王 涵，張 珊，薛士鵬，宋國英，于瑞雪，劉慶春，王中曉，張慶遠(yuǎn)，劉 麗，李冰潔，夏西超,

(1.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南南陽 473061；2.平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南平頂山476000)

熱休克蛋白(HSP)是一個超基因家族，在調(diào)節(jié)機體應(yīng)激反應(yīng)和耐受性方面發(fā)揮重要作用[1,2]。在正常和應(yīng)激條件下，HSP幫助蛋白質(zhì)折疊、膜轉(zhuǎn)位、錯誤折疊蛋白質(zhì)降解等方面具有積極作用[3,4]。根據(jù)其分子量不同，HSP可以分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP20等5個家族。HSP60是最為保守且研究相對廣泛的家族之一，當(dāng)生物細(xì)胞或個體受到物理、 化學(xué)、重金屬、有機污染物、病原物等因素脅迫時，HSP60 參與熱激反應(yīng)中的蛋白質(zhì)合成、線粒體DNA代謝、細(xì)胞內(nèi)多肽折疊、受損線粒體蛋白運輸?shù)戎匾磉^程，以自發(fā)減少機體損傷[5,6]。多溴聯(lián)苯醚(PBDE)是常見淡水持久性有機污染物，具有持久性和高生物蓄積的特點，已經(jīng)引起學(xué)者的極大關(guān)注[7]。PBDE-47是水體中最豐富的有機污染物，其生物毒性顯著強于其他溴化化合物[8]。前期研究表明，PBDE-47處理可能導(dǎo)致淡水背角無齒蚌(Anodontawoodiana)機體應(yīng)激反應(yīng)和急性毒性效應(yīng)，具體機制有待進一步探究[8]。在本研究中，從背角無齒蚌中克隆出AwHSP60完整基因序列，通過real-time PCR分析AwHSP60表達，為揭示PBDE-47毒性效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 背角無齒蚌處理

實驗用背角無齒蚌購自南陽市水產(chǎn)市場(殼長6.5±0.5 cm)，實驗室自動水循環(huán)系統(tǒng)中養(yǎng)殖2周。PBDE-47購自Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，溶解于二甲亞砜(DMSO)中以制備儲備液。動物處理實驗在長方形塑料盒(40 cm×25 cm；10 cm 高)中進行，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[8]。將來自同一塑料盒5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織，并迅速放入液氮保存，用于RNA提取。用同樣的方法，將80只河蚌隨機飼養(yǎng)于10個塑料盒中，8只/盒，分為對照組和PBDE-47處理組，每組5個盒子。PBDE-47 處理組采用3.36 μg/L的PBDE-47進行處理，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。第0、1、3、6、9、12 和 15 d從每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

總RNA提取采用TRIzol試劑(寶生物生物有限公司，大連)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，具有完整mRNA條帶的RNA用于合成cDNA，M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應(yīng)模板[8]。

1.3 背角無齒蚌AwHSP60核心片段的擴增

簡并引物AwHSP61和AwHSP62分離AwHSP60 cDNA保守區(qū)域片段，反應(yīng)條件：94℃ 4 min，1cycle;94℃ 40s，48℃ 40s，72℃ 50s，32cycles；72℃ 10min，1cycle。PCR產(chǎn)物連接至pMDT-19載體，雙向測序、NBCI比對確定為HSP60核心片段。確定HSP60部分cDNA序列后，根據(jù)部分cDNA序列設(shè)計的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，5′Race Outerprimer和AwHSP60-5-1進行第一次擴增，以反應(yīng)產(chǎn)物為模板，反應(yīng)條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 50s，20 cycles；72℃ 10min，1cycle。5′Race Innerprimer和AwHSP60-5-2進行第二次擴增，反應(yīng)條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min，1cycle。3′Race Outerprimer和AwHSP60-3-1進行第一次擴增，以反應(yīng)產(chǎn)物為模板，反應(yīng)條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 50s，20cycles；72℃ 10min，1cycle。3′Race Innerprimer和AwHSP60-3-2進行第二次擴增，反應(yīng)條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min，1cycle。擴增AwHSP60 cDNA5′和3′區(qū)域序列進行雙向測序，5′RACE和3′RACE的PCR產(chǎn)物用DNAMAN軟件進行拼接。

1.4 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

分析AwHSP60序列，通過GenBank 數(shù)據(jù)庫搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行BLAST程序比對；根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 預(yù)測信號肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用DANMEN分析程序?qū)wHSP60基因進行多序列比對；通過Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測；AwHSP60的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)；使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 PCR擴增引物序列Tab.1 PCR amplified primer sequences

1.5 AwHSP60 mRNA水平定量檢測

為了確定AwHSP60轉(zhuǎn)錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進行定量分析。β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)AwHSP60-F和AwHSP60-R引物常用PCR儀中分離靶基因(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測出一個條帶，PCR產(chǎn)物測序，序列鑒別。使用ABI7500實時檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)進行real-time PCR，20 μL體系中包括：SYRB Premix ExTaqTM(TaKaRa)10 μL，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye(TaKaRa)0.4μL，dH2O 6.8μL。反應(yīng)條件：95℃ 30s， 1cycle;95℃ 5s，60℃ 34s， 40cycles，通過2-△△CT分析AwHSP60表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，AwHSP60 基因表達水平以±s表示，假設(shè)檢驗采用單因素方差分析(ANOVA)，組間多重比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 背角無齒蚌AwHSP60基因cDNA序列和預(yù)測蛋白質(zhì)序列分析

AwHSP60 cDNA序列由1 940 bp核苷酸序列組成，包含一個69 bp的5′-端非編碼區(qū)、167 bp的3′-端非編碼區(qū)和一個1 704 bp的開放閱讀框。開放閱讀框由一個568個氨基酸組成的多肽，分子量為61.03 kDa，等電點為5.91(圖1)。終止信號(AATAAA)位于3′-端非編碼區(qū)的2 000-2 005位點位置(圖1)。AwHSP60氨基酸序列包線粒體定位靶序列(1-MYRLPSILRPVLTRHLAPCLSRAY-24)、HSP60 家族標(biāo)簽序列(428-AAVEEGIVPGGG-439)、三個ATP/ADP 結(jié)合位點(52-TMGPKG-57，74-DG VTVAKGI-8，193-RDGVITVKDGKTLHDELEV-210)、Mg2+結(jié)合位點(107-AGDGTTAATVL-117)，3′末端典型GGM重復(fù)基序和負(fù)責(zé)從中間結(jié)構(gòu)域到頂部轉(zhuǎn)位區(qū)(213-EGMKFDRGYISPYFINTQKG-232)等HSP60家族多個保守結(jié)構(gòu)域(圖 1)。

2.2 背角無齒蚌AwHSP60 的進化關(guān)系

BLAST結(jié)果表明，AwHSP60氨基酸序列與其他HSP60家族成員親緣關(guān)系較近，AwHSP60氨基酸序列與淡水三角帆蚌、光滑雙臍螺和加州海兔同源性分別為97.71%、80.21%和76.95%。此外，AwHSP60氨基酸序列與模式生物之間也存在高度同源性，與人、小鼠、斑馬魚和果蠅同源性分別為75.74%、76.27%、73.91%和71.18%。從脊椎動物和無脊椎物種選擇不同 HSP60家族成員，通過MEGA5.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析AwHSP60的進化關(guān)系。AwHSP60進化上與雙殼類和腹足綱動物親緣關(guān)系最近，魚類和哺乳動物次之，甲殼動物較遠(yuǎn)，細(xì)菌親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖2)。

圖1 背角無齒蚌AwHSP60基因的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequences of A.woodiana AwHSP60 gene and deduced amino acid sequences□:HSP60基因標(biāo)簽序列，—：ATP/ADP 結(jié)合位點，：線粒體定位序列，……:Mg2+ 結(jié)合位點，*:終止密碼子，：poly A信號序列

2.3 背角無齒蚌AwHSP60組織分布

Real-timePCR結(jié)果顯示，AwHSP60廣泛表達于背角無齒蚌的斧足、鰓、心臟、肝胰臟、血淋巴、閉殼肌和外套膜(圖3)。AwHSP60 mRNA在肝胰臟和鰓中表達水平最高，血淋巴、外套膜和心臟表達水平次之，斧足和閉殼肌中表達水平最低(圖 3)。

2.4 PBDE-47 對背角無齒蚌AwHSP60 表達的影響

正常情況下，AwHSP60在動物肝胰臟、鰓和血淋巴穩(wěn)定表達，PBDE-47處理組后 AwHSP60表達受到顯著影響。在第1 d至15 d，PBDE-47處理后肝胰臟中AwHSP60 mRNA水平隨時間顯著上調(diào)(圖4)；與對照組相比，AwHSP60 mRNA水平在第1d增加了89.9%；第15天，AwHSP60 mRNA水平增加了6.73倍(圖4)。與對照組相比，PBDE-47處理后鰓中AwHSP60 mRNA水平在第1天至15天增加了2.09 倍(P<0.01)(圖 5)。與對照組相比，PBDE-47處理后血淋巴中 AwHSP60 mRNA水平增加了2.13倍(P<0.05)(圖 6)。

圖2 根據(jù)背角無齒蚌AwHSP60氨基酸序列使用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by adjacency method which according to the A.woodiana AwHSP60 amino acid sequences

圖3 背角無齒蚌AwHSP60基因的空間表達Fig.3 The spatial expression of A.woodiana AwHSP60 gene每組數(shù)據(jù)來源于3只動物，重復(fù)3次

3 討論

背角無齒蚌屬于淡水底棲生物，以水體的懸浮物質(zhì)為食物進行濾食生活，是水體污染重要評價生物之一。本研究中，通過分析背角無齒蚌肝胰臟、鰓和血細(xì)胞中AwHSP60基因的轉(zhuǎn)錄水平，探討暴露PBDE-47毒性作用機制 。

圖4 PBDE-47對背角無齒蚌肝胰腺AwHSP60基因表達的影響Fig.4 The effection of PBDE-47 on A.woodiana hepatopancreas AwHSP60 gene expressionn=5；“*”“**”表示與相應(yīng)對照組相比有顯著或極顯著差異(P<0.05，P<0.01),圖5,6同

AwHSP60 有一個連續(xù)性開放閱讀框，包括ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)換區(qū)域和保守結(jié)構(gòu)域。對于多數(shù)基因而言，蛋白序列通常與無脊椎動物、植物和細(xì)菌存在較高的相似性[9,10]。AwHSP60蛋白序列與軟體動物、脊椎動物、甲殼動物和昆蟲具有高度同源性，其蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為29.23(<40)，提示AwHSP60具有高度穩(wěn)定性，并排除來自原核生物的可能性。AwHSP60中有一個高度保守的線粒體靶定位序列，提示AwHSP60可能是一個線粒體分子伴侶[11,12]。在 C 末端區(qū)域，AwHSP60有一個GGM重復(fù)序列，該結(jié)構(gòu)能夠提供疏水作用表面，在促進折疊中間體重排過程中發(fā)揮積極作用[13,14]?；贏wHSP60與 HSP60家族成員之間存在高度保守相似性，AwHSP60可能在應(yīng)激環(huán)境條件下新生蛋白質(zhì)折疊過程中發(fā)揮作用。序列比對和系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，從軟體動物到昆蟲，到脊椎動物，HSP60結(jié)構(gòu)和進化譜系高度保守。背角無齒蚌和三角帆蚌HSP60基因存在更為親近進化關(guān)系，提示這兩個物種來自同一祖先。AwHSP60進化上與雙殼類和腹足綱動物親緣關(guān)系最近，魚類和哺乳動物次之，甲殼動物較遠(yuǎn)，細(xì)菌親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，提示雙殼類和腹足綱動物從無脊椎動物分離出來后形成了一個新的分支。背角無齒蚌AwHSP60 mRNA水平具有廣泛的分布模式，這種分布模式與AwHSP60參與的環(huán)境適應(yīng)性和耐受性相關(guān)。肝胰臟是軟體動物主要消化、吸收和分泌器官，對環(huán)境變化特別敏感[15]。鰓是環(huán)境中污染物進入機體主要入口，并能與其直接接觸[16]。雙殼類循環(huán)系統(tǒng)是一個血液和淋巴液混合在一起的開放式循環(huán)系統(tǒng)，血淋巴在淋巴管、血竇和全身軟組織中流通。黏膜組織的血淋巴填盈充足，這些器官與周圍環(huán)境進行氧氣的交換或營養(yǎng)素提取有關(guān)。血淋巴是應(yīng)對環(huán)境應(yīng)激一個重要防線[16]。肝胰臟、鰓和血細(xì)胞在維護動物穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，也是環(huán)境因素作用的靶點[16]。由此可見，肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP60高表達與背角無齒蚌應(yīng)對環(huán)境的耐受性密切相關(guān)。

圖5 PBDE-47對背角無齒蚌腮AwHSP60基因表達的影響Fig.5 The effect of PBDE-47 on A.woodiana gill AwHSP60 gene expression

圖6 PBDE-47對背角無齒蚌血淋巴AwHSP60基因表達的影響Fig.6 The effect of PBDE-47 on A.woodiana hemolymph AwHSP60 gene expression

在本研究中，PBDE-47處理可顯著誘導(dǎo)肝胰臟、鰓和血淋巴中 AwHSP60表達水平，提示背角無齒蚌能夠通過上調(diào)AwHSP60表達提高對PBDE-47暴露的耐受能力。背角無齒蚌作為濾食性淡水生物，靠過濾水體中營養(yǎng)物質(zhì)來維持生存。PBDE具有較高的親脂性，水中溶解PBDE很容易蓄積在細(xì)胞和組織中，導(dǎo)致活性氧(ROS)大量產(chǎn)生和機體氧化應(yīng)激。正常情況下，ROS會很快被一系列抗氧化酶清除，維持在一個合理水平。氧化應(yīng)激條件下，過量生成ROS可引起DNA損傷、脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)糖基化，造成蛋白質(zhì)錯誤折疊幾率增加。HSP表達上調(diào)有助于錯誤折疊蛋白質(zhì)進行修復(fù)、蛋白質(zhì)膜轉(zhuǎn)位、錯誤折疊蛋白質(zhì)降解，提高環(huán)境適應(yīng)性。相關(guān)文獻報道，水體柴油污染后能夠?qū)е掳臀髂迪牭啮w和消化腺中HSP60表達水平顯著上調(diào)，水體殘留的抗抑郁藥物氟西汀能夠誘導(dǎo)河蜆消化腺中HSP60和HSP70 mRNA水平上調(diào)[17]。干擾蛋白質(zhì)正確折疊是環(huán)境污染物影響機體功能重要路徑之一，激活HSP表達是動物恢復(fù)正常生理功能和提高適應(yīng)性的關(guān)鍵策略。低等生物缺乏后天免疫系統(tǒng)，軟體動物上調(diào)HSP60表達應(yīng)對溫度、病原物、重金屬和污染物的影響具有重要意義[17]。AwHSP60表達上調(diào)是背角無齒蚌應(yīng)對 PBDE-47引起氧化應(yīng)激的重要手段之一。

肝胰臟中 AwHSP60 mRNA水平的上調(diào)表現(xiàn)出時間依賴性模式，提示這可能與動物機體代償機制有關(guān)。動物長期暴露PBDE-47環(huán)境中，機體通過適應(yīng)性機制處理應(yīng)激效應(yīng)，并逐漸恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。作為一種細(xì)胞內(nèi)分子伴侶，HSP60參與細(xì)胞內(nèi)外免疫調(diào)控并保護細(xì)胞免受環(huán)境應(yīng)激損害，HSP60常表現(xiàn)出一種時間依賴性表達方式[18,19]。整個實驗觀察過程中，背角無齒蚌鰓中AwHSP60表達呈倒U型曲線，早期上調(diào)，中期達到峰值，后期下降，提示這種現(xiàn)象可能與動物對持續(xù)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的耐受能力有關(guān)。隨著PBDE-47處理時間延長，PBDE-47在體內(nèi)不斷蓄積，將不斷產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細(xì)胞承受逐漸增加的氧化應(yīng)激效應(yīng)，機體通過上調(diào)HSP 表達減少錯誤折疊蛋白質(zhì)產(chǎn)生，增強耐受性[20]。一旦PBDE-47產(chǎn)生氧化應(yīng)激水平達到峰值并超出細(xì)胞耐受能力，巨大應(yīng)激效應(yīng)將導(dǎo)致細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[21,22]。這種情況下，如果動物缺乏產(chǎn)生新細(xì)胞去補償死亡細(xì)胞的能力，活細(xì)胞數(shù)量將逐漸降低[23,24]。值得注意是，肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP60表達呈現(xiàn)不同的時空特征，提示該表達模式可能組織功能相關(guān)。軟體動物肝胰臟具有肝臟和胰腺的雙重功能，參與消化和中和大量毒素[15]。鰓與外部環(huán)境直接接觸，作為環(huán)境污染物主要入口[16]。蚌類淋巴細(xì)胞是抵御病原體入侵的重要屏障[16]。

本研究從背角無齒蚌克隆出AwHSP60全基因序列，該基因包含HSP60家族高度保守的標(biāo)簽序列。PBDE-47處理可顯著上調(diào)肝胰臟、鰓和血淋巴中 AwHSP60 表達水平，其原因與增強動物對氧化應(yīng)激的耐受能力有關(guān)。