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杭州地區(qū)相同分子型別的單核細(xì)胞增生李斯特菌臨床和食品分離株基因組分析

2019-09-20 11:06董華麗汪皓秋樓秀芹王旭初潘勁草
中國人獸共患病學(xué)報 2019年8期
關(guān)鍵詞:單核細(xì)胞李斯特基因組

俞 驊,董華麗,汪皓秋,樓秀芹,劉 濤,張 蔚,王旭初,潘勁草

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種常見的食源性致病菌,在肉、蔬菜、水果、冷凍飲品等食品中均能檢出,可引起人畜疾病。免疫力低下者攝入該菌會引起李斯特菌病,癥狀主要為腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)等,嚴(yán)重的可以造成死亡。李斯特菌病平均潛伏期為2~3周,最長可超過70 d[1-2]。一旦發(fā)病,特別是散發(fā)病例,進(jìn)行食物來源溯源非常困難。近年來在歐美發(fā)達(dá)國家造成多起由其引起的食物中毒嚴(yán)重暴發(fā)事件,死亡率甚至可達(dá)20%~30%[3]。而在國內(nèi)散發(fā)病例(如造成孕產(chǎn)婦流產(chǎn))較為常見[4]。

引起李斯特菌病的血清型主要是1/2a、1/2b和4b,分子分型和溯源一般采用脈沖場凝膠電泳(Pulse-field gel electrophoresis,PFGE)。但傳統(tǒng)的分子分型方法受限于分析位點(diǎn)限制,分辨力有限。隨著高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,基于細(xì)菌核心基因組或全基因組SNPs位點(diǎn)進(jìn)行溯源,因其分辨率高、重復(fù)性好,被越來越廣泛使用[5]。本研究對杭州地區(qū)一起食物暴露不明確的李斯特菌病散發(fā)事件的臨床分離株,和流行病學(xué)無關(guān)聯(lián)但具有相同PFGE型別的食品分離株進(jìn)行了基因組測序,分析基因組序列差異。并與NCBI Assembly公共數(shù)據(jù)庫中相同多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus Sequence Typing, MLST)型別的菌株進(jìn)行基因組SNPs位點(diǎn)進(jìn)化分析,研究可能的污染食品溯源與傳播途徑。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)與分析菌株 選擇PFGEApaI和AscI酶切圖譜完全一致(見圖1)的杭州地區(qū)2007-2011年單核細(xì)胞增生李斯特菌食品分離株6株和2012年臨床分離株1株(王某,女,22y,中孕,胎死宮內(nèi),高熱入院,B超宮內(nèi)死胎,分離自血培養(yǎng)需氧厭氧雙瓶培養(yǎng)瓶)。多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)結(jié)果均為ST8型,菌株背景信息參見表1。對NCBI Assembly公共數(shù)據(jù)庫中613株單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組進(jìn)行MLST分析,獲得ST8型的基因組。

圖1 7株杭州本地食品與臨床來源ST8型單核細(xì)胞增生李斯特菌PFGE分型圖譜,CMCC 54007為參考菌株Fig.1 Seven local food and clinical isolates of ST8 type of Listeria monocytogenes PFGE cluster, CMCC 54007 was the reference strain

1.2DNA提取、基因組測序、質(zhì)控和組裝 采用QIAamp DNA mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司,貨號:51304)提取基因組DNA;采用 Nextera XT DNA文庫構(gòu)建試劑盒(美國illumina公司,型號:FC-131-1024)進(jìn)行文庫構(gòu)建;基因組測序應(yīng)用illumina Miseq平臺,使用Miseq Reagent Kit v3試劑盒(美國illumina公司,型號:MS-102-3003)。以上操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。對測序reads使用FastQC[6]驗(yàn)證測序質(zhì)量,用Trimmomatic[7]去除接頭序列。使用shovill[8]和Spades[9]進(jìn)行基因組拼接。基因組拼接序列使用Quast[10]驗(yàn)證質(zhì)量。

1.3毒力基因、ncRNA鑒定和質(zhì)粒掃描 基因組測序短序列使用srst2[11],拼接序列使用MLST[12]工具掃描獲得ST型別;用Prokka[13]注釋拼接基因組,使用Infernal[14]以Rfam[15]為數(shù)據(jù)庫鑒定ncRNAs。VFDB(http://www.mgc.ac.cn/VFs)數(shù)據(jù)庫中66個單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力基因做為鑒定數(shù)據(jù)庫,用blastn掃描基因組毒力基因。對本地菌株的基因組拼接序列提交到NCBI blast進(jìn)行比對,鑒定是否攜帶已知質(zhì)粒。

1.4基因組共線性和SNPs分析 用Sibelia[16]將杭州本地臨床分離株12-103基因組分別與杭州地區(qū)ST8型食品分離株,以及公共數(shù)據(jù)庫中2株臨床來源的基因組完成圖的菌株Lm-N1546,IZSAM_Lm_15_17439_A144和1株臨床來源的基因組草圖的菌株LM05-00401進(jìn)行共線性比對。以LM05-00401為參考基因組,用Harvest[17]比對獲得ST8型全基因組SNPs序列。使用Gubbins[18]去除重組,RAxML[19]構(gòu)建基于SNPs的最大似然法進(jìn)化樹(模型采用GTR+G,bootstrap=1 000),使用ggtree[20]繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1基因組測序與公共數(shù)據(jù)庫菌株 7株杭州地區(qū)ST8型單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組測序數(shù)據(jù)及拼接結(jié)果參見表1。采用mlst掃描后,NCBI Assembly公共數(shù)據(jù)庫中613個單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組中可獲得已知ST型別的有600個,其中有41株ST8型單核細(xì)胞增生李斯特菌株,提取這41株ST8型菌株在NCBI Biosample數(shù)據(jù)庫中的背景信息,具體參見表2。

2.2毒力基因、ncRNAs序列和質(zhì)粒分布 毒力基因進(jìn)行掃描結(jié)果顯示除了Lm-N1546和IZSAM-Lm-15-17439-A144缺失virR基因外,其他ST8型菌株均攜帶毒力基因(表3)。杭州本地菌株中12-103的lmo1136多一個9 bp的重復(fù)序列,12-004和12-015的lmo2396少204 bp的片段。杭州地區(qū)菌株的ncRNAs分子只有rli48、rli62和rliG在分布上有差異。公共數(shù)據(jù)庫中的菌株只有LM66和LM71缺少rli31。12-003和12-004未發(fā)現(xiàn)攜帶質(zhì)粒,其余5株攜帶pLmA144(KU513859)質(zhì)粒。菌株的ncRNAs和質(zhì)粒差異見表3。

2.3基因組共線性和SNPs分析 杭州地區(qū)臨床分離株12-103與6株食品分離株和3株國外臨床分離株大于15 kbp片段的共線性均一致,沒有大片段重組現(xiàn)象(共線性結(jié)果參見圖2)?;蚪MSNPs進(jìn)化樹結(jié)果杭州地區(qū)分離株與BCW_3902形成一個的分支。總體上12-103與杭州食品分離株高度近源(進(jìn)化樹參見圖3),12-004與臨床株12-103的進(jìn)化上最接近,只有16個SNPs差異,相差最多的是24個SNPs位點(diǎn)的12-015。

表1 杭州地區(qū)單核細(xì)胞增生李斯特菌分離株及基因組測序結(jié)果
Tab.1L.monocytogenesisolates and genome sequencing results in Hangzhou

StrainSourceYearSerovarMLSTNCBI AccessionGenomeSize(M)N50(bp)CoverageCDS12-003Food, Raw meat, Pork20071/2aST8QKRM002.89298 424245x284312-004Food, Raw meat, Pork20071/2aST8QKRN002.92579 809218x289712-015Food, Raw meat, Chicken20071/2aST8QKRO003.01438 991188x297712-038Food, Frozen meat, Chicken20091/2aST8QKRP003.01440 406251x298112-043Food, Ready to eat, Salad fungus20091/2aST8QKRQ003.01579 981242x297912-052Food, Cooked meat, Beaf20111/2aST8QKRR003.01579 805290x298012-103Human, Blood20121/2aST8QKRL003.01365 122165x2979

表2 NCBI基因組拼接數(shù)據(jù)庫中ST8的菌株基因組
Tab.2 Genomes information of ST8 in NCBI assembly database

StrainNCBI AssemblyGenome LevelsGenome Size(M)Contigs No.DateSerotypeSourceCountryLm N1546GCA_001483445.1complete3.04120111/2abloodSwitzerlandLM70GCA_001487535.1contig2.9641120121/2aunknownItalyLM69GCA_001490875.1contig2.9817520121/2aunknownItalyLM68GCA_001494455.1contig2.9715720121/2aunknownItalyLM66GCA_001497315.1contig2.9721720121/2aunknownItalyLM71GCA_001498715.1contig3.0020120121/2aunknownItalyIZSAM_Lm_15_17439_A144GCA_001513695.1complete2.9112008/7/11/2abloodItalyLM05-00401GCA_001564575.1contig2.922920051/2abloodFranceLM08-01457GCA_001565335.1contig3.012220081/2aunknownunknownMF3949GCA_001586295.1contig3.012120111/2asalmon processing facilityNorwayMF4245GCA_001586305.1contig3.011420111/2asalmon processing facilityNorwayMF5369GCA_001586315.1contig3.011420111/2apoultry processing facilityNorwayMF4077GCA_001586325.1contig3.011420111/2asalmon processing facilityNorwayMF5377GCA_001586375.1contig3.011620131/2apoultry processing facilityNorwayBCW_3902GCA_001761205.1scaffold2.93152006/1/291/2aunknownunknownCFSAN049311GCA_002443405.1scaffold3.002520141/2abloodItalyCFSAN049263GCA_002444035.1scaffold2.922320151/2abloodItalyCFSAN049247GCA_002444235.1scaffold3.042420151/2abloodItalyCFSAN045777GCA_002523295.1scaffold3.03932012/31/2aCooked hamItalyCFSAN045779GCA_002523305.1scaffold3.03602012/31/2aSwab (dairy plant)ItalyCFSAN045775GCA_002523365.1scaffold3.03282012/21/2asalamiItalyCFSAN045772GCA_002523375.1scaffold3.03352012/121/2aFresh sausageItalyCFSAN045769GCA_002523475.1scaffold3.05452012/111/2asalamiItalyCFSAN044784GCA_002524685.1scaffold3.003220041/2apastaItalyCFSAN044783GCA_002524695.1scaffold3.045820041/2afishItalyCFSAN045953GCA_002526485.1scaffold3.05372012/101/2asalamiItalyCFSAN045842GCA_002527555.1scaffold3.00382014/101/2aCured sausageItalyCFSAN045840GCA_002527595.1scaffold3.00382014/91/2aMeat productItalyCFSAN045838GCA_002527635.1scaffold2.92292014/51/2aSmoked salmonItalyCFSAN045826GCA_002527885.1scaffold3.03332013/61/2achickenItalyCFSAN045822GCA_002527945.1scaffold3.00402013/51/2aChicken meatItalyCFSAN045812GCA_002528155.1scaffold2.991042013/41/2asushiItalyCFSAN045804GCA_002528295.1scaffold3.03392013/21/2aChicken saladItalyCFSAN045798GCA_002528425.1scaffold3.00312013/111/2aswabItalyCFSAN045792GCA_002528535.1scaffold3.03522012/91/2asalamiItaly表2(續(xù))

表3 杭州本地分離株主要毒力基因、non-coding RNA、質(zhì)粒分布和SNPs位點(diǎn)差異
Tab.3 Distribution of virulence genes, non-coding RNA, plasmid and SNPs differences in local isolates in Hangzhou

isolatelmo1136bplmo2396bpril48ril62133 bp copy130 bp copyrliGplasmidSNPs Numbers12-0031 6292 415-++missND①2312-0041 6292 211③-+-seedND①1612-0151 6292 211③-++fullpLmA144(KU513859)2412-0381 6292 415+--seedpLmA144(KU513859)2012-0431 6292 415-+-seedpLmA144(KU513859)1812-0521 6292 415---seedpLmA144(KU513859)2312-1031 638②2 415+--seedpLmA144(KU513859)/

注:① ND表示未檢測到(Not detected)。

② 多一段9bp重復(fù)序列5′-gtagatccg-3′。

③ 缺失一段204bp的序列。

圖3 ST8型單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組SNPs位點(diǎn)進(jìn)化樹圖Fig.3 Isolates of L. monocytogenes ST8 genomic SNPs phylogenic tree

3 討 論

單核細(xì)胞增生李斯特菌由于其潛伏期長的特點(diǎn),散發(fā)病例難以從流行病學(xué)調(diào)查攝入食品找到污染病原。缺乏流行病學(xué)證據(jù),可以通過病原細(xì)菌溯源“金標(biāo)準(zhǔn)” —— PFGE分子分型的方法,以實(shí)驗(yàn)室證據(jù)給現(xiàn)場流行病學(xué)提供判定依據(jù)。但對于一些細(xì)菌的特定亞型,PFGE、MLVA等傳統(tǒng)的分子分型技術(shù)存在分辨效果不夠的問題。對于杭州地區(qū)具有相同PFGE型別的臨床分離株與食品分離株要進(jìn)行溯源分析,則應(yīng)采用如高通量測序技術(shù)這種精度更高的方法,從基因組層面獲得更為全面準(zhǔn)確的信息。

研究表明ST8型菌株主要在肉制品或中間加工過程中分離率較高,具有較強(qiáng)的致病潛力,是一類高度克隆化的型別[21]。PFGE帶型相同的食品分離株均來自不同年份不同地區(qū)的生禽、生畜肉,可能這類菌株對肉制品加工流程的環(huán)境適應(yīng)性比較強(qiáng)。對于共線性結(jié)果表明12-103與其他杭州食品分離株和國外臨床分離株在基因組層面沒有出現(xiàn)大片段的重組或丟失等現(xiàn)象,這也與杭州地區(qū)的菌株P(guān)FGE結(jié)果帶型一致相符。對于基因組contigs序列排列是否與國外臨床株一致,還需要通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力基因攜帶率很高[22],毒力調(diào)控因子virR基因起重要的調(diào)控作用,但2株臨床分離株(Lm-N1546和IZSAM-Lm-15-17439-A144)卻缺失該調(diào)控因子。有實(shí)驗(yàn)表明缺失virR基因會明顯降低菌株的耐藥性[23]。本研究中不同來源的ST8型菌株毒力基因分布相同,但部分基因序列結(jié)構(gòu)存在差別。與致死pH值環(huán)境中的菌株酸耐受相關(guān)[24-25]的lmo0036基因序列中臨床分離株12-103比其他食品分離株序列多了9 bp的富亮氨酸重復(fù)(Leucine-rich repeat)序列(gtagatccg)。lmo2396基因是internalin內(nèi)化素基因,與單核細(xì)胞增生李斯特菌靶細(xì)胞識別有關(guān)[26]。食品分離株12-004和12-015此基因缺失了一個204 bp的區(qū)域。ncRNA作為一種在轉(zhuǎn)錄階段調(diào)控整個生物體表達(dá)的RNA小分子,其快速調(diào)控的特點(diǎn)與細(xì)菌環(huán)境適應(yīng),致病性以及針對宿主免疫應(yīng)答逃逸功能相關(guān)[27]。通過對本地ST8型菌株ncRNA分布掃描,結(jié)果表明ncRNAs分布高度一致,只在調(diào)控功能與細(xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的rli48, rli62和rliG這3個A118 prophage類區(qū)域序列[28]位點(diǎn)上有差異。這些序列的差異在臨床株與食品株,以及食品株之間無明顯內(nèi)在規(guī)律。

比較單核細(xì)胞增生李斯特菌PFGE和基因組分析的結(jié)果,基于參考基因組的ST8型菌株進(jìn)化關(guān)系表明,杭州地區(qū)2007-2011年食品分離株與2012年臨床分離株基因組SNPs差異在16~24個之間,基因組核心序列在進(jìn)化上高度同源。結(jié)合國外分離株的基因組,顯示ST8型核心基因組序列高度保守,因此提示PFGE方法可能不適合應(yīng)用于該型別的分型和溯源。雖然ST8型菌株也存在一些ncRNAs分子和質(zhì)粒分布上的分子差異,這些差異與致病性相關(guān)需要后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行研究。

本文針對一例臨床散發(fā)單核細(xì)胞增生李斯特菌分離株與PFGE帶型相同的食品分離株進(jìn)行基因組序列分析,判斷溯源關(guān)系。結(jié)果表明杭州市場近年肉類食品中存在遺傳進(jìn)化高度相似的一群ST8型單核細(xì)胞增生李斯特菌,杭州孕婦的感染非??赡軄碜赃@群菌株,因此肉制品中ST8型單核細(xì)胞增生李斯特菌引起李斯特菌病的安全風(fēng)險應(yīng)引起關(guān)注。

利益沖突:無

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