林思思 袁拯忠

肺癌是常見(jiàn)癌癥，也是因癌癥死亡的主要原因[1]。肺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率30%～40%[2]，溶骨性轉(zhuǎn)移引起的骨痛、骨折、骨相關(guān)事件嚴(yán)重影響晚期肺癌患者生活質(zhì)量。筆者臨證發(fā)現(xiàn)自然銅、鹿銜草可以改善腫瘤患者骨轉(zhuǎn)移并發(fā)癥。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，自然銅、鹿銜草可以抑制肺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠模型的瘤體增長(zhǎng)，其可能機(jī)制與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)ICAM-1、MMP-9 及PTHrP 檢測(cè)，探索自然銅、鹿銜草在肺癌骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 4 周齡BALB/c 裸鼠16～22g，25 只雌鼠，25 只雄鼠，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（滬）2007—0005，分籠飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境中，恒溫、恒濕、隔音、靜電屏蔽、12h/12h 明暗光照環(huán)境下，光照度≈100lux，自主獲取滅菌普通飼料和飲水。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審核通過(guò)（批準(zhǔn)編號(hào)：wydw2011-0043）。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 選取人肺癌A549 細(xì)胞株，用含15%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基（pH7.0）在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞株由浙江省溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 藥 物 鹿銜草（批號(hào)1109001W）、自然銅（批號(hào)1110001W）免煎顆粒由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房購(gòu)買(mǎi)，由深圳三九現(xiàn)代中藥有限公司提供，每1g 免煎劑效量相當(dāng)于10g 生藥量效量。帕米磷酸二鈉注射液（規(guī)格：5mL∶15mg，批號(hào)S0263）由瑞士諾華制藥有限公司提供。0.9%生理鹽水（規(guī)格：500mL，批號(hào)11042702）由福建海王公司提供。本實(shí)驗(yàn)中藥品的溶解稀釋均以0.9%生理鹽水作為介質(zhì)。

1.4 試 劑 Evagreen 染料購(gòu)自上海BIO-RAD 公司（批號(hào)172-5200），反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas 公司（批號(hào)K1621）。山羊二步法檢測(cè)試劑盒（批號(hào)pv9003）、小鼠二步法檢測(cè)試劑盒（批號(hào)pv9002）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）抗體（批號(hào)SC-8439）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體（批號(hào)SC-8640）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）抗體（批號(hào)A01321）及小鼠/兔IgG 試劑盒（批號(hào)SA1020）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.5 引 物 相應(yīng)蛋白的DNA 序列通過(guò)搜索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，根據(jù)該序列使用primer3.0 設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，由上海Invitrogen 公司合成。用GAPDH 作為內(nèi)參。引物序列如下：ICAM-1 F：5'-GTCTGCTGAGACCCCTCTTG-3'，ICAM-1 R：5'-TTCACACTGAATGCCAGCTC-3'，MMP-9 F：5'-GTGGATAGCTCGGTGGTGTT-3'，MMP-9 R：5'-TGAATCAGCTGGCTTTTGTG-3'，PTHrP F：5' -CTCCTGTTCTCTGCGTTTCC -3'，PTHrP R：5' -CAGCCGAAATCAGAGCTACC -3'，GAPDH F：5' -CCAGCCGAGCCACATCGCTC -3'，GAPDH R：5' -ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3'。

1.6 儀 器 蛋白核酸分析儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司（型號(hào)：DV640）。梯度PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自日本TAKATRA 公司（型號(hào)：TP600）。定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)APPLIED BIOSYSTENS 公司（型號(hào)：7500）。離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf 公司產(chǎn)品（型號(hào)：5415D）。倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品（型號(hào)：DM 相差）。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)FORMA 公司（型號(hào)：3111）。電子分析天平購(gòu)自上海天平儀器廠產(chǎn)品（型號(hào)：JW2502）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造 模 1%戊巴比妥鈉按75mg/kg 麻醉裸鼠后，將裸鼠仰臥于操作臺(tái)，充分暴露其右下肢，以穿刺點(diǎn)為中心，用75%醫(yī)用酒精消毒3 次。待皮膚略干后，取19G 注射針頭連接裝有制備好的A549 單細(xì)胞懸液的注射器，從右脛骨上端皮膚處垂直進(jìn)針，將針頭固定于右脛骨骨性粗隆上，然后沿脛骨縱軸緩慢旋轉(zhuǎn)進(jìn)針，獲突破感后再緩慢進(jìn)針約2mm，確保針頭進(jìn)入骨髓腔后，注入0.1mL 制備好的A549 單細(xì)胞懸液，用消毒棉球按壓數(shù)秒。然后，將裸鼠分籠飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，恢復(fù)1 周后開(kāi)始給藥。

2.2 分組及給藥 實(shí)驗(yàn)鼠50 只按照隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，每組10 只，連續(xù)給藥3 周。（1）自然銅組：按6g/kg 隔天灌胃自然銅混懸液（約0.5mL），隔7 天腹腔注射0.16mL 生理鹽水；（2）鹿銜草組：按6g/kg隔天灌胃鹿銜草混懸液，隔7 天腹腔注射0.16mL 生理鹽水；（3）聯(lián)合給藥組：按6g/kg 隔天灌胃自然銅和鹿銜草混合溶液，隔7 天腹腔注射0.16mL 生理鹽水；（4）陽(yáng)性對(duì)照組：按10mg/kg 隔7 天腹腔注射帕米磷酸二鈉（約0.16mL），隔天灌胃0.5mL 生理鹽水；（5）模型對(duì)照組：隔天灌胃0.5mL 生理鹽水，隔7 天腹腔注射0.16mL 生理鹽水。

2.3 免疫組化法檢測(cè)ICAM-1、MMP-9 及PTHrP 蛋白表達(dá) 給藥結(jié)束后，以頸椎脫臼法處死裸鼠并剝離脛骨處腫瘤組織，每份標(biāo)本一分為二。一份用4%多聚甲醛溶液固定，制作成常規(guī)切片后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行免疫組化步驟檢測(cè)ICAM-1、MMP-9 及PTHrP 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果判斷：蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞胞漿中可出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用兩人雙盲法觀察切片，在200 倍鏡下每組隨機(jī)選取10 個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1000 個(gè)腫瘤細(xì)胞，然后計(jì)算每組陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)ICAM-1、MMP-9 及PTHrP 蛋白mRNA 表達(dá) 剩余組織在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)按步驟提取RNA 后，在梯度PCR 擴(kuò)增儀內(nèi)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，最后以cDNA 及設(shè)計(jì)的相應(yīng)引物為模板擴(kuò)增獲得ICAM-1、MMP-9 及PTHrP mRNA 相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)操作步驟及反應(yīng)體系均參考溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)[5]。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）方法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組ICAM-1、MMP-9 及PTHrP 蛋白表達(dá)水平比較 自然銅組、鹿銜草組及聯(lián)合給藥組ICAM-1與MMP-9 表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率較模型對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組均明顯減少（P 均<0.01）。聯(lián)合給藥組及陽(yáng)性對(duì)照組PTHrP 表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率較模型對(duì)照組減少（P<0.05，P<0.01），自然銅組、鹿銜草組PTHrP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率與模型對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。自然銅組、鹿銜草組及聯(lián)合給藥組PTHrP 表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率較陽(yáng)性對(duì)照組增多（P均<0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組ICAM-1、MMP-9 及PTHrP 蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較（%）

表1 各組ICAM-1、MMP-9 及PTHrP 蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較（%）

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.01；自然銅組：灌胃自然銅及腹腔注射0.9%生理鹽水；鹿銜草組：灌胃鹿銜草及腹腔注射0.9%生理鹽水；聯(lián)合給藥組：灌胃自然銅與鹿銜草及腹腔注射0.9%生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組：腹腔注射帕米膦酸二鈉及灌胃0.9%生理鹽水；模型對(duì)照組：灌胃及腹腔注射0.9%生理鹽水；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子-1；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；PTHrP：甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白

組別自然銅組鹿銜草組聯(lián)合給藥組陽(yáng)性對(duì)照組模型對(duì)照組鼠數(shù)10 10 10 10 10 ICAM-1 35.2±1.1**△33.6±4.0**△38.3±4.6**△57.9±2.3**90.2±0.7 MMP-9 59.2±0.7**△65.4±1.7**△67.7±1.7**△76.7±2.4**94.3±0.4 PTHrP 86.5±2.8△78.1±3.8△73.3±7.2*△50.2±4.7**85.9±3.6

3.2 各組ICAM-1、MMP-9 及PTHrP mRNA 表達(dá)水平比較 自然銅組、鹿銜草組及聯(lián)合給藥組ICAM-1、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平較模型對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組降低（P<0.05，P<0.01）。聯(lián)合給藥組、陽(yáng)性對(duì)照組PTHrP mRNA 表達(dá)水平較模型對(duì)照組降低（P<0.01），自然銅組、鹿銜草組及聯(lián)合給藥組PTHrP mRNA 表達(dá)水平較陽(yáng)性對(duì)照組升高（P<0.01），見(jiàn)表2。

表2 各組ICAM-1、MMP-9 及PTHrP mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（×10-2）

表2 各組ICAM-1、MMP-9 及PTHrP mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（×10-2）

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；自然銅組：灌胃自然銅及腹腔注射0.9%生理鹽水；鹿銜草組：灌胃鹿銜草及腹腔注射0.9%生理鹽水；聯(lián)合給藥組：灌胃自然銅與鹿銜草及腹腔注射0.9%生理鹽水；陽(yáng)性對(duì)照組：腹腔注射帕米膦酸二鈉及灌胃0.9%生理鹽水；模型對(duì)照組：灌胃及腹腔注射0.9%生理鹽水；ICAM-1：細(xì)胞間黏附分子-1；MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；PTHrP：甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白

組別自然銅組鹿銜草組聯(lián)合給藥組陽(yáng)性對(duì)照組模型對(duì)照組鼠數(shù)10 10 10 10 10 ICAM-1 10.0±0.5*△7.3±0.6*△△6.6±1.1*△△20.4±3.2*100.8±13.8 MMP-9 11.9±2.2*△△21.7±5.1*△△23.4±5.9*△△45.5±7.4*100.3±9.0 PTHrP 87.8±17.3△△103.1±23.6△△74.7±17.1*△△18.5±3.7*100.9±14.9

4 討 論

肺癌骨轉(zhuǎn)移的過(guò)程可以分為以下4 個(gè)階段：肺癌細(xì)胞的脫落與外侵、趨化與遷移、黏附及溶骨性骨破壞[6]。MMP-9 通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，在肺癌細(xì)胞的脫落與外侵過(guò)程中發(fā)揮作用[7]。此外，MMP-9 的高表達(dá)與新生血管的生成有關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，自然銅、鹿銜草及兩者合用均可以抑制腫瘤骨轉(zhuǎn)移組織MMP-9 蛋白表達(dá)水平及mRNA 表達(dá)量，從而減少新生血管的形成，降低肺癌細(xì)胞外侵的風(fēng)險(xiǎn)。ICAM-1 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的“歸巢”并“定居”骨髓，且ICAM-1 表達(dá)水平和腫瘤的分期呈正相關(guān)[9-10]。本研究中，自然銅、鹿銜草及兩者合用均能較好地抑制腫瘤表面ICAM-1 表達(dá)水平，從而抑制肺癌細(xì)胞的趨化與遷移以及肺癌細(xì)胞的黏附。癌細(xì)胞產(chǎn)生的PTHrP 對(duì)破骨細(xì)胞具有強(qiáng)力的趨化作用。癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移后，引起局部的高鈣水平，可以促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和PTHrP 的分泌，形成破骨性轉(zhuǎn)移的“惡性循環(huán)”，而且PTHrP 陽(yáng)性表達(dá)率越高，肺癌骨轉(zhuǎn)移就越容易發(fā)生[11-14]。本研究中，自然銅或者鹿銜草單用對(duì)PTHrP 的抑制作用不明顯，而自然銅、鹿銜草合用卻能夠明顯抑制腫瘤組織PTHrP 表達(dá)。提示自然銅、鹿銜草之間可能存在的協(xié)同促進(jìn)作用。但具體機(jī)制有待更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)探索。

綜上所述，自然銅、鹿銜草在肺癌骨轉(zhuǎn)移的脫落與外侵、趨化與遷移及黏附環(huán)節(jié)中具有較好的抑制作用。而在肺癌骨轉(zhuǎn)移的溶骨性破壞階段，單用自然銅、鹿銜草效果不理想，其聯(lián)合用藥可以發(fā)揮一定的抑制作用，這可能與藥物間相互協(xié)同作用相關(guān)。