侯玉珍，龍 艷，郭倫愛，陳俊銳，張緒富，戴迎春

輪狀病毒(rotaviruses，RV)是引起嬰幼兒和所有年齡人群病毒性胃腸炎的主要病原體，2016年引起全球大約13萬例嬰幼兒死亡和各年齡人群23萬例死亡[1]。RV屬于呼腸病毒科RV屬，其基因組由11個(gè)雙鏈RNA節(jié)段組成，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP6)。糖蛋白VP7和刺突蛋白VP4構(gòu)成RV外衣殼，VP4蛋白經(jīng)胰蛋白酶切割后裂解形成VP5*和VP8*兩個(gè)蛋白，其中VP8*蛋白主要參與受體識(shí)別，介導(dǎo)病毒作用宿主細(xì)胞[2]?；赩P4序列，A組RV分為P [1]-P[40]40種基因型，基于VP8*序列，RV分為P[I]-P[V] 5個(gè)基因組[3-4]。 P[I]、P[IV]、P[V]主要感染動(dòng)物，P[II]只感染人，P[III]既能感染人，也能感染動(dòng)物。P[1]、 P[2]、P[3]和P[7]屬于P[I]基因組，人群中廣泛流行的P[4]、P[6]和P[8]屬于P[II]基因組，P[9]、P[14]和P[25]屬于P[III]基因組。

研究發(fā)現(xiàn)RV VP8*可以識(shí)別HBGA作為其感染受體或配體[2,5]。HBGA具有豐富的多態(tài)性，包括ABO、分泌型和Lewis三個(gè)基因家族，在世界人群中廣泛分布[6]。不同P型的RV與HBGA的結(jié)合具有型別特異性，不同人群對(duì)各型RV易感性也存在差異[7]。因而，研究RV與HBGA的相互作用對(duì)于闡明RV的感染機(jī)制及宿主范圍具有重要意義。

2009-2014年間P[9]RV在我國(guó)成都、武漢和濟(jì)南等地被檢出[8-10]。P[9]RV屬于P[III]基因組，既能感染人也能感染犬和貓[11]，具有在人和動(dòng)物中跨物種傳播的潛在可能。本研究表達(dá)和純化了P[9]RV VP8*蛋白，對(duì)其與HBGA的結(jié)合特征進(jìn)行了研究，同時(shí)，檢測(cè)廣東汕尾地區(qū)人群P[9]RV抗體水平，分析P[9]RV抗體與HBGA的相關(guān)性，為RV感染機(jī)制的研究及疾病防控提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本采集 于2015年1月24-27日采集廣東省汕尾市3～88歲(平均年齡51.2歲)一般人群配對(duì)的唾液和血清樣本206份；266份唾液樣本源于南方醫(yī)院并已確定HBGA表型，為本實(shí)驗(yàn)室保存[12]，隨機(jī)選取45份用于本研究HBGA結(jié)合試驗(yàn)。

1.1.2試劑 感受態(tài)細(xì)胞TOP10和BL21購(gòu)于天根生化科技有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒，瓊脂糖切膠回收試劑盒，T4連接酶，BamHI和SalI內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)thermo fisher scientific公司，GST-Resin購(gòu)自上海七海富泰生物科技有限公司，凝血酶購(gòu)自英國(guó)GE公司，LB肉湯、LB瓊脂購(gòu)自北京路橋，氨芐青霉素、IPTG購(gòu)自sigma， HRP-羊抗人IgG購(gòu)自美國(guó)Abcam，表達(dá)載體pGEX-4T-1和兔抗VP8*血清為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1P[9]RV VP8*基因序列合成 P[9]RV VP8*基因序列參照GenBank公布的AB077766基因序列，序列范圍位于10-702位點(diǎn)共693個(gè)堿基，在VP8*基因序列的上、下游分別加入BamH I和SalI酶切位點(diǎn)，序列由華大基因合成。

1.2.2pGEX-4T-1-VP8*重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將華大基因提供的含有質(zhì)粒pUC57-VP8*的穿刺菌涂于含氨芐青霉素(100 mg/mL)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，根據(jù)thermo fisher scientific提質(zhì)粒試劑盒說明書提取質(zhì)粒后進(jìn)行BamH I和SalI雙酶切，切膠純化VP8*基因片段與經(jīng)BamHI和SalI雙酶切的pGEX-4T-1表達(dá)載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞TOP10，pGEX-4T-1-VP8*重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定。

1.2.3重組pGEX-4T-1-VP8*蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21，挑取單個(gè)菌落接種于4個(gè)5 mL含有氨芐青霉素(100 mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)12～16 h，將培養(yǎng)物以1∶100的稀釋度接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)3.5 h至OD600為0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L。繼續(xù)22 ℃ 220 r/min震蕩培養(yǎng)12～16 h。于4 ℃，5 000 r/min離心菌液12 min，棄上清，收集菌體，用80 mL PBS充分重懸菌體，并將菌液于冰浴中對(duì)其進(jìn)行超聲破碎，于4 ℃，12 000 r/min離心75 min。利用GST-resin對(duì)GST融合蛋白進(jìn)行純化獲得GST-VP8*，或者用凝血酶除去融合蛋白的GST標(biāo)簽蛋白，純化獲得VP8*進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.4VP8*蛋白的Western blot鑒定分析 取10 μLVP8*蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，依次用5% BSA封閉、兔抗VP8*血清(1∶1 000)、HRP-羊抗兔IgG(1∶3 000)孵育、PBST充分洗滌，最后HRP-DAB底物顯色。

1.2.5各型唾液HBGA受體與GST-VP8*蛋白結(jié)合的梯度試驗(yàn) 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)[12]，在南方醫(yī)院采集的唾液樣本中隨機(jī)選取各型HBGA(分泌型A、B、O和非分泌型N)各兩份，將唾液用PBS緩沖液按終濃度1∶1 000稀釋后每孔100 μL包被于96孔酶標(biāo)板上，4 ℃過夜；0.05%PBST洗板5次，每孔加入5%脫脂奶粉-PBS 200 μL于37 ℃封閉1 h；0.05%PBST洗板5次，將P[9]RV GST-VP8*蛋白經(jīng)1%脫脂奶粉-PBS3倍梯度稀釋(15 μg/mL，5 μg/mL和1.7 μg/mL)后，加入到相應(yīng)的孔中，37 ℃孵育1 h；0.05%PBST洗板5次，每孔加入兔抗VP8*血清(1∶3 000)100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h；0.05%PBST洗板5次，每孔加入HRP-羊抗兔IgG(1∶3 000)100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h；0.05%PBST洗板5次，使用TMB避光顯色10 min后每孔加入100 μL 2 mol/L磷酸終止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm的吸光值，陽(yáng)性信號(hào)的截?cái)嘀禐楸尘?空白孔的平均值加三倍標(biāo)準(zhǔn)差約為OD450=0.2。

1.2.6唾液樣本與P[9]RV結(jié)合試驗(yàn) 將45份在南方醫(yī)院采集的唾液樣本(HBGA分型A型21份，B型8份，O型8份，N型8份)用PBS緩沖液按終濃度1∶1 000稀釋后每孔100 μL包被于96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜；0.05%PBST洗板1次，每孔加入5%脫脂奶粉-PBS 200 μL于37 ℃封閉1 h；0.05%PBST洗板1次，每孔加入1%脫脂奶粉-PBS稀釋的GST-VP8*蛋白(10 μg/mL)100 μL，37 ℃孵育1 h；0.05% PBST洗板5次，每孔加入兔抗VP8*血清(1∶3 000)100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h；0.05%PBST洗板5次，每孔加入HRP-羊抗兔IgG(1∶3 000)100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h；0.05%PBST洗板5次，使用TMB避光顯色10 min后每孔加入100 μL 2 mol/L磷酸終止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm的吸光值。

1.2.7血清中P[9]RV特異性IgG的檢測(cè) 206份血清樣本取自廣東省汕尾市的一般人群。利用P[9]RV VP8*蛋白作為捕獲抗原，采用ELISA檢測(cè)血清樣本中P[9]RV特異性IgG抗體。用PBS緩沖液稀釋VP8*蛋白至0.5 μg/mL每孔100 μL包被于96孔酶標(biāo)板上，4 ℃過夜；0.05%PBST洗板1次，每孔加入5%脫脂奶粉-PBS 200 μL于37℃封閉1 h；0.05%PBST洗板1次，每孔加入1%脫脂奶粉-PBS兩倍梯度稀釋的血清樣本，37 ℃孵育1 h；0.05%PBST洗板1次，每孔加入用1%脫脂奶粉-PBS稀釋的HRP-羊抗人IgG(1∶3 000)，37 ℃反應(yīng)1 h；0.05%PBST洗板5次，使用TMB避光顯色10 min后每孔加入100 μL 2 mol/L磷酸終止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm的吸光值。

1.2.8唾液HBGA表型鑒定 206份唾液樣本取自廣東省汕尾市的一般人群。唾液HBGA表型檢測(cè)包括ABO、Lewis以及分泌型，采用ELISA方法檢測(cè)。將煮沸的唾液用PBS緩沖液1∶1 000稀釋后每孔100 μL包被于96孔酶標(biāo)板上4 ℃過夜；0.05%PBST洗板1次，每孔加入5%脫脂奶-PBS 200 μL于37 ℃封閉1 h；0.05%PBST洗板1次，將單克隆抗體包括A、B、H、Lewis b、Lewis x和Lewis y經(jīng)1%脫脂奶粉-PBS 1∶300稀釋后，加入到相應(yīng)的孔中，37 ℃孵育1 h；Lewis a 4 ℃過夜；0.05%PBST洗板5次；其中Lewis a相對(duì)應(yīng)的二抗為HRP-羊抗鼠IgG(1∶300)；余為HRP-羊抗鼠IgM(1∶300)，37 ℃，反應(yīng)1 h；0.05%PBST洗板5次，使用TMB顯色10 min后每孔加入100 μL 2 mol/L磷酸終止反應(yīng)，測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm的吸光值。

1.2.9統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。抗體陽(yáng)性和陰性兩組HBGA表型比較采用χ2檢驗(yàn)，不滿足χ2檢驗(yàn)條件時(shí)，采用Fisher確切概率法檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1pGEX-4T-1-VP8*表達(dá)載體的構(gòu)建 pGEX-4T-1-VP8*重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I與SalI雙酶切鑒定，獲得大小約5 kb的pGEX-4T-1載體和700 bp的VP8*片段(圖1)，表明成功構(gòu)建pGEX-4T-1-VP8*表達(dá)質(zhì)粒。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pGEX-4T-1-VP8*雙酶切產(chǎn)物圖1 pGEX-4T-1-VP8*重組質(zhì)粒BamHI與Sal I雙酶切鑒定Fig.1 Production of pGEX-4T-1-VP8* plasmid digested by BamH I and Sal I

2.2P[9]RVVP8*蛋白的表達(dá)與純化 通過原核表達(dá)系統(tǒng)，得到可溶形式的P[9]RV VP8*蛋白，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示：融合蛋白大小約為52 kD條帶，經(jīng)凝血酶去除GST標(biāo)簽蛋白后獲得約為28 kD 的目的蛋白，與預(yù)期VP8*蛋白大小一致(圖2)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP8*蛋白的特異性，將SDS-PAGE凝膠分離的目的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，經(jīng)特異性抗體進(jìn)行Western blot分析，在大小為52 kD和28 kD位置顯示條帶，證明了研究所用的原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)表達(dá)的VP8*蛋白具有特異性(圖3)。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化的GST-VP8*蛋白；2：凝血酶切后VP8*蛋白圖2 純化GST-VP8*蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.2 Production of the GST-VP8* fusion protein

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化的GST-VP8*蛋白；2：凝血酶切后VP8*蛋白圖3 純化P[9]VP8*蛋白Western blot印跡分析Fig.3 Western blot analysis of the P[9]VP8* protein

2.3P[9]RV GST-VP8*蛋白與唾液HBGA受體 結(jié)合P[9]RVGST-VP8*蛋白與唾液HBGA受體的結(jié)合情況如圖4所示。GST-VP8*蛋白與A型分泌型HBGA受體結(jié)合，且呈梯度反應(yīng)關(guān)系，與B、O型和非分泌型不結(jié)合。進(jìn)一步以中國(guó)人群唾液樣本驗(yàn)證P[9]RV與HBGA受體結(jié)合特征，隨機(jī)抽取45份唾液樣本用于本研究驗(yàn)證，根據(jù)梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為保證OD值的有效性及背景值的可參考性，我們把后續(xù)實(shí)驗(yàn)中GST-VP8*蛋白與唾液HBGA受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的濃度定為10 μg/mL。結(jié)果如圖5所示：GST-VP8*蛋白與A型分泌型HBGA受體結(jié)合，與B、O型和非分泌型不結(jié)合。各型OD均值分別為A=0.751，B=0.135，O=0.130，N=0.160。

注：1×，3×，9×表示三倍梯度稀釋的GST-VP8*蛋白濃度分別為15 μg/mL，5 μg /mL和1.7 μg/mL圖4 P[9]RV與唾液HBGA受體結(jié)合梯度圖Fig.4 Binding activity of P[9]RV to HBGA receptor

圖5 P[9]RV與唾液樣本結(jié)合方式Fig.5 Binding activity of P[9]RV to saliva sample

2.4血清P[9]RV IgG抗體與唾液HBGA表型的關(guān)系 采集廣東省汕尾市206名一般人群配對(duì)的血清和唾液樣本，檢測(cè)血清P[9]RV特異性IgG抗體滴度和唾液HBGA表型。206份血清樣本中P[9]RV特異性IgG檢出率為13.6%(28/206)。血清P[9]RV特異性IgG與HBGA表型有關(guān)。與P[9]RV特異性IgG陰性的個(gè)體相比，A型HBGA受體在P[9]RV特異性IgG陽(yáng)性的個(gè)體中所占的比例明顯較高(P=0.001)，分泌型受體在P[9]RV特異性IgG陽(yáng)性的個(gè)體中所占的比例明顯較高(P=0.017)；相反，Lea+/Lex+在P[9]RV特異性IgG陽(yáng)性的個(gè)體中所占的比例明顯較低(P=0.014)。

表1 P[9]RV IgG抗體與唾液HBGA表型的關(guān)系
Tab.1 Association between P[9]RV IgG and the phenotypes of HBGA

分型P[9]RV抗體陽(yáng)性 (%)P[9]RV抗體陰性(%)P血型28178A15(53.6)32(18.0)B6(21.4)37(20.8)0.001O6(21.4)104(58.4)AB1(3.6)5(2.8)Lewis分型28178Leb+/Ley+27(96.4)129(72.5)Lea+/Lex+0(0)28(15.7)0.014Lea+b+/Lex+y+1(3.6)21(11.8)分泌狀態(tài)28178分泌型28(100)150(84.3)0.017非分泌性0(0)28(15.7)

注：Leb+/Ley+和Lea+b+/Lex+y+屬于分泌型，Lea+/Lex+屬于非分泌型。

3 討 論

VP8*是RV表面刺突蛋白VP4的遠(yuǎn)端，主要參與受體識(shí)別，介導(dǎo)病毒識(shí)別宿主細(xì)胞，研究表明，重組VP8*蛋白可以識(shí)別HBGA受體，提示VP8*蛋白可成為研究RV-HBGA相互作用的理想模型[13]。本研究以P[9]RV為對(duì)象，表達(dá)純化了VP8*蛋白，通過唾液HBGA結(jié)合鑒定，發(fā)現(xiàn)P[9]RV特異性地與A型HBGA結(jié)合。國(guó)外有研究使用當(dāng)?shù)豏V融合VP8*蛋白，采用血凝結(jié)合試驗(yàn)得出P[III]RV與A型分泌型HBGA受體結(jié)合的模式[13]。本研究利用中國(guó)人群唾液樣本，證實(shí)了P[9]RV VP8*與A型分泌型HBGA受體結(jié)合，而不與B、O型分泌型HBGA受體及非分泌型HBGA受體結(jié)合。

我們還研究了一般人群血清樣本中P[9]RV特異性IgG陽(yáng)性率和HBGA表型之間關(guān)系。發(fā)現(xiàn)A型分泌型HBGA個(gè)體配對(duì)的血清中P[9]RV特異性IgG陽(yáng)性率明顯較高，A型分泌型存在于Leb+/Ley+和分泌型HBGA個(gè)體中，不存在于Lea+/Lex+和非分泌型HBGA個(gè)體中，因此，Leb+/Ley+和分泌型HBGA個(gè)體配對(duì)的血清中P[9]RV特異性IgG陽(yáng)性率明顯較高，而Lea+/Lex+和非分泌型HBGA個(gè)體配對(duì)的血清中不存在P[9]RV特異性抗體。表明A型分泌型HBGA受體可能是P[9]RV重要的宿主易感因素。

我國(guó)1980-2011年間P型RV中P[8]和P[4]為主要流行株，檢出率分別為50.2%和18.2%，P[9]的檢出率較低為0.9%[14]。研究RV與HBGA受體的關(guān)系有助于理解RV的流行病學(xué)。我們課題組對(duì)P[8]和P[4]RV與HBGA結(jié)合方式開展了研究[12]，發(fā)現(xiàn)P[8]和P[4]RV能識(shí)別具有A、B和O分泌者的HBGA受體，且分泌型人群占我國(guó)總?cè)巳旱?0%～90%人[15]，表明P[8]和P[4]RV具有廣譜易感人群，一定程度上解釋了P[8]和P[4]RV為主要流行株的原因。本研究發(fā)現(xiàn)P[9]RV VP8*與分泌型A型HBGA受體結(jié)合，而不與分泌型B、O型HBGA受體及非分泌型HBGA受體結(jié)合，P[9]RV易感人群范圍較窄，解釋了我國(guó)P[9]RV檢出率低于P[8]RV檢出率這一現(xiàn)象。

Wang等[16]發(fā)現(xiàn)我國(guó)兩株罕見的人P[9]型RV可能來源于犬和貓。P[9]RV能夠跨物種傳播可能是因?yàn)檫@些物種具有某種相同的物質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)，P[9]RV VP8*與分泌型A型HBGA受體結(jié)合，在很多動(dòng)物物種中也表達(dá)A型HBGA受體[17]，動(dòng)物和人類中都具有A型HBGA抗原可能是P[9]RV跨物種傳播的原因。

利益沖突：無