馮 珺 周 峰 周紅琴 蔡鑫君 王 增

去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是一種無(wú)色結(jié)晶性粉末，易溶于水，是新型抗癌藥物，用于治療原發(fā)性肝癌、骨髓瘤、消化道腫瘤等，療效顯著，還具有保護(hù)肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、升高白細(xì)胞的功能[1-4]。然而，該藥具有一定的臟器毒性，從而限制了NCTD 在臨床上的應(yīng)用[5]。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇為膜材構(gòu)成的微型泡囊體，作為藥物載體在惡性腫瘤的靶向給藥治療方面極具潛力。脂質(zhì)體可通過(guò)藥物與細(xì)胞的相互作用，顯著提高藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制和殺傷作用。本研究以磷脂和膽固醇為主要材料制備去甲斑蝥素脂質(zhì)體，并采用高效液相（HPLC）法建立去甲斑蝥素脂質(zhì)體的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（1260Ⅱ型，Agilent 公司）；色譜柱（Agilent C18：150mm×4.6mm，4μm；安捷倫科技有限公司）；電子天平（CP225D 型，北京賽多利斯儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-250DB 型，昆山市超聲儀器有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（SCIENTZ-Ⅱ型，寧波新芝生物科技股份有限公司）；去甲斑蝥素原料藥（湖北省武漢東康源科技有限公司，批號(hào)20161101，純度≥98%）；去甲斑蝥素脂質(zhì)體（自制，批號(hào)201708）；去甲斑蝥素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

2 脂質(zhì)體的制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)采用薄膜分散法制備去甲斑蝥素脂質(zhì)體[6]。按質(zhì)量比2：1 稱取一定量的磷脂和膽固醇置于燒杯中，加入適量氯仿，超聲溶解。將混合溶液置于圓底燒瓶中，在37℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，待混合溶液在燒瓶壁上成膜后，加入pH6.8 含去甲斑蝥素的磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)水合20min，將上述混合液繼續(xù)磁力攪拌20min，再用探頭短時(shí)超聲（功率：270W；間歇超聲：1s/1s）5min，即得脂質(zhì)體。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18 （150mm×4.6mm，4μm）；流動(dòng)相：乙腈-pH3.1 磷酸水溶液（10∶90）；流速0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量20μL。

3.2 溶液制備 對(duì)照品溶液制備：精密稱取去甲斑蝥素對(duì)照品約10mg，置于10mL 容量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度定容。樣品溶液制備：制備含藥脂質(zhì)體，并加入適量流動(dòng)相超聲破乳后，再加入流動(dòng)相稀釋定容至刻度，過(guò)膜，即得。空白溶液制備：按照樣品溶液的制備方法，但不加入去甲斑蝥素，即得。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別取去甲斑蝥素對(duì)照品溶液、去甲斑蝥素脂質(zhì)體溶液及空白脂質(zhì)體溶液適量，以“3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣操作，記錄色譜圖。結(jié)果顯示去甲斑蝥素脂質(zhì)體溶液主峰的保留時(shí)間（4.4min 左右）與對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一直，表明去甲斑蝥素脂質(zhì)體的輔料對(duì)去甲斑蝥素測(cè)定無(wú)影響，方法專屬性良好。見(jiàn)圖1。

3.3.2 線性與范圍 精密量取去甲斑蝥素對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋成濃度分別為：9.18，45.90，91.80，137.70，183.60，459.00μg/mL 的 去甲斑蝥素對(duì)照品溶液。照上述條件操作，以去甲斑蝥素濃度（C）對(duì)吸收峰面積（A）做回歸方程，得到回歸方程為：A=1.5373C-5.0423，r=0.999，結(jié)果表明在9.18～459.00μg/mL 范圍內(nèi)去甲斑蝥素濃度與峰面積具有較好的線性關(guān)系。

3.3.3 精密度試驗(yàn) 精密移取去甲斑蝥素對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，配制成濃度分別為459、91.8、9.18μg/mL 的去甲斑蝥素溶液，按上述方法測(cè)定，每個(gè)濃度日內(nèi)測(cè)定3 次，計(jì)算日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），分別為0.13%、0.54%、0.65%。由結(jié)果可知，精密度均符合方法學(xué)要求。

圖1 去甲斑蝥素色譜圖

3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批制備的去甲斑蝥素脂質(zhì)體6 份，依“3.2”項(xiàng)下方法處理樣品，照“3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積，去甲斑蝥素濃度RSD=1.52%（n=6）

3.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取空白脂質(zhì)體1mL置于10mL 容量瓶中，加入去甲斑蝥素對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、0.3、0.1mL，各3 份，加入適量流動(dòng)相超聲破乳后，再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，過(guò)0.22μm 微孔濾膜，即得供試溶液。照“3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算去甲斑蝥素濃度，與實(shí)際去甲斑蝥素濃度相比得到加樣回收率，所得到的平均加樣回收率在98.87%～100.31%，各組的RSD 滿足含量測(cè)定要求，見(jiàn)表1。

表1 去甲斑蝥素脂質(zhì)體的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.4 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定 按前期課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)和參考文獻(xiàn)測(cè)定脂質(zhì)體包封率[7]，精密量取1mL 去甲斑蝥素脂質(zhì)體適量置于10mL 容量瓶中，加入適量流動(dòng)相超聲破乳后，再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，混勻后過(guò)0.22μm 的濾膜，按上述色譜條件進(jìn)樣，檢測(cè)去甲斑蝥素峰面積，代入回歸方程，計(jì)算去甲斑蝥素總量（C 總）；精密取去甲斑蝥素脂質(zhì)體適量置于離心管中，高速離心（15000r/min）30min，取上清液1mL 置于10mL 容量瓶中，再用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，混勻后過(guò)0.22μm 的濾膜，按上述色譜條件進(jìn)樣，檢測(cè)去甲斑蝥素峰面積，代入回歸方程，計(jì)算游離的去甲斑蝥素（C 游），包封率=（C 總-C 游）/C 總×100%。計(jì)算得到去甲斑蝥素脂質(zhì)體的包封率為25.53%。

4 討 論

去甲斑蝥素是從斑蝥中提取并人工合成的一種新型抗癌藥物。雖然毒性比其他斑蝥素低，但還是具有一定的毒性，并且在水中的溶解度較差，生物利用度也較低。因此，為了更好地發(fā)揮去甲斑蝥素的抗腫瘤活性，本研究將去甲斑蝥素制備成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體作為一種藥物載體，具有靶向性、長(zhǎng)效性，能降低藥物毒性、提高藥物的穩(wěn)定性。去甲斑蝥素脂質(zhì)體可以使藥物劑量減少，毒性降低，腎毒性降低。

脂質(zhì)體的制備方法有注入法、薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法和冷凍干燥法等。本研究中的脂質(zhì)體采用薄膜分散法制備，制備工藝簡(jiǎn)單，易于操作。本研究脂質(zhì)體中包封率測(cè)定采用離心法，利用游離藥物與含藥脂質(zhì)體的重力差異進(jìn)行分離，計(jì)算包封率。但離心法需要將脂質(zhì)體長(zhǎng)時(shí)間暴露于高速離心機(jī)中，離心力會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體中藥物的滲漏，因此藥物的包封率不高。另外脂質(zhì)體溶解度大，其形成時(shí)內(nèi)外水相中的藥物可迅速達(dá)到平衡，導(dǎo)致包封率偏低。

包封率是脂質(zhì)體研究的主要內(nèi)容，提高包封率一直是脂質(zhì)體研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著對(duì)脂質(zhì)體研究的深入，針對(duì)脂質(zhì)體包封率影響因素，研究人員設(shè)計(jì)出幾種提高包封率的方法，如前體藥物法，pH梯度法等具有很高的實(shí)用性[8-10]。因此，深入研究包載過(guò)程中藥物與脂質(zhì)體膜相互作用，將成為新的技術(shù)和方法的理論依據(jù)，促進(jìn)脂質(zhì)體作為藥物載體的開(kāi)發(fā)和使用。