的醫(yī)院病原體之一。糞腸球菌基因組的靈活性使其能夠有效地整合其他基因到糞腸球菌基因庫(kù)中，從而快速適應(yīng)新的環(huán)境，為馬的臨床治療增加了難度[6]。

2.2 ?腸球菌的耐藥特征

腸球菌曾一直作為一種可順利應(yīng)用抗生素治療的病原體，但最近幾十年多株多重耐藥菌株被發(fā)現(xiàn)（主要為糞腸球菌和屎腸球菌）。腸球菌細(xì)胞壁較厚，耐藥性非常復(fù)雜，包括天然耐藥性、獲得性耐藥性及耐受性耐藥性。其固有耐藥性與染色體有關(guān)，包括β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素等;而獲得性耐藥與轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒有關(guān)，包括紅霉素、高水平氨基糖苷類等[4]。臨床中常根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁的特征并結(jié)合氨基糖苷類藥物對(duì)腸球菌感染進(jìn)行聯(lián)合治療，但有報(bào)道腸球菌對(duì)高濃度氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生的耐藥性增加，且慶大霉素高水平耐藥（High-level gentamicin resistance，HLGR）占了較大比例[8]，因此失去了與細(xì)胞壁活性抗菌藥物的聯(lián)合作用。同時(shí)，作為最后一道防線的萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌（VRE）分離率在國(guó)內(nèi)亦迅速上升，加大了治療難度。

2.3 ?腸球菌的致病性研究

腸球菌PAI是細(xì)菌染色體上具有特殊結(jié)構(gòu)的基因簇，與細(xì)菌毒力及代謝產(chǎn)物等的編碼有關(guān)。PAIs的存在更有利于細(xì)菌的進(jìn)化，為細(xì)菌對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性創(chuàng)造了有利條件[9]。PAIs屬于外來(lái)性物質(zhì)，大多通過(guò)非固定性元件侵入菌體細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)各種機(jī)理進(jìn)入細(xì)菌染色體的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，此時(shí)宿主菌便出現(xiàn)新的致病性特征。這些特征可增加菌體黏附力，有利于其在腸道內(nèi)易位，耐受能力增強(qiáng)。2002年有學(xué)者報(bào)道PAI存在于糞腸球菌中[10]，2004年P(guān)AI新結(jié)構(gòu)又被Leavis等[11]懷疑存在于屎腸球菌中。PAI主要致病基因如下，細(xì)胞溶血素（Cyl）：腸球菌Cyl可溶解紅細(xì)胞，對(duì)血小板及多種細(xì)胞存在毒性作用[12];明膠酶E（gelatinase，gelE）：有研究實(shí)明gelE及其調(diào)節(jié)因子fsr參與毒力作用，與腸球菌的炎性作用密切相關(guān)[13];表面蛋白（Enterococcal surface protein，Esp）：腸球菌Esp可通過(guò)結(jié)合子途徑在種屬間轉(zhuǎn)移，幫助菌株形成生物膜，從而對(duì)氨基糖苷類藥物產(chǎn)生耐藥，Esp基因一直是目前國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn);心內(nèi)膜炎抗原（Endocarditis antigen，EfaA）：不同的種屬EfaA基因序列均有明顯差異。目前EfaA基因的致病性在糞腸球菌中已被報(bào)道，但在其他腸球菌中并未研究出結(jié)果;聚集物質(zhì)（Aggregation substance，AS）：AS基因可引起質(zhì)粒傳遞，在躲避宿主免疫反應(yīng)中作用極大。此外，還有膠原結(jié)合蛋白（Adhesin of collagen. from Enterococcus，Ace）和透明質(zhì)酸酶（Hayluronidase，Hyl）等也是腸球菌毒力因子之一[11]。

2.4 ?馬源腸球菌的流行病學(xué)分析

馬源腸球菌相關(guān)報(bào)道在國(guó)內(nèi)外均相當(dāng)匱乏。通過(guò)閱讀相關(guān)文獻(xiàn)及查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，僅有少數(shù)國(guó)家和地區(qū)對(duì)該病原菌耐藥性及致病性有所研究，耐藥基因及毒力基因分子學(xué)研究信息資源更是相對(duì)缺乏。

2.4.1 ?馬源腸球菌耐藥性分析 ?2007 年Lleo等[14]曾報(bào)道，在不利條件下，腸球菌會(huì)處于休眠狀態(tài)，但仍保留一定的生物學(xué)特性，菌株能夠從這種狀態(tài)中復(fù)蘇并恢復(fù)主動(dòng)感染和抗菌素耐藥特性;同年，De 等[15]報(bào)道在馬匹的臨床治療中有些并沒有使用糖苷類藥物，卻在馬身上發(fā)現(xiàn)了VRE。然而，Weese等[16]在荷蘭馬臨床樣本微生物學(xué)診斷中發(fā)現(xiàn)腸球菌分離物的百分比從2002年的0上升到2008年的37%;雖然萬(wàn)古霉素一般不用于馬科醫(yī)學(xué)，但它有時(shí)作為一種治療替代品具有獨(dú)特的療效，因此vanA-enterococci的存在就成為一個(gè)嚴(yán)重的臨床問題[17]。2008年，Laukova等[18]發(fā)現(xiàn)，耐萬(wàn)古霉素腸球菌在馬場(chǎng)分離株中比例高達(dá) 37.2%，但萬(wàn)古霉素耐藥基因檢測(cè)為陰性。從健康和患病的馬的糞便中分離出的腸球菌對(duì)抗生素的耐藥性已經(jīng)在先前研究中得到了評(píng)估并被報(bào)道[19];2010 年，葡萄牙學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，可以在糞便中檢測(cè)出vanA-enterococci，并可能會(huì)傳播給其他動(dòng)物的耐藥細(xì)菌宿主，耐藥決定因素和耐藥細(xì)菌可以在局部地區(qū)和全球范圍內(nèi)輕松傳播，從而增強(qiáng)耐藥性的出現(xiàn)[20]。

2.4.2 ?馬源腸球菌致病性分析 ?2007年，Lleo等[14]報(bào)道曾有一匹小馬因感染糞腸球菌而發(fā)病，糞腸球菌還能形成生物膜，以避開宿主的防御，增加治療難度;2009年，美國(guó)科學(xué)家曾報(bào)道某騎師因鉛黃腸球菌入侵而患眼內(nèi)炎[21];2010年，Taylor等[22]報(bào)道在9%的肌肉骨骼敗血癥病例中分離出腸球菌;2012 年，Herdan等[23]首次報(bào)道新西蘭有3匹外傷馬匹由于繼發(fā)感染多重耐藥性腸球菌而引起滑膜敗血癥;2013年，部分韓國(guó)學(xué)者對(duì)100多家馬術(shù)俱樂部進(jìn)行馬源腸球菌特征分析，通過(guò)抗微生物（AR）圖譜顯示：AR腸球菌的平均比例為23.8%，分別在51.1%和47.7%的分離株中觀察到生物膜的形成和凝膠酶的活性;大多數(shù)是攜帶gelE基因的糞腸球菌，提供了AR腸球菌在馬及其環(huán)境之間傳播的證據(jù)，強(qiáng)調(diào)了AR腸球菌通過(guò)密切接觸傳播給騎手和操作者的風(fēng)險(xiǎn)，并闡明了AR腸球菌向人類傳播的風(fēng)險(xiǎn)[24]。2017 年，有學(xué)者對(duì)新疆馬的人畜共患病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，馬源糞腸球菌的陽(yáng)性率約為15%，毒力基因檢出率為40%～80%，給當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)造成了一定的潛在性威脅[25]。有研究顯示，致病菌株往往具有多重耐藥性，并表現(xiàn)出溶血、細(xì)胞外明膠酶和膠原蛋白黏附等毒力因子，且腸球菌株耐藥的嚴(yán)重性直接影響其致病性[26]。

3 ?研究結(jié)果

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行分析總結(jié)得出以下結(jié)果：①馬源腸球菌耐藥及致病研究資料相當(dāng)匱乏;②馬源腸球菌耐藥性及致病性日益嚴(yán)重，對(duì)馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在一定的潛在威脅性，應(yīng)引起學(xué)者的高度重視。

4 ?對(duì)策及分析

4.1 ?馬源腸球菌的遺傳特性

分離培養(yǎng)主要腸球菌，采用全基因組抽取法進(jìn)行全基因組DNA提取，通過(guò)1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因組DNA濃度進(jìn)行估測(cè)，并用Biodrop進(jìn)行定量。其純度和濃度都達(dá)到測(cè)序要求后進(jìn)行全基因組測(cè)序。采用各種相關(guān)軟件對(duì)不同地區(qū)、不同株的腸球菌進(jìn)行基因組差異和進(jìn)化關(guān)系等研究，分析不同來(lái)源的菌株在進(jìn)化樹上的特征。應(yīng)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）和多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)進(jìn)行遺傳背景研究，尋找病原菌及耐藥菌株在進(jìn)化上的地位，為以后病原菌感染和致病機(jī)制研究工作提供參考。該方法可系統(tǒng)性地從分子水平對(duì)武漢市各地馬匹進(jìn)行腸球菌遺傳特性分析，比較不同環(huán)境對(duì)腸球菌進(jìn)化的影響，從而為馬源腸球菌的耐藥及致病機(jī)理研究提供參考。

4.2 ?馬源腸球菌耐藥特性

對(duì)腸球菌主要抗生素進(jìn)行耐藥表型檢測(cè)，對(duì)鑒定出的腸球菌采用微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），并統(tǒng)計(jì)分析其耐藥情況;對(duì)耐藥菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)（主要為氨基糖苷類藥物和萬(wàn)古霉素），統(tǒng)計(jì)分析耐藥基因與耐藥表型的相關(guān)性;由于HLGR及VRE的分離率在國(guó)內(nèi)迅速上升，故可對(duì)臨床中馬源HLGR、VRE菌株耐藥表型、耐藥基因和耐藥傳播機(jī)制進(jìn)行研究，為HLGR、VRE感染的防治提供基礎(chǔ)。該方法可從基因?qū)W層面對(duì)馬源腸球菌主要抗生素即氨基糖苷類和萬(wàn)古霉素耐藥的生物學(xué)特性及遺傳背景進(jìn)行探索，有利于控制耐藥基因的傳播，降低馬產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)因腸球菌抗生素嚴(yán)重耐藥導(dǎo)致的損失。

4.3 ?馬源腸球菌毒力特性

糞腸球菌致病島是由許多毒力基因組成的基因簇，是腸球菌致病的來(lái)源，因此可對(duì)各毒力基因分布特征進(jìn)行研究，從而為以后致病性腸球菌的研究打下基礎(chǔ)。

膠原結(jié)合蛋白ace是腸球菌表面識(shí)別黏附基質(zhì)的一類蛋白分子，它能介導(dǎo)腸球菌黏附在宿主細(xì)胞的外基質(zhì)蛋白之上，是腸球菌重要致病因子之一。然而目前對(duì)馬源腸球菌的研究并不多，尤其毒力因子ace的研究更少。為研究ace基因?qū)δc球菌的致病性影響情況，可選取武漢市馬源腸球菌為研究對(duì)象，構(gòu)建腸球菌ace基因突變菌株，研究ace基因在腸球菌感染中的分子機(jī)制，探討ace基因在菌體致病表達(dá)中的作用，為馬臨床腸球菌致病機(jī)制的研究等提供理論基礎(chǔ)。

4.4 ?制訂馬匹用藥指南

最后，根據(jù)其耐藥及致病結(jié)果篩選出馬匹最佳用藥方案，制訂合理的馬匹用藥指南，從而減少因?yàn)E用抗生素而增加臨床中馬匹治療難度的困擾。該內(nèi)容為保證競(jìng)賽馬匹健康提供了一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為順利完成第七屆世界軍人運(yùn)動(dòng)會(huì)馬術(shù)賽事提供了一定的服務(wù)保障。

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