于金玉 孔 燕 郭 軍

(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所腎癌黑色素瘤內(nèi)科,惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100142)

腫瘤免疫治療(Cancer immunotherapy)是利用自身免疫系統(tǒng)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷，并盡可能地降低對(duì)正常組織的副作用。腫瘤免疫治療是繼化療和靶向治療后最具前景的腫瘤治療方法之一[1]。近年來(lái)，免疫檢查點(diǎn)(Immune checkpoint)抑制劑已在臨床上顯示出免疫治療的優(yōu)勢(shì)，在惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等腫瘤中均表現(xiàn)出持久的抗腫瘤效果以及良好的耐受性[2-5]，但其有效率仍不能滿足當(dāng)前腫瘤治療的需求。因此，未來(lái)的免疫療法需要聯(lián)合多種治療策略。

腫瘤的免疫編輯(Immune editing)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程。腫瘤的發(fā)生經(jīng)過(guò)了3個(gè)連續(xù)的階段，即免疫消除、免疫平衡和免疫逃逸[6]。即使在免疫逃逸階段，腫瘤仍然可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated antigen)是在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高的抗原分子，其在正常細(xì)胞中也有一定的表達(dá)[7]。因此，腫瘤相關(guān)抗原在機(jī)體內(nèi)會(huì)發(fā)生中樞耐受，即針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的特異性T細(xì)胞會(huì)在胸腺中被清除。例如，基于腫瘤相關(guān)抗原黑色素瘤相關(guān)抗原A3(Melanoma-associated antigen-A3，MAGE-A3)研發(fā)的抗腫瘤疫苗在黑色素瘤和肺癌中并沒有提高總生存率[8]，這與中樞耐受導(dǎo)致的T細(xì)胞反應(yīng)弱有很大關(guān)系。

腫瘤新抗原(Neoantigen)存在于各種腫瘤中[9]，它可以成為T細(xì)胞特異性攻擊的靶點(diǎn)，從而殺死腫瘤細(xì)胞[10-13]。在免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療過(guò)程中，新抗原是激活的T細(xì)胞攻擊的靶點(diǎn)[14-16]。近年來(lái)，針對(duì)腫瘤新抗原疫苗的研究逐漸顯示出了新抗原疫苗優(yōu)勢(shì)。在這篇綜述中，我們系統(tǒng)描述了腫瘤新抗原疫苗的研究進(jìn)展。

1 腫瘤新抗原

腫瘤相關(guān)抗原是在正常組織中也存在的蛋白，但是在腫瘤中表達(dá)升高，也被稱為是“自身”抗原，例如癌睪丸抗原家族。腫瘤新抗原是由體細(xì)胞基因突變產(chǎn)生的。例如，非同義點(diǎn)突變、插入缺失突變、移碼突變、基因融合等可產(chǎn)生腫瘤新抗原。因此，腫瘤新抗原也叫腫瘤特異性抗原或“非自身”抗原。突變是癌癥的一個(gè)普遍特征，每種腫瘤可以有成百上千個(gè)編碼基因突變[17]。在二代測(cè)序普及之前，就有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤新抗原可以被免疫系統(tǒng)識(shí)別和靶向。例如，Parmiani等[9]用自體腫瘤特異性T細(xì)胞從外周血和腫瘤中對(duì)新抗原進(jìn)行了體外識(shí)別。與腫瘤相關(guān)抗原相比，腫瘤新抗原作為免疫治療的靶點(diǎn)主要優(yōu)勢(shì)包括無(wú)中樞耐受、與主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex,MHC)分子親和力強(qiáng)、降低了正常組織的脫靶副反應(yīng)、安全性高等。大多數(shù)針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的臨床試驗(yàn)都沒有表現(xiàn)出與標(biāo)準(zhǔn)治療相比更好的獲益[18]。Sahin等[19]發(fā)現(xiàn)接種新抗原表位與腫瘤相關(guān)抗原的患者相比，新抗原表位引起的免疫反應(yīng)更強(qiáng)。但以往鑒定的新型腫瘤抗原有限。近年來(lái)，靶向新抗原治療的關(guān)注越來(lái)越多。隨著二代測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大規(guī)模全基因組測(cè)序?qū)⒉煌┌Y的突變譜展現(xiàn)出來(lái)[20-24]。新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了腫瘤和正常體細(xì)胞基因組序列的快速對(duì)比，這為快速、低成本尋找個(gè)體新抗原提供了有利條件[25]。

2 腫瘤新抗原疫苗

腫瘤新抗原疫苗的目標(biāo)是通過(guò)給予機(jī)體新抗原的刺激，使機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)清除腫瘤細(xì)胞?？梢詫⑿驴乖院铣砷L(zhǎng)多肽(Synthetic long peptide,SLY)、RNA、激活的樹突細(xì)胞(Dendritic cell,DC)及DNA等形式轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)。在體內(nèi)新抗原表位可與MHCⅠ結(jié)合激活CD8+T淋巴細(xì)胞使其分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)，發(fā)揮細(xì)胞毒作用；或與MHCⅡ結(jié)合激活CD4+T淋巴細(xì)胞，使其分化為輔助性T細(xì)胞(Helper T cell)，如Th1和Th2細(xì)胞，分別與巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞相互作用。

制備新型腫瘤抗原疫苗首先要篩選出具有免疫原性的新抗原。Karasaki等[26]對(duì)比了現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)和個(gè)體化檢測(cè)方法篩選新抗原的效果，發(fā)現(xiàn)個(gè)體化檢測(cè)的篩選效率要明顯強(qiáng)于數(shù)據(jù)庫(kù)篩選。 此外，大量的證據(jù)也證實(shí)腫瘤的個(gè)體間存在著顯著的異質(zhì)性[27]。因此，雖然利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)篩選新抗原方便、快速、低成本，但是并不能滿足新抗原篩選的需求，新抗原的篩選還是要以個(gè)體化的檢測(cè)為基礎(chǔ)。

一個(gè)體細(xì)胞突變是否可以成為一個(gè)新抗原通常取決于以下因素：①體細(xì)胞突變是否在蛋白質(zhì)水平表達(dá)；②突變表達(dá)的蛋白是否可以加工成適合的多肽；③多肽與患者自身的人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)分子的親和力；④突變肽/HLA復(fù)合體與T細(xì)胞受體的親和力。全基因組或外顯子測(cè)序得到的許多體細(xì)胞突變并沒有表達(dá)(例如非編碼突變、無(wú)義突變或單等位基因表達(dá)等)。只有成功轉(zhuǎn)錄并翻譯的突變才有可能被加工成短肽片段，與HLA分子結(jié)合提呈于細(xì)胞表面，以得到免疫系統(tǒng)的識(shí)別。人工合成時(shí)，突變的氨基酸通常位于多肽的中間位置。在所有癌癥基因組中，單核苷酸突變引起的非同義突變最有可能表達(dá)并被免疫系統(tǒng)識(shí)別[28]。而且，具有免疫原性的新抗原并不一定是表達(dá)水平高或者突變頻率高的基因，新抗原免疫原性的強(qiáng)弱與突變是否導(dǎo)致功能的改變也無(wú)關(guān)[29]。目前新抗原疫苗制備的流程大致為(圖1)：①患者腫瘤組織和正常體細(xì)胞行基因組或全外顯子測(cè)序；②腫瘤組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；③預(yù)測(cè)和/或檢測(cè)突變的多肽與患者HLA的結(jié)合力；④合成相應(yīng)類型疫苗。Cherryholmes等[30]總結(jié)了所有的MHCⅠ和MHCⅡ結(jié)合預(yù)測(cè)工具，目前大多數(shù)應(yīng)用以基因序列為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)工具，少數(shù)以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。常用的MHC結(jié)合預(yù)測(cè)工具有NetMHCIIPan、免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)(Immune epitope database，IEDB)、SYFPEITHI等[29，31，32]。Rubinsteyn等[33]研發(fā)了綜合基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的個(gè)體化基因組疫苗(Personalized genomic vaccine，PGV)評(píng)分體系。質(zhì)譜技術(shù)中也可以用來(lái)篩選與腫瘤MHC分子結(jié)合的新抗原[34-36]。目前已報(bào)道的新抗原疫苗類型有合成長(zhǎng)多肽疫苗、RNA疫苗、DC疫苗等，不同類型的疫苗在生產(chǎn)、存儲(chǔ)及安全性方面有著不同的優(yōu)劣勢(shì)(表1)。腫瘤新抗原疫苗的給藥方式有皮下給藥、腹膜內(nèi)給藥、淋巴結(jié)內(nèi)給藥以及血管內(nèi)給藥[14，29，36-39]。

3 腫瘤新抗原疫苗的研究

目前已報(bào)道的新抗原疫苗有SLP、RNA和DC疫苗。SLP新抗原疫苗易于生產(chǎn)和存儲(chǔ)且安全性高、毒性低，目前研究最為廣泛。該類疫苗的臨床前和早期臨床研究已經(jīng)在結(jié)腸癌、肉瘤、乳腺癌及黑色素瘤中開展，而且在早期臨床研究中展現(xiàn)了明顯的抗腫瘤優(yōu)勢(shì)。RNA和DC疫苗制備相對(duì)復(fù)雜，研究相對(duì)于SLP較少，但這兩類疫苗均有早期臨床研究開展。RNA新抗原疫苗也在早期臨床研究中表現(xiàn)出有效的抗腫瘤作用，DC新抗原疫苗已被證實(shí)可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)新抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但其抗腫瘤效果還有待進(jìn)一步研究。

圖1 新抗原疫苗制備流程Fig.1 Manufacture of neoantigen vaccineNote: WGS.Whole genome sequencing；WES.Whole exome sequencing.

3.1SLP疫苗 SLP長(zhǎng)度為8～30個(gè)氨基酸不等，通常將突變位點(diǎn)的氨基酸置于多肽的中間位置，并常以poly(I∶C)為佐劑。近期研究顯示，SLP在臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與早期臨床試驗(yàn)中均顯示出了顯著的抗腫瘤效果。

腫瘤新抗原SLP疫苗臨床前研究最為廣泛。異檸檬酸脫氫酶1(Isocitrate dehydrogenase type 1,IDH1)的單等位點(diǎn)突變常發(fā)生于早期膠質(zhì)瘤以及其他腫瘤中[40-45]。Schumacher等[32]通過(guò)體外MHC結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)IDH1(R132H)可以和MHCⅡ分子結(jié)合激活T細(xì)胞，而相應(yīng)的野生型IDH1則無(wú)法激活T細(xì)胞。將IDH1(R132H)的SLP疫苗接種于小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)抗IDH1(R132H)抗體，并且具有抗腫瘤生長(zhǎng)的作用。雖然此項(xiàng)研究是利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的突變位點(diǎn)，沒有進(jìn)行個(gè)體化設(shè)計(jì)，但是它證實(shí)了新抗原疫苗可以激活體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抗腫瘤作用。Castle等[29]通過(guò)小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新抗原驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員18B(Kinesin family member 18B，KIF18B)(K739N)和裂解和聚腺苷酸化特異性因子3樣蛋白(Cleavage and polyadenylation specific factor 3-like，CPSF3L)的疫苗在小鼠的腫瘤預(yù)防與治療上都有明顯的效果，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),95%參加免疫反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞都為CD4+T淋巴細(xì)胞[45]。該團(tuán)隊(duì)建立了腫瘤新抗原SLP疫苗的初步流程，也揭示了CD4+T細(xì)胞在腫瘤新抗原疫苗中的重要作用，提示預(yù)測(cè)新抗原與MHCⅡ分子結(jié)合在開發(fā)新抗原疫苗中有著重要的地位。Gubin等[14]在小鼠肉瘤模型中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新抗原，即層黏連蛋白α亞單位4(Laminin subunit alpha-4，LAMA4)(G1254V)和天冬酰胺連接糖基化8(Asparagine-linked glycosylation 8，ALG8)(A506T)，是抗PD-1治療的免疫反應(yīng)抗原。聯(lián)合接種這兩個(gè)突變抗原表位的SLP不僅對(duì)腫瘤有預(yù)防作用，而且抗腫瘤效果與免疫檢查點(diǎn)抑制劑相當(dāng)，其效果優(yōu)于單個(gè)SLP的疫苗。這項(xiàng)研究提示靶向多個(gè)新抗原的疫苗可以有更顯著的抗腫瘤作用，新抗原疫苗與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)用或許可以使更多的抗原暴露，獲得更好的抗腫瘤效果。Yadav等[36]利用外顯子組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和質(zhì)譜分析等方法篩選出兩種小鼠腫瘤細(xì)胞中有免疫原性的新抗原，發(fā)現(xiàn)大量突變未能與MHC結(jié)合表達(dá)于細(xì)胞表面，提示多肽合成以后傳遞至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后的過(guò)程是決定其能否成為新抗原的重要因素之一。此外，質(zhì)譜技術(shù)有可能成為一個(gè)過(guò)濾無(wú)效突變和篩選新抗原的有效方法，但其靈敏性和特異性還需進(jìn)一步提高。 Martin等[46]將預(yù)測(cè)到的小鼠卵巢癌細(xì)胞ID8-G7的新抗原SLP接種于小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，不論是預(yù)防性還是治療性研究，小鼠的總生存期均未見延長(zhǎng)。卵巢癌是一種突變率相對(duì)較低的腫瘤，Martin等認(rèn)為其突變數(shù)量不足以篩選出有效的新抗原。但是此項(xiàng)研究只分析了與MHCⅠ親和力強(qiáng)的新抗原，CD4+T淋巴細(xì)胞也在新抗原疫苗中發(fā)揮著重要作用，或許預(yù)測(cè)并分析對(duì)MHCⅡ親和強(qiáng)的新抗原可以增加其成功率。

表1 不同類型新抗原疫苗特點(diǎn)比較

Tab.1 Comparison of different types of neoantigen vaccine characteristics

Vaccine typeAdvantagesDisadvantagesSLP vaccineEasy for production and storage;low toxicity and safe;capable of activa-ting both CD8+ and CD4+T cell;easy for repeated vaccination.Require of adjuvant;multiple antigens combination need to be synthesized respectively.RNA vaccineNo integration into the genome;expression of different epitopes at same time.Complex production;easy degradation.DC vaccineCapable of activating na?ve T cell;capable of activating innate and ac-quired immunity;capable of expression different antigen and adjuvant in a single vaccine.Complex production and high cost;short half-life.

人源腫瘤異種移植(Patient-derived xenograft，PDX)模型技術(shù)的發(fā)展使得動(dòng)物疾病模型保留了患者疾病的組織型和遺傳特征[47]。Zhang等[37]利用3名進(jìn)展期乳腺癌患者的PDX模型，通過(guò)計(jì)算分析和體外合成肽親和力實(shí)驗(yàn)，篩選出與MHCⅠ親和力強(qiáng)的新抗原SLP，使之誘導(dǎo)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并將PBMC回輸，其中1名患者環(huán)形導(dǎo)向受體3(Rounda-bout guidance receptor 3，ROBO3)(A1287V)和乳腺癌易感基因2伴隨與定位基因(Partner and localizer of breast cancer susceptibility gene 2，PALB2)(H198D)的新抗原SLP可抑制腫瘤生長(zhǎng)。兩項(xiàng)基于該研究的三陰性乳腺癌臨床研究正在進(jìn)行中(NCT02348320和NCT02427581)。

SLP疫苗在臨床研究中也初見成效。Ott等[31]開展的一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究，共入組了6名高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的惡性黑色素瘤術(shù)后患者(Ⅲ期或Ⅳ期)，預(yù)測(cè)每位患者新抗原與HLA-Ⅰ類分子結(jié)合的能力并排序，給6名患者接種了SLP疫苗。在接種疫苗后20～32個(gè)月的隨訪中，4名Ⅲ期患者均沒有出現(xiàn)復(fù)發(fā)，兩名Ⅳ期患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，但均在抗PD-1抗體治療后獲得完全緩解。該研究盡管是預(yù)測(cè)的新抗原與HLA-Ⅰ的結(jié)合力，但是實(shí)際上激活HLA-Ⅱ的抗原比例要遠(yuǎn)高于HLA-Ⅰ，這再一次說(shuō)明新抗原疫苗不僅可以激活CD8+T細(xì)胞，也可激活CD4+T細(xì)胞。這項(xiàng)臨床研究也成功地證實(shí)了腫瘤新抗原疫苗在臨床應(yīng)用中安全性高、可行性強(qiáng)，具有十分好的應(yīng)用前景。此外，SLY疫苗在胰腺癌臨床研究中也表現(xiàn)出十分好的抗腫瘤復(fù)發(fā)作用[48]。

3.2RNA疫苗 由于RNA疫苗不插入基因組，安全性好，表達(dá)純度高也有著良好的應(yīng)用前景。腫瘤新抗原RNA疫苗在臨床前與早期臨床研究中也顯示出了明顯的抗腫瘤潛力。Kreiter等[38]通過(guò)比較不同的給藥路徑(淋巴結(jié)內(nèi)、淋巴結(jié)周圍、皮下、皮內(nèi))發(fā)現(xiàn)，編碼抗原的裸RNA直接淋巴結(jié)內(nèi)注射具有較高的生物利用度，可選擇性地被DC攝取，有效地引起抗原特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)。在淋巴瘤和黑色素瘤荷瘤的小鼠體內(nèi)，HA和SIINFEKL RNA疫苗分別對(duì)兩種腫瘤起到保護(hù)性和治療性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。該研究首次報(bào)道裸抗原編碼RNA在臨床前研究中的抗腫瘤作用，提示裸RNA可以直接作為一種藥物應(yīng)用。

前文提到Castle等[29]發(fā)現(xiàn)了小鼠黑色素瘤SLP疫苗在小鼠的黑色素瘤預(yù)防與治療上都有明顯的效果。為了避免SLP結(jié)構(gòu)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，該團(tuán)隊(duì)利用編碼新抗原表位的體外轉(zhuǎn)錄信使RNA (In vitro transcribed messenger RNA,IVT mRNA)疫苗接種荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)編碼單表位的小鼠黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌IVT mRNA疫苗也可引起小鼠以CD4+T細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)，并可抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠生存[48]。該團(tuán)隊(duì)還提出了突變組RNA免疫治療工程(Mutanome engineered RNA immunotherapy,MERIT)的概念，綜合運(yùn)用二代測(cè)序、計(jì)算機(jī)免疫學(xué)以及基因組合成技術(shù)進(jìn)行免疫治療。他們將10個(gè)編碼小鼠結(jié)腸癌新抗原表位的RNA整合到2個(gè)RNA疫苗上，每個(gè)RNA疫苗編碼5個(gè)抗原表位，同時(shí)包含了MHCⅠ與MHCⅡ表位。結(jié)果顯示，多表位RNA疫苗有明顯的抗腫瘤作用，激活T細(xì)胞釋放IFN-γ的能力不亞于單表位RNA，同時(shí)也顯著改變了腫瘤的微環(huán)境[48]。一項(xiàng)基于多表位mRNA疫苗的臨床研究也在進(jìn)行中(NCT 02035956)。

隨后Sahin等[19]提出了個(gè)體化突變組疫苗的概念，包括對(duì)單個(gè)體突變的綜合鑒定、新表位的計(jì)算預(yù)測(cè)以及為每個(gè)病人設(shè)計(jì)和制造一種獨(dú)特的疫苗。該團(tuán)隊(duì)開展了黑色素瘤新抗原個(gè)體化RNA疫苗的臨床研究。該研究入組了13例Ⅲ-Ⅳ期黑色素瘤患者，在淋巴結(jié)內(nèi)接種多表位新抗原RNA疫苗后，腫瘤轉(zhuǎn)移性事件發(fā)生率顯著降低。新抗原RNA疫苗的臨床研究再次表明個(gè)體突變可以被利用，可為癌癥患者提供更多治療策略的選擇。

3.3DC疫苗 DC細(xì)胞是一種重要的抗原提呈細(xì)胞，通過(guò)其表面——MHC呈遞抗原：MHCⅠ類分子與CD8+T細(xì)胞相互作用，而MHCⅡ類分子與CD4+T細(xì)胞相互作用。其最大的特點(diǎn)是能夠顯著刺激初始T細(xì)胞活化，是機(jī)體T細(xì)胞免疫應(yīng)答的使動(dòng)者，在T細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有重要作用。DC疫苗的目標(biāo)是利用激活的DC誘導(dǎo)Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)，并激活CTL，以消除腫瘤。FDA批準(zhǔn)的腫瘤相關(guān)抗原疫苗Provenge是由自體PBMCs制備的，其中包括由特定前列腺癌抗原激活的DCs，DC疫苗的安全性和有效性已得到臨床研究驗(yàn)證。腫瘤DC疫苗主要包括抗原多肽誘導(dǎo)和抗原RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)DC兩種形式。

Carreno等[49]首次報(bào)道了新抗原多肽刺激DC能夠誘導(dǎo)黑色素瘤患者產(chǎn)生新抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)(NCT00683670)。該項(xiàng)Ⅰ期臨床研究入組了3名Ⅲ期黑色素瘤患者，為每名患者選取了7個(gè)與HLA-A*02∶01結(jié)合分?jǐn)?shù)高的新抗原，刺激DC細(xì)胞制備DC疫苗。結(jié)果顯示接種DC疫苗可以增強(qiáng)對(duì)新抗原的原有免疫反應(yīng)，也可以誘導(dǎo)新抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，并促進(jìn)了T細(xì)胞的多樣性。此外，該項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，與HLA親和力強(qiáng)的新抗原并不一定是高表達(dá)或高突變的新抗原。然而，該項(xiàng)研究并未評(píng)價(jià)DC疫苗對(duì)3名患者治療的臨床療效。

Forghanifard等[50]通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)得到嵌合腫瘤相關(guān)抗原RNA，并將其電穿孔導(dǎo)入DC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞可表達(dá)嵌合RNA，并誘導(dǎo)健康人和食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者CTL細(xì)胞的分化，在體外發(fā)揮細(xì)胞毒作用。電轉(zhuǎn)腫瘤相關(guān)抗原RNA入DC能夠有效地啟動(dòng)CTL并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞毒性，并且嵌合RNA的成功表達(dá)提示可將新抗原與共刺激因子嵌合導(dǎo)入DC從而增強(qiáng)療效。因此，將具有高免疫原性的新抗原的嵌合體載于DC細(xì)胞是一種潛在的有效的免疫治療方式。

4 總結(jié)與展望

腫瘤新抗原疫苗可有效誘導(dǎo)新抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。腫瘤新抗原的廣泛存在，二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展也為新抗原的發(fā)現(xiàn)和疫苗開發(fā)提供了支撐。但腫瘤新抗原疫苗的開發(fā)仍面臨許多挑戰(zhàn)。第一，需要降低新抗原疫苗的生產(chǎn)成本，縮短疫苗生產(chǎn)周期。目前，從組織采集到疫苗接種所需的時(shí)間從2個(gè)月到5個(gè)月不等[19，31]。對(duì)于癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移或腫瘤晚期患者，需要在較短時(shí)間完成腫瘤新抗原的鑒定和疫苗的制備。第二，新抗原預(yù)測(cè)算法需要進(jìn)一步優(yōu)化，包括更好地預(yù)測(cè)MHC-Ⅰ和Ⅱ類新抗原。此外，需要納入除基因突變以外的基因變異，例如基因融合、插入和缺失。目前新抗原篩選技術(shù)基于核酸水平(全外顯子組或RNA)測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄后修飾和蛋白水平上尚無(wú)高通量檢測(cè)方法，這限制了新抗原篩選的范圍和有效性，蛋白修飾組技術(shù)的發(fā)展將為腫瘤新抗原的鑒定和新疫苗的開發(fā)提供更多的可能性。在預(yù)測(cè)腫瘤新抗原過(guò)程中，各項(xiàng)指標(biāo)也尚無(wú)明確規(guī)范，需要在后期臨床試驗(yàn)過(guò)程中逐漸規(guī)范，形成相關(guān)操作指南。在新抗原數(shù)量的選擇上，需要進(jìn)一步研究和評(píng)價(jià)單表位疫苗與多表位疫苗之間的療效與毒性差異。第三，腫瘤新抗原疫苗仍然缺乏公認(rèn)的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)抗腫瘤的免疫和獲益情況。Martin等[46]從小鼠卵巢癌中初步發(fā)現(xiàn)，低突變頻率可能與新抗原藥疫苗療效差有關(guān)。Sahin等[19]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)β2微球蛋白的表達(dá)豐度可成為預(yù)測(cè)疫苗療效的一項(xiàng)潛在生物標(biāo)志物。但這些生物標(biāo)志物需要更多的臨床證據(jù)加以證實(shí)。

隨著腫瘤細(xì)胞被免疫細(xì)胞殺滅，腫瘤微環(huán)境中釋放出更多的腫瘤抗原，從而引發(fā)更廣泛的免疫反應(yīng)，并促進(jìn)免疫系統(tǒng)進(jìn)化到針對(duì)不同抗原的多個(gè)克隆群體表達(dá)，這種現(xiàn)象被稱為“抗原播散”[51-54]。Bollard等[54]發(fā)現(xiàn)抗原播散可以促進(jìn)MAGE疫苗對(duì)黑色素瘤轉(zhuǎn)移瘤的抑制作用，提示抗原播散對(duì)新抗原疫苗的抗腫瘤作用也會(huì)有促進(jìn)作用。IFN-γ可以促進(jìn)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解，放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷也可導(dǎo)致抗原的釋放，腫瘤新抗原疫苗或許可以通過(guò)聯(lián)合這些治療手段增加療效。此外，結(jié)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如CTLA-4單抗、PD-1單抗和PD-L1單抗，也是一種增強(qiáng)腫瘤新抗原疫苗療效的有效策略。前期臨床研究顯示，新抗原疫苗治療后復(fù)發(fā)的患者接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑后仍可獲得完全緩解[31]，且二者聯(lián)合治療也表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果[19，39]。一方面，檢查點(diǎn)抑制劑有助于恢復(fù)T細(xì)胞功能，解除腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)。另一方面，腫瘤新抗原負(fù)荷與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床效果之間的相關(guān)分析表明，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗腫瘤作用至少部分歸因于新抗原特異性T細(xì)胞[16,55-57]。二者結(jié)合不僅可以促進(jìn)對(duì)疫苗相關(guān)的主要新抗原的反應(yīng)，還可以增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)次要新抗原的反應(yīng)。

目前報(bào)道的腫瘤新抗原疫苗主要包括SLP、RNA和DC疫苗，DNA疫苗尚未有臨床研究報(bào)道，但是有研究報(bào)道構(gòu)建表達(dá)新抗原的噬菌體，可誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)[58]，這也成為除電穿孔技術(shù)外DNA新抗原疫苗的另一有前景的方法。腫瘤免疫治療的DNA疫苗主要用于提供一種或幾種編碼腫瘤抗原的基因，從而引起或增加抗原特異性免疫反應(yīng)。DNA疫苗擁有易于構(gòu)建和儲(chǔ)存、穩(wěn)定、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，同樣具有研究和應(yīng)用價(jià)值。

大部分新抗原及相關(guān)疫苗還處在研究和臨床前實(shí)驗(yàn)階段，還有許多問題需要解決、優(yōu)化和完善。例如，在慢性感染期間，疫苗通常無(wú)法引起T細(xì)胞的擴(kuò)增[59]，針對(duì)乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)核心蛋白的多肽疫苗能夠使未感染HBV患者的HBV特異性反應(yīng)增加30倍以上,但只能誘導(dǎo)HBV感染患者的HBV特異性反應(yīng)增加3倍[60]。腫瘤發(fā)生時(shí)，機(jī)體已經(jīng)存在了對(duì)新抗原的慢性接觸，疫苗可能很難引起強(qiáng)烈的抗原特異性反應(yīng)。但是目前多項(xiàng)研究已顯示新抗原疫苗可引起免疫系統(tǒng)強(qiáng)烈的特異性反應(yīng)，起到抗腫瘤作用，其與慢性感染具體機(jī)制的差異尚待進(jìn)一步研究[19，31，49]。

總之，腫瘤新抗原的鑒定和新抗原疫苗的開發(fā)可為臨床免疫治療提供更多的選擇。新抗原疫苗與其他免疫治療(如CAR-T或PD-1單抗)、化療或放療聯(lián)合治療可能成為今后治療惡性腫瘤的有效方式之一。但這個(gè)領(lǐng)域常處于研究階段，還有許多基礎(chǔ)理論和應(yīng)用瓶頸需要解決。