王愛萍， 孫換平， 劉燕凱， 黃進勇， 陳玉梅，祁艷華， 李永欣， 張改平

(鄭州大學 生命科學學院 河南 鄭州 450001)

0 引言

卡那霉素是一種由土壤中鏈霉菌素產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，具有良好的水溶性和廣譜的抗菌性，它對多數(shù)腸桿菌科細菌均有良好的抗菌作用，通常作為抗菌藥物用于動物飼養(yǎng)，是我國畜牧業(yè)常用的獸藥之一.然而，氨基糖苷類抗生素具有耳毒性、腎毒性、以及神經(jīng)肌肉阻滯引起的心肌抑制、呼吸衰竭等毒副作用[1].動物體內(nèi)過量的卡那霉素殘留，通過食物鏈的富集，對人類健康具有潛在的威脅，因此，檢測食品中卡那霉素的殘留十分重要.目前檢測氨基糖苷類抗生素殘留常用的方法主要包括高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法[2]、免疫學檢測法[3]等.其中HPLC等色譜方法雖然靈敏度高，但對技術(shù)的要求較高，并且樣品處理比較復雜，測試成本高，不適合快速篩查大批量樣品[4].免疫學檢測法作為一種快速、特異和靈敏的檢測技術(shù)，被廣泛應用于小分子藥物殘留的檢測.在本研究中，我們制備了卡那霉素單克隆抗體，建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(indirect competitive rapid enzyme-linked immunosorbent assay, ciELISA)方法.

1 材料與方法

1.1 材料

3只6周齡的雌性BALB/c小鼠由本實驗室動物房飼養(yǎng)；卡那霉素(KAN)、碳二亞胺(EDC)購于Solarbio公司；弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant，F(xiàn)CA)、弗氏不完全佐劑(Freund incomplete adjuvant，F(xiàn)IA)購自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1EDC法合成完全抗原 將100 mg卡那霉素標準品與20 mg BSA或20 mg OVA溶到2 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中，此溶液稱為1號液，將25 mg EDC溶于1 mL PBS(50 mmol/L)中，此溶液稱為2號液.將1號液和2號液混合，在室溫下緩慢攪拌1 h，然后在4 ℃下攪拌3 d.將所得反應混合物用10 mmol/L PBS(3 L)透析3次并收集于1.5 mL試管中，該方法制備的偶聯(lián)物命名為KAN-BSA和KAN-OVA，放置于-20 ℃冰箱保存.采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定完全抗原濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果.

1.2.2動物免疫及雜交瘤細胞的篩選 將KAN-BSA作為免疫抗原，并對每只小鼠進行皮下注射50 μg/200 μL，使用KAN-OVA作為包被抗原，通過間接ELISA測定小鼠免疫血清效價，并選擇具有高效價的小鼠，將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)3輪亞克隆篩選陽性雜交瘤細胞株，具體實驗步驟參照文獻[5].

1.2.3單克隆抗體的大量制備及鑒定 將篩選到的雜交瘤細胞株轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，并用 RPMI1640/10 完全培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)擴大培養(yǎng)，當細胞達到對數(shù)增長狀態(tài)時，向石蠟致敏的經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔中注射每毫升 1×106個細胞，約10天后小鼠腹部腫脹，此時，收集腹水，離心收取上清液，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水[6]，用SDS-PAGE鑒定純化的單克隆抗體，并通過間接ELISA法測其效價與親和力.

1.2.4確定最適抗原包被量及單克隆抗體稀釋度 采用棋盤法連續(xù)倍比稀釋包被抗原KAN-OVA和卡那霉素單克隆抗體，抗原包被量分別為800、400、200、100、50 ng/孔，單克隆抗體稀釋倍數(shù)從1∶800開始2倍比稀釋至1∶204 800.

1.2.5間接競爭ELISA的建立及標準曲線的繪制 以KAN-OVA作為包被抗原，包被量為200 ng/孔，4 ℃孵育過夜；PBST洗6次，用封閉液37 ℃封閉2 h.PBST洗6次后分別將各質(zhì)量濃度標準品溶液(KAN：用雙蒸餾水配制卡那霉素標準品，用0.01 M PBS倍比稀釋到質(zhì)量濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125 ng/mL)與最適稀釋倍數(shù)的單克隆抗體等體積混合作為一抗，向各孔中加入100 μL混合液，同時設(shè)置陽性、陰性和空白對照組，二抗加入100 μL 1∶4 000稀釋的羊抗鼠IgG，TMB顯色8 min，2 mmol/L H2SO4終止反應，OD450 nm條件下測定OD值.

1.2.6間接競爭ELISA準確度分析 在同一批ELISA酶標板上進行6組競爭ELISA平行試驗，作批內(nèi)變異系數(shù)分析；同時，包被6批酶標板，分別各進行一次競爭ELISA檢測，做批間變異系數(shù)分析，研究不同標準品濃度測定結(jié)果的準確性.

1.2.7交叉反應率的確定 鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素B、新霉素、新霉胺以及慶大霉素屬于卡那霉素結(jié)構(gòu)類似物[7]，以相同的競爭ELISA方法測定這幾種藥物的IC50，根據(jù)式CR=IC50(KAN)/IC50(其他)×100%[8]計算單克隆抗體對于鏈霉素、妥布霉素、新霉素、慶大霉素等的交叉反應率.

1.2.8樣品加標回收率的測定 牛奶樣品處理方法：選取牛奶，向不含卡那霉素的牛奶樣品中添加卡那霉素標準品，12 000 r/min，4 ℃離心10 min后，除去上層脂肪層及沉淀物，用0.01 mol/L PBS將中間清液分別稀釋2、4、8倍，使不同稀釋倍數(shù)的牛奶中含卡那霉素終質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25 ng/mL.間接競爭ELISA方法用于檢測牛奶樣品中的卡那霉素，根據(jù)公式(實際檢測濃度/添加濃度×100%)，計算其回收率.用不同稀釋倍數(shù)的牛奶，分別測定20個不含卡那霉素牛奶樣品的平均值，根據(jù)其平均值加上3倍標準偏差再乘以樣品稀釋倍數(shù)，得到其最低檢測限.

2 結(jié)果與分析

2.1 KAN-BSA、KAN-OVA完全抗原的制備與鑒定

將制備得到的KAN-BSA和KAN-OVA完全抗原，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示.KAN-BSA和KAN-OVA比BSA和OVA有明顯的拖尾現(xiàn)象，表明KAN與BSA、OVA偶聯(lián)成功.采用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定KAN-BSA和KAN-OVA的質(zhì)量濃度分別為3.9 mg/mL、4 mg/mL.

2.2 小鼠免疫效果評價

間接ELISA測定小鼠免疫血清效價，結(jié)果顯示，3只小鼠均能產(chǎn)生特異性抗體，其中1號小鼠抗體效價為1/25 600(圖2)，所以選取1號小鼠取其脾臟做細胞融合用于制備抗KAN單克隆抗體.

2.3 抗KAN單克隆抗體的制備及純化

細胞融合后，經(jīng)3次亞克隆獲得1株陽性雜交瘤細胞株(1E1)，并通過體內(nèi)誘生法大量制備腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化獲得單克隆抗體，經(jīng)SDS-PAGE鑒定分析，結(jié)果如圖3所示，純化后1E1含有兩條特異性條帶，分子量大小分別為50 kD和25 kD，與IgG的重鏈和輕鏈大小相一致.

a1:BSA;a2:KAN-BSA;b1:OVA;b2:KAN-OVA圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定完全抗原Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of complete antigen

1：Marker；2: 1E1單克隆抗體純化前；3: 1E1單克隆抗體純化后圖3 1E1單克隆抗體純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of 1E1 mAb purification

2.4 1E1單克隆抗體的效價和親和力

間接ELISA測定單克隆抗體1E1純化前、后效價，結(jié)果顯示其效價均達到1∶819 200(圖4a)；根據(jù)親和常數(shù)計算公式可以得出1E1單克隆抗體的親和常數(shù)Ka為2.8×109L/mol(圖4b).

2.5 間接競爭ELISA的建立及標準曲線繪制

棋盤法確定抗原包被量及單克隆抗體稀釋度，以O(shè)D450 nm為1.0左右的組合為最佳模式.考慮到節(jié)約檢測原KAN-OVA，適量使用單克隆抗體原則，最后確定間接競爭ELISA最佳包被抗原KAN-OVA的包被量為200 ng/孔，最適單克隆抗體稀釋度為1∶51 200(表1).

圖4 a:1E1單克隆抗體效價的測定；b:1E1單克隆抗體親和常數(shù)分析Fig.4 a: Titer of 1E1 mAb; b: Affinity analysis of 1E1 mAb

包被量/(ng·孔-1)單克隆抗體稀釋倍數(shù)8001 6003 2006 40012 80025 60051 200102 400204 800 8003.3123.2853.0022.6242.2381.8611.3560.9310.664003.1333.1783.1712.4772.1661.6181.0870.7610.5512002.9752.8772.6212.5092.2081.6511.0090.8370.4971002.3642.2321.9991.7561.4721.2560.8670.5690.393501.9571.8001.6061.3081.2400.9570.6770.5220.331

圖5 單克隆抗體敏感性測定Fig.5 Sensitivity test of 1E1 mAb

2.6 間接競爭ELISA標準曲線

以添加卡那霉素質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制標準曲線(圖5)，擬合標準曲線后得到的線性方程為y=-24.403x+50.919(R2=0.989 8).以抑制率為50%時對應的質(zhì)量濃度為IC50，測得1E1的IC50值為1.09 ng/mL.

2.7 間接競爭ELISA方法的精確度分析

各標準品濃度批內(nèi)變異系數(shù)范圍是5.48%～8.72%，平均變異系數(shù)為6.52%.各標準品濃度批間變異系數(shù)范圍是6.86%～8.76%，平均變異系數(shù)為8.04%.這表明本實驗建立的間接競爭ELISA檢測方法具有高穩(wěn)定性.

表2 板內(nèi)與板間變異系數(shù)Tab.2 Coefficient of variation within and between plates

2.8 間接競爭ELISA方法的交叉反應率

分別選用鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素B、新霉素、新霉胺以及慶大霉素進行交叉反應性試驗，如表3所示，采用間接競爭ELISA法測得抗卡那霉素單克隆抗體對妥布霉素、卡那霉素B的交叉反應率分別為53.4%和45.6%，與其他氨基糖胺類化合物的交叉反應率低于0.01%.

表3 交叉反應試驗結(jié)果Tab.3 Cross-reaction test results

2.9 樣品加標回收率

不含卡那霉素的牛奶樣品中分別加入卡那霉素，使終質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25 ng/mL，測定樣品加標回收率，根據(jù)1.2.8的計算方法，結(jié)果如表4所示，當牛奶稀釋2倍時回收率范圍為42%～78%，最低檢測限為1.72 ng/mL；稀釋4倍時回收率范圍為64.4%～89.6%，最低檢測限為1.92 ng/mL；稀釋8倍時回收率范圍為53%～95.7%，最低檢測限為3.52 ng/mL.綜合分析上述結(jié)果，考慮到靈敏性及最低檢測限，稀釋4倍作為最適樣品稀釋倍數(shù).此時樣品加標回收率范圍為64.4%～89.6%，最低檢測限為1.92 ng/mL.

表4 ciELISA檢測牛奶樣品的添加回收試驗Tab.4 Recovery of milk samples by ciELISA

3 討論

卡那霉素為小分子半抗原，檢測困難，常規(guī)檢測方法復雜且價格高昂，需要昂貴的儀器設(shè)備及專業(yè)技術(shù)人員.卡那霉素結(jié)構(gòu)中不含有共軛雙鍵，無紫外吸收峰[9]，因此，不能采用紫外分光光度法對完全抗原進行鑒定.因為BSA和OVA的等電點在4.6～4.7之間，在瓊脂糖凝膠電泳緩沖溶液中帶負電，將其與KAN偶聯(lián)后其等電點會升高，從而導致其在電泳緩沖溶液中所帶負電荷減少，同樣條件下電泳速度減慢.所以本研究通過瓊脂糖凝膠電泳的方法對合成的完全抗原進行鑒定，結(jié)果顯示與載體蛋白相比，合成的完全抗原有明顯的滯后和拖尾現(xiàn)象，表明KAN與載體蛋白偶聯(lián)成功.

經(jīng)免疫BALB/c小鼠，選用經(jīng)典的雜交瘤細胞融合技術(shù)獲得一株穩(wěn)定分泌抗KAN單克隆抗體的單克隆雜交瘤細胞株，用小鼠體內(nèi)誘生腹水并經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化獲得單克隆抗體1E1，間接ELISA測其效價為1∶819 200，親和力常數(shù)為2.8×109L/moL.建立了基于單克隆抗體1E1的間接競爭ELISA檢測KAN的方法，結(jié)果顯示1E1與妥布霉素的交叉反應率為53.4%，與卡那霉素B的交叉反應率為45.6%，與其他氨基糖苷類化合物沒有交叉反應，該特性與CHEN等[10]制備的單克隆抗體情況類似.經(jīng)分析，卡那霉素B、妥布霉素與卡那霉素具有相似的C-環(huán)結(jié)構(gòu)，其他氨基糖苷類抗生素與卡那霉素的C-環(huán)結(jié)構(gòu)有明顯差異，所以與妥布霉素和卡那霉素B交叉反應性高，可能是因為它們具有相似的C-環(huán)結(jié)構(gòu).因此推測此單克隆抗體能夠與卡那霉素類的抗生素反應.

單克隆抗體在牛奶樣品稀釋4倍時最低檢測限為1.92 ng/mL，根據(jù)我國《食品安全國家標準動物性食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定，卡那霉素最大殘留限量為肌肉100 μg/kg、奶150 μg/kg、肝臟600 μg/kg.本研究最低檢測限1.92 ng/mL，可完全滿足檢測限量要求.該方法具有準確、敏感、快速、操作簡便且費用低廉的優(yōu)點，為卡那霉素殘留的快速檢測提供了有效檢測方法，保障了畜產(chǎn)品的安全.