宋伊寧,徐 靜,龐建達(dá),王昕蕊,劉曉雷,劉明遠(yuǎn),孫樹民，

旋毛蟲是一種雌雄異體線蟲，可感染包括人類在內(nèi)的所有哺乳動物、部分食肉鳥類及爬行動物，能夠引發(fā)嚴(yán)重的人獸共患傳染病，對人類和動物健康、社會及經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生極大負(fù)面影響[1]。盡管旋毛蟲病在歐洲和美國得到良好控制,但在中國、阿根廷和東歐等發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家仍有流行[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)旋毛蟲入侵宿主機體不是簡單的機械性滲透的結(jié)果[4]。盡管旋毛蟲的感染可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體等獲得性免疫效應(yīng)，但是這些免疫效應(yīng)并不能完全抑制旋毛蟲的生長發(fā)育，機體處于一種慢性持續(xù)感染的狀態(tài)，表明旋毛蟲能夠抑制和逃避宿主免疫反應(yīng)[5]。旋毛蟲可能借助自身的蛋白發(fā)揮侵襲和寄生作用，其免疫機制在旋毛蟲發(fā)育、侵襲和寄生過程中起著重要作用[6]。近年來，旋毛蟲誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的免疫抑制作用備受關(guān)注，這種由旋毛蟲感染誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的免疫抑制作用對過敏性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著極大的推動作用，并為以上幾類疾病的研究和防控提供了新的思路和轉(zhuǎn)機[7-10]。

旋毛蟲不同發(fā)育時期產(chǎn)生的期特異性抗原可誘導(dǎo)宿主機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[11-12]。多項研究表明旋毛蟲感染早期可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫抑制作用，在這一階段蟲體發(fā)育迅速，蟲體形態(tài)和分泌產(chǎn)物不斷變化，經(jīng)歷了感染性幼蟲的快速脫囊，侵入腸粘膜上皮細(xì)胞，4次蛻皮發(fā)育為成蟲，雌雄成蟲交配，雌蟲于感染后第4 d開始產(chǎn)新生幼蟲，最后新生幼蟲隨血液或淋巴液迅速移行并侵入骨骼肌的復(fù)雜發(fā)育變遷過程。據(jù)此推測旋毛蟲發(fā)育早期約6 d時間內(nèi)的不同時間點對宿主的免疫調(diào)節(jié)存在復(fù)雜性和波動性。旋毛蟲感染抑制Th1 / Th17應(yīng)答的同時誘導(dǎo)Treg細(xì)胞減少炎癥反應(yīng)[13]，Th1 / Th2細(xì)胞對機體免疫功能的平衡有著至關(guān)重要的作用，平衡遭到破壞致使機體處于感染狀態(tài)[14]。根據(jù)這一特性，本研究檢測了旋毛蟲感染早期的4個關(guān)鍵時間節(jié)點小鼠腸系膜淋巴結(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)情況，并進行了病理切片染色觀測，探究旋毛蟲感染早期對宿主免疫調(diào)節(jié)的機制。

1 材料與方法

1.1試驗動物及旋毛蟲蟲種 BALB/c鼠：6～8周，18～25 g，雌性，購自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心。

旋毛蟲蟲種：中國河南豬旋毛蟲分離株(T1)，標(biāo)準(zhǔn)國際蟲種編號ISS534，由吉林大學(xué)人獸共患病研究所提供。

1.2主要試劑及儀器 無水乙醇、二甲苯、石蠟、液氮、眼科剪、眼科鑷、45 mm灌胃針、載玻片、蘇木素伊紅(HE)染液購自無錫市江原實業(yè)技貿(mào)總公司、MSD試劑盒(貨號：K150691-1)購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司、讀板液購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司、倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、KD202A輪轉(zhuǎn)切片機(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)、MSD(型號：Quick Plex SQ120)。

1.3旋毛蟲攻蟲感染 本試驗共需48只BALB/c鼠，對其中24只健康鼠按照250條/只灌胃處理，并將剩余24只鼠設(shè)置為空白組進行對照。分別在感染后6 h、30 h、3 d、6 d，將試驗所需數(shù)量的感染鼠和空白鼠處理，無菌條件收集試驗材料。

1.4腸道蘇木素伊紅(HE)染色 于上述4個時間，每組處死3只感染組鼠及3只空白組鼠，無菌條件收集腸道組織。將組織進行常規(guī)包埋、切片，烘干后脫蠟。隨后加入試劑盒中的蘇木素染色液, 室溫孵育8 min。蒸餾水洗去多余染液, 使用分化液觀察分色情況。蒸餾水漂洗2 min，加入試劑盒中的伊紅染液, 室溫孵育1 min，蒸餾水沖洗20 s。無水乙醇脫水2 min后，浸入二甲苯透明處理10 min，樹膠封片，晾干后拍照。

1.5電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(MSD)檢測 于上述4個時間點，每組處死3只感染組鼠和3只空白組鼠，無菌條件收集腸系膜淋巴結(jié)，使用液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱中，用于IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TGF-β等細(xì)胞因子的檢測。將300 μL Linker與200 μL對應(yīng)的生物素標(biāo)記的抗體混合均勻，室溫孵育30 min。隨后加入200 μL的終止液混合均勻，室溫孵育30 min。包被MSD板，每孔加入50 μL抗體，室溫孵育1 h。使用1×PBS (0.05% Tween-20)清洗液將MSD板進行3次循環(huán)洗滌后加入25 μL的稀釋液，再加入25 μL的樣本,封口膜封上后室溫振蕩1 h。再次清洗MSD板3次后，每孔加入50 μL檢測抗體室溫振蕩1 h。再次清洗MSD板3次，加入150 μL讀板液，上機檢測，讀取結(jié)果。

1.6數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 使用SPSS22.0軟件對以上細(xì)胞因子試驗數(shù)據(jù)采用t檢驗方法進行分析，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。根據(jù)產(chǎn)生情況及其變化規(guī)律，并用GraphPad 5.0軟件繪圖并分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1腸道蘇木素伊紅(HE)染色結(jié)果 感染后不同時間點小腸病理切片觀察，與空白對照組相較，感染后6 h小腸組織炎性細(xì)胞浸潤；感染后30 h粘膜水腫，炎性細(xì)胞顯著增多；感染后3 d粘膜炎性細(xì)胞浸潤，粘膜損傷嚴(yán)重；感染后6 d粘膜及粘膜下層炎性細(xì)胞浸潤明顯，粘膜損傷加重，并伴有水腫。

圖1 不同時間點(A-E:空白對照、感染后6 h、30 h、3 d、6 d)腸道組織切片F(xiàn)ig.1 Intestinal tissue sections at different time points (A-E: blank control group,6 h, 30 h, 3 d,6 d after infection)

2.2電化學(xué)發(fā)光免疫分析(MSD)檢測結(jié)果 與空白對照組相比，感染組腸系膜淋巴結(jié)IL-2水平于感染后6 h顯著降低，3 d、6 d顯著升高，30 h無顯著變化；IL-4水平于感染后3 d、6 d顯著升高；IL-10水平于感染后6 h、30 h降低，但不顯著，3 d、6 d顯著升高；IL-17A水平于感染后6 d明顯降低，30 h、3 d顯著升高；IFN-γ水平于感染后3 d、6 d顯著升高；TGF-β水平于感染后30 h顯著升高，3 d、6 d升高，但不顯著。

3 討 論

旋毛蟲感染的同時對宿主產(chǎn)生強烈免疫調(diào)節(jié)作用[15-16]，大量研究表明在旋毛蟲的急性感染期和慢性感染期均可以促進Treg細(xì)胞的數(shù)量增加，旋毛蟲通過一個促使Treg細(xì)胞數(shù)量增加的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)下調(diào)宿主的免疫應(yīng)答情況[17]。此外，旋毛蟲對天然免疫系統(tǒng)也存在免疫抑制作用[18]。多數(shù)研究檢測為1 d以上感染天數(shù)的免疫調(diào)節(jié)情況，本試驗對此檢測時間提出不同看法，以BALB/c鼠為實驗動物，檢測旋毛蟲感染后肌幼蟲L1腸粘膜上皮細(xì)胞入侵期(6 h)，旋毛蟲成蟲初形成期(30 h)，以及3 d和6 d 4個時期宿主的腸系膜淋巴結(jié)免疫應(yīng)答情況。此外，對4個時間點的感染組及空白組進行了組織切片染色觀察。

腸道病理染色結(jié)果顯示：旋毛蟲感染后6 h至6 d腸道的炎癥反應(yīng)隨時間延長加重。MSD結(jié)果顯示免疫抑制存在于6 h時，表現(xiàn)為IL-2作為誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的重要細(xì)胞因子水平顯著降低,其他細(xì)胞因子無顯著變化，指示Th1免疫應(yīng)答受到抑制；感染后30 h，TGF-β和IL-17A水平顯著升高，IL-17A作為炎性細(xì)胞因子可以強烈招募中性粒細(xì)胞，因而提示此時機體處于前炎癥反應(yīng)階段；感染后3 d和6 d兩個時期，Th1型細(xì)胞因子(IL-2，IFN-γ)和Th2型細(xì)胞因子(IL-4，IL-10)水平均顯著升高，提示機體此時處于炎癥反應(yīng)階段，呈現(xiàn)Th1 / Th2混合型免疫應(yīng)答，這與Ilic等人[17]的發(fā)現(xiàn)近似。本研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲感染后6 h是旋毛蟲(肌幼蟲L1)侵入腸系膜上皮細(xì)胞的階段，此時腸道內(nèi)的Th1型免疫抑制狀態(tài)有利于旋毛蟲(肌幼蟲L1)脫囊后至進入腸上皮細(xì)胞前免受Th1型免疫的殺傷和清除作用。旋毛蟲感染后30 h時已經(jīng)完成4次蛻皮并發(fā)育為成蟲，但感染后30 h及更長時間的炎癥反應(yīng)將無法徹底清除全部成蟲[19]，旋毛蟲發(fā)育肌幼蟲期宿主長期處于Th2型免疫反應(yīng)，這種免疫反應(yīng)是蟲體不同發(fā)育時期長期刺激宿主免疫系統(tǒng)的結(jié)果，旋毛蟲感染刺激宿主機體導(dǎo)致免疫失衡逐漸趨向Th2型免疫應(yīng)答[20-21]，這種應(yīng)答為以Th1型免應(yīng)答失衡而導(dǎo)致的疾病帶來了新的治療方法，其主要原因是旋毛蟲感染能夠調(diào)節(jié)免疫失衡宿主(如：炎癥性腸病患者)的免疫平衡。

旋毛蟲感染后6 h腸道Th1型免疫應(yīng)答受到抑制，并在感染后3 d和6 d 2個時期呈現(xiàn)Th1 / Th2混合型免疫應(yīng)答，以及從感染后6 h至6 d腸道的炎癥逐漸加重的變化趨勢，反映了旋毛蟲感染早期對宿主免疫調(diào)節(jié)的復(fù)雜性，旋毛蟲通過誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的Th2型免疫應(yīng)答[22]，從而實現(xiàn)其在宿主體內(nèi)長期寄生。本研究有助于闡明旋毛蟲感染早期誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的免疫抑制機制，為相關(guān)疾病的研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突：無