張彬彬 王玖

摘要：以大鼠肝細胞為研究對象，研究乙草胺對大鼠肝細胞G蛋白偶聯(lián)受體介導胞漿鈣振蕩的調(diào)控。結(jié)果表明，單獨乙草胺刺激不引發(fā)胞漿鈣離子振蕩，乙草胺和PE同時作用對腎上腺素能受體有抑制作用且具有明顯的量效反應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：乙草胺;腎上腺素能受體;鈣振蕩;肝細胞

中圖分類號：Q2;S482? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）16-0104-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.023? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： The effects of different concentrations of acetochlor on the regulation of cytosolic calcium oscillation induced by G protein-coupled receptors in rat hepatocytes was investigated. The results showed that acetochlor and PE could inhibit PE receptors which the effect of acetochlor on it were dose-dependent， and acetochlor alone had no effect on PE receptors.

Key words： acetochlor;adrenergic receptor;calcium oscillations;hepatocytes

乙草胺（Acetochlor）是酰胺類中最具代表性的使用最多的3種除草劑之一[1]。乙草胺原藥在中國的使用量已超過1×107 kg[2]。乙草胺通過滲透作用或雨水徑流進入地下水和地表水，經(jīng)富集作用，對水生生物或其他生物及人體的生理功能造成一定的損害。楊曉梅等[3]報道乙草胺對中華大蟾蜍早期胚胎發(fā)育具有明顯的致畸致死效應(yīng)。謝志浩等[4]發(fā)現(xiàn)乙草胺對泥鰍血紅細胞微核及核異常的誘導率顯著提高。生物肝細胞是最重要的排毒器官，其多種生理功能受到細胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)控，受體活性除受到其特異性配體的調(diào)控外，還受其周圍微環(huán)境的影響。肝細胞多種生理功能受到細胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體（如α1腎上腺素能受體[5]、V1a血管加壓素受體[6]、P2Y嘌呤能受體[7]）的調(diào)控[8]。Ca2+是細胞內(nèi)普遍存在的第二信使，介導了細胞許多生命活動，如細胞收縮、分泌、運動等。大鼠肝細胞為非興奮性細胞，Woods等[9]最先觀察到苯腎上腺素（Phenylephrine，PE）誘導鼠肝細胞鈣振蕩，作用于肝細胞表面的α1腎上腺素能受體而調(diào)控肝細胞多種生理功能，其功能也受到胞漿鈣的調(diào)控。而乙草胺對肝細胞的鈣離子振蕩影響機制目前尚未開展工作。因此，本試驗旨在研究乙草胺對細胞鈣離子振蕩的影響機制，為進一步闡明乙草胺作用的分子機制提供試驗依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗動物? 大鼠：Sprague-Dawley雄性大鼠（200～400 g），購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院動物房。

1.1.2? 試劑? 乙草胺購于Sigma公司;PE購于Sigma-Aldrich公司。

1.2? 方法

1.2.1? 大鼠肝細胞懸液的制備? 參照Cui等[10]的方法，制備大鼠肝細胞懸液。每個灌流槽中加入10 μmol/L Fura-2-AM負載好的1 mL肝細胞懸液和1 mL標準液，靜置30 min黏附。在正置熒光顯微鏡下，選擇飽滿、脂膜完整、胞核清晰的細胞進行圈定并測定。

1.2.2? 乙草胺對大鼠肝細胞PE引發(fā)的胞漿鈣離子振蕩的調(diào)控? 用340 nm和380 nm激發(fā)光交替照射細胞，在510 nm檢測發(fā)射光，F(xiàn)340 nm/F380 nm比值反映胞漿鈣濃度變化。PE在大鼠肝細胞可誘導胞漿鈣離子濃度的鈣振蕩性增加，引發(fā)鈣振蕩的PE濃度為1 μmol/L[11]。經(jīng)多次預試驗，確定乙草胺未引起大鼠肝細胞胞漿鈣振蕩發(fā)生變化的最高濃度和最高肝細胞全不死的濃度分別為0.1、10 μmol/L。以此濃度范圍為標準，按等比數(shù)列設(shè)計3個濃度組（0.1、1、10 μmol/L乙草胺），另設(shè)一對照組（1 μmol/L PE），每組均至少做3次重復。試驗先用PE刺激15 min，中間用乙草胺作用15 min，然后再用PE刺激15 min?；蛘哌B續(xù)用PE刺激45 min，中間加入乙草胺作用15 min，從而檢測乙草胺對PE刺激作用的影響。所得數(shù)據(jù)用SigmaPlot軟件作圖，以時間為橫坐標，以熒光比值F340 nm/F380 nm為縱坐標。數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，并采用t檢驗，P<0.05為差異顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 乙草胺單獨刺激對胞漿鈣振蕩的影響

由圖1可知，PE刺激大鼠肝細胞后，第一次Ca2+振蕩波峰出現(xiàn)，清洗35 min后，再進行PE刺激，第二次Ca2+振蕩波峰出現(xiàn)。細胞是正常的，并且其受PE刺激后可引發(fā)[Ca2+]振蕩樣升高。細胞用胞漿Ca2+探針Fura-2AM負載，激活劑用灌流的方法引入細胞。其中，PE為1 μmol/L，加入時間為灌流5 min→PE刺激15 min→清洗35 min→PE刺激15 min→灌流5 min。

圖2為灌流5 min→PE刺激15 min→清洗10 min→乙草胺刺激15 min→清洗10 min→PE刺激15 min→灌流5 min。其中，乙草胺刺激濃度分別為0.1、1、10 μmol/L。結(jié)果表明，當PE刺激被清洗掉后，乙草胺不能引發(fā)大鼠肝細胞鈣振蕩。

2.2? 乙草胺和PE同時作用對PE引發(fā)的胞漿鈣振蕩的影響

圖3為灌流5 min→PE刺激45 min→灌流5 min。結(jié)果表明，PE刺激期間，可持續(xù)引起Ca2+振蕩。圖4為PE單獨刺激15 min后，在繼續(xù)PE刺激的同時，分別加入0.100、1、10 μmol/L的乙草胺，兩者共同作用細胞時間為15 min，然后再PE刺激15 min，最后灌流5 min。結(jié)果表明，當乙草胺濃度為0.1 μmol/L時，由PE引發(fā)的胞漿Ca2+振蕩變化不大;當乙草胺濃度為1 μmol/L時，由PE引發(fā)的胞漿Ca2+振蕩明顯受到抑制;當乙草胺濃度為10 μmol/L時，由PE引發(fā)的胞漿Ca2+振蕩完全受到阻斷。

乙草胺濃度為0.1 μmol/L時，乙草胺給藥時和給藥前后比較，對PE引起的鈣振蕩影響不大。乙草胺的濃度增加到1 μmol/L時，鈣振蕩影響比較明顯，由給藥前PE在15 min引起鈣峰頻率為9次，減少到PE和乙草胺同時刺激15 min時的3次以及乙草胺給藥后PE單獨刺激的5次。繼續(xù)增加乙草胺濃度到10 μmol/L時，由PE引起的鈣峰完全被抑制。

3? 小結(jié)與討論

乙草胺本身不能引起鈣峰的出現(xiàn)，乙草胺不能對未被PE激活的腎上腺素能受體起作用或者其不能結(jié)合到未激活的腎上腺素能受體上;但當乙草胺的濃度從0.1 μmol/L增加到1和10 μmol/L時，乙草胺給藥前和給藥后對PE引起的鈣振蕩抑制顯著，說明乙草胺可能引起大鼠肝細胞膜上PE受體數(shù)目減少，也或者乙草胺使得部分受體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而減少了PE與PE受體的結(jié)合而導致鈣峰減少。當乙草胺和PE同時作用于大鼠肝細胞時，乙草胺對大鼠肝細胞的胞漿鈣振蕩調(diào)控具有抑制影響，尤其是乙草胺的濃度增加到1 μmol/L及以上時，這種抑制作用更加顯著。本研究揭示了乙草胺對生物細胞生理功能影響的作用可能是由于對受體——激活劑親和力的影響而介導的，推測可能是乙草胺結(jié)合到已激活的腎上腺素能受體上起作用，也或者是乙草胺阻斷了PE與腎上腺素能受體的結(jié)合。

綜上所述，乙草胺抑制PE介導的大鼠肝細胞胞漿鈣振蕩，初步探索了乙草胺對肝細胞作用的分子機制，乙草胺對生物細胞生理功能的影響和更深層次的作用機制有待于進一步的探討。

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