楊長庚，蘇富強，文 華，劉 偉，魏開金

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢430223；2.嶺南師范學院生命科學與技術(shù)學院，廣東湛江 524048；3.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，屬十足目爬行亞目蜊蛄科螯蝦亞科原螯蝦屬，原產(chǎn)中、南美洲和墨西哥東北部地區(qū)[1]。由于其肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富，且近年來“小龍蝦(克氏原螯蝦)經(jīng)濟”在全國逐漸興起，集約化和規(guī)模化養(yǎng)殖也隨之不斷發(fā)展，目前已成為我國一個重要的水產(chǎn)經(jīng)濟品種。然而，對于克氏原螯蝦營養(yǎng)學的研究起步較晚，相關(guān)報道較少。

蛋白質(zhì)作為重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，其對動物體的生長及代謝起重要作用。尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，蛋白質(zhì)是決定水產(chǎn)動物生長快慢的關(guān)鍵因素[2]，水產(chǎn)動物對飼料蛋白質(zhì)水平要求較高，一般為畜禽的2～4倍，通常占配方的25%～50%，甚至更多。所以，蛋白質(zhì)需求一直是水產(chǎn)飼料營養(yǎng)研究的熱點。魚粉營養(yǎng)全面，適口性好，抗營養(yǎng)因子少，易于消化，一直以來是水產(chǎn)飼料中不可或缺的優(yōu)質(zhì)蛋白源。但是，隨著集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，魚粉的需求量急劇上升，其價格一直居高不下。因此，人們對其他多種蛋白源在水產(chǎn)飼料中的開發(fā)及應(yīng)用進行了一系列研究。例如，Elharoun等[3]對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究表明，噴霧干燥后的雞血粉和急驟干燥后的牛血粉對虹鱒的增重率和飼料效率等有較好的效果。Guillaume等[4]研究結(jié)果表明大豆?jié)饪s蛋白替代75%的魚粉對軍曹魚(Rachycentroncanadum)幼魚的生長無不良影響。然而，不同蛋白源生物特性、營養(yǎng)價值、養(yǎng)殖效果、價格等差異巨大，造成不同配方飼料的經(jīng)濟性，實際效益差異也很大。因此，尋找既具高營養(yǎng)價值又經(jīng)濟的蛋白源成為配合飼料研究中的必要環(huán)節(jié)。

目前，對于克氏原螯蝦的蛋白質(zhì)需求已有一些研究報道，研究表明克氏螯蝦餌料蛋白質(zhì)含量為27%～33%較適合[5-7]。克氏原螯蝦作為雜食動物，許多種蛋白源均在其飼料配方中有一定的應(yīng)用[8-9]。然而，對于不同種類蛋白源對克氏原螯蝦生長性能、營養(yǎng)生理等的影響未見報道。此外，蝦、蟹等甲殼動物必須進行周期型蛻皮才能成長，蛻皮是其生長和發(fā)育的標志特征，它貫穿甲殼動物個體發(fā)育的始終[10]。因此如何使小龍蝦快速沉積蛋白質(zhì)是解決肌肉不飽滿的關(guān)鍵。大量的研究表明配合飼料中蛋白來源是影響水產(chǎn)動物蛋白質(zhì)沉積的一個重要因素[11-12]。受到自然環(huán)境的限制小龍蝦的食性以植食性為主[13-14]，但對動物性原料的消化亦較高[15]。

因此，本實驗擬從克氏原螯蝦攝食、生長、體組成、脫殼率、成活率以及生長軸基因表達變化等方面，分析不同蛋白源(肉骨粉、菜籽粕、發(fā)酵豆粕、雞肉粉)對克氏原螯蝦營養(yǎng)生理的影響。以期減少高價動物蛋白源的用量，降低配方成本，為克氏原螯蝦飼料科學經(jīng)濟的配制提供理論依據(jù)，為推動克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)進一步發(fā)展提供重要基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用克氏原螯蝦購自荊州市荊州區(qū)太湖鎮(zhèn)，平均體重10 g左右，體質(zhì)健康。試驗在長江水產(chǎn)研究所中華鱘養(yǎng)殖基地進行。

1.2 實驗飼料

試驗分別以不同比例的魚粉、菜籽粕、發(fā)酵豆粕、雞肉粉和肉骨粉為蛋白質(zhì)原料，添加相同水平的棉粕、豆粕制成5種等氮等能的粉狀飼料。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料經(jīng)粉碎過80目篩，逐級混勻后加水攪拌，用小型絞肉機制成粒徑為2 mm的顆粒，低溫烘干并放入-20 ℃冰箱中保存。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平

續(xù)表

注：每千克復合維生素中含β-胡蘿卜素 96 mg，VD312 mg，VE 200 mg，VK340 mg，VB140 mg，VB280 mg，煙酰胺 400 mg，泛酸鈣 600 mg，VB6120 mg，B120.8 mg，葉酸 8 mg，生物素 4 mg，VC 200 mg，肌醇 4 000 mg，氯化膽堿 6 000 mg，對氨基苯甲酸 10 mg。

每千克復合礦物質(zhì)中含KAl(SO4)21.59 g，CaCO3181.01 g，Ca(H2PO4)2，CoCl20.7 g，MgSO452.16 g，MnSO4·H20 0.7 g，KCl 165.53 g，KI 0.14 g，ZnSO41.92 g，NaH2PO4136.05 g，Na2SeO30.06 g，CuSO4·5H2O 0.75 g，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 13.38 g。

1.3 實驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

用商品料馴化克氏原螯蝦1周。然后挑選大小均一、體格健壯的克氏原螯蝦幼蝦，將其分為5組，分別為對照組、菜籽粕組、發(fā)酵豆粕組、雞肉粉組、肉骨粉組,每組設(shè)3個重復，每個重復15尾蝦，隨機分配于15個(直徑2 m、高1 m)養(yǎng)殖桶中，分別投喂不同的試驗飼料。每日投喂2次(09∶00；18∶00)，投喂量為體質(zhì)量的4%～6%，試驗水體處于微流狀態(tài)，溶解氧(DO)≥5 mg/L，pH 7.6±0.1，水溫控制在(24±1)℃，試驗共進行6周。

1.4 樣品采集

試驗結(jié)束后，禁食24 h，稱取每組蝦的終末體重,并統(tǒng)計成活率。每桶隨機取3尾蝦在冰盤上解剖，取肝臟及肌肉置于液氮中保存,用于相關(guān)酶活性及基因表達分析，取去殼肌肉于-20 ℃冰箱中保存，用于肌肉常規(guī)組成分析。

1.5 樣品分析

1.5.1 生長性能分析

試驗完成后，按照以下公式計算成活率(SR)、增重率(WGR)、特定生長率(SGR)。

SR=(Mt/M0)×100%

WGR= [(Wt-Wo)/Wo]×100%

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%

式中，Mt表示實驗結(jié)束時蝦存活數(shù)尾數(shù)，M0表示實驗開始時蝦存活數(shù)尾數(shù)；Wt表示終末體質(zhì)量，W0表示初始體質(zhì)量；t表示飼養(yǎng)天數(shù)。

1.5.2 肌肉營養(yǎng)成分分析

取其肌肉組織用于測定蛋白質(zhì)(GB/T 5009.5—2003)、水分(GB/T 5009.3—2003)和粗脂肪(GB/T 5009.6—2003)[16]。

1.5.3 肝胰臟消化酶分析

取肝胰臟0.2 g左右加9倍質(zhì)量的雙蒸水冰浴中勻漿制備粗酶液。用福林-酚法測定蛋白酶活性，蛋白酶活力單位定義：在37 ℃下，每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸作為一個酶活力單位(U)。用淀粉-碘比色法測定淀粉酶活性，淀粉酶活力單位定義：在37 ℃、30 min內(nèi)，每毫克蛋白能完全水解淀粉10 mg稱為一個淀粉酶活力單位(U)。采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定脂肪酶活性。酶液蛋白含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。酶活力以比活力(U/mg prot)表示，酶的比活力=酶活力/蛋白含量。

1.6 RNA的提取及cDNA合成

將保存在液氮中的肝臟和肌肉組織于液氮中研磨成粉末。使用Trizol reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，按照提取說明操作提取總RNA。按照FastKing RT Kit(With gDNase)(北京天根生化科技有限公司)操作說明，合成cDNA第一鏈。

1.7 胰島素生長因子受體(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R)基因克隆及表達分析

根據(jù)GenBank中編號MG557703的克氏原螯蝦IGF1R序列，設(shè)計引物PC-F-S2，PC-F-A2對胰島素生長因子受體基因進行熒光定量PCR分析其表達情況。其中以18S RNA作為內(nèi)參[17]，引物序列見表2，引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

表2 熒光定量PCR檢測所用引物

用TRIzol Reagent 提取總RNA 后， 選擇ABS比值在1.8～2.0，3條電泳條帶完整清晰的RNA進行反轉(zhuǎn)錄(每個樣本取500 ng 總RNA)，以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系：在20 μL的Quantitative real-time PCR反應(yīng)混合液中含模板1 μL，上游和下游引物各0.6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min 預變性，然后95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 25 s，40個循環(huán)，在75～95 ℃進行熔解曲線檢測。反應(yīng)在QIAGEN Rotor-GeneQ 6000實時熒光定量PCR儀上進行。采樣檢測15個樣本，每個樣本3個重復。試驗所涉及的試劑盒均購自北京TIANGEN公司。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

目的基因mRNA相對表達豐度采用2-△△CT法進行分析，以克氏原螯蝦18S RNA為內(nèi)參，對得到的各樣品CT值進行均一化處理，以投喂魚粉為蛋白質(zhì)原料的飼料的目的基因 mRNA豐度為基準。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用平均值±標準差(mean±SD)表示，采用Duncan氏多重比較法分析試驗結(jié)果平均數(shù)的差異顯著性，差異顯著水平為P<0.05，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白源飼料對克氏原螯蝦生長的影響

從表3可見，試驗進行6周后，各組克氏原螯蝦的成活率沒有顯著性差異。發(fā)酵豆粕組的增重率最高，其次是對照組和雞肉粉組，發(fā)酵豆粕組顯著高于菜籽粕組和肉骨粉組。對于特定生長率，發(fā)酵豆粕組、雞肉粉組和對照組無顯著差異，菜籽粕組顯著低于其他各組。

表3 不同蛋白源飼料對克氏原螯蝦生長的影響

注：同列數(shù)值后不同上標字母表示差異顯著(P<0.05)，表4同。

2.2 不同蛋白源飼料對克氏原螯蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響

由表4可見，不同蛋白源飼料對克氏原螯蝦水分和粗脂肪無顯著性影響；對照組的粗蛋白含量最高，顯著高于菜籽粕組和雞肉粉組，但與發(fā)酵豆粕組和肉骨粉組沒有顯著性差異。

表4 不同蛋白源飼料對克氏原螯蝦肌肉營養(yǎng)成分的影響

2.3 不同蛋白源飼料對克氏原螯蝦肝胰臟消化酶的影響

從圖1可見，發(fā)酵豆粕組的肝胰臟蛋白酶活性最高，顯著高于菜籽粕和雞肉粉組，發(fā)酵豆粕、肉骨粉組和對照組之間差異不顯著，菜籽粕組肝胰臟蛋白酶活性顯著性低于對照組，其蛋白酶活性最低。肝胰臟淀粉酶活性最高的是肉骨粉組，顯著性高于對照組，發(fā)酵豆粕組和菜籽粕組肝胰臟的淀粉酶活性顯著低于對照組。肝胰臟脂肪酶活性最高的是發(fā)酵豆粕組，但各組間沒有顯著性差異。

圖1 不同蛋白源飼料對克氏原螯蝦肝臟蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性影響的比較Fig.1 Comparison of total liver protease,amylase and lipase activities of P.clarkii fed the diets containing various protein sourcesa:蛋白酶；b: 淀粉酶；c: 脂肪酶注：圖上標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2同。

2.4 胰島素生長因子受體基因IGF1R的克隆及表達分析

如圖2所示，在肌肉IGF1R mRNA相對表達量上，發(fā)酵豆粕組的表達量最高，與對照組差異性不顯著，但顯著高于其他實驗組；在肝臟IGF1R mRNA表達上，各試驗組相對表達量都顯著高于對照組，菜籽粕組、發(fā)酵豆粕組和肉骨粉組間相對表達量差異性不顯著。

圖2 不同蛋白源飼料對克氏原螯蝦肌肉及肝臟中IGF1R相對表達量的比較Fig.2 Comparison in muscle and liver relative expression of IGF1R mRNA of P.clarkii fed the diets containing various protein sourcesa:肌肉;b: 肝臟

3 討論

本試驗分析了不同蛋白源(菜籽粕、發(fā)酵豆粕、雞肉粉、肉骨粉)對克氏原螯蝦營養(yǎng)生理的影響。發(fā)酵豆粕是利用微生物在可控條件下降解豆粕，去除抗營養(yǎng)因子，將豆粕中蛋白降解成小肽，同時產(chǎn)生一些微生物的代謝產(chǎn)物，改善其可利用性。有研究表明：發(fā)酵豆粕替代飼料中6%的魚粉，不影響凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的生長和飼料利用[18]。此外，海鱸(Lateolabraxjaponicus)飼料中，發(fā)酵豆粕可以替代25%的魚粉[1]。許氏平鮋(Sebastesschlegeli)飼料中，發(fā)酵豆粕可以替代40%的魚粉[19]。本試驗中利用發(fā)酵豆粕替代50%魚粉，經(jīng)過6周的養(yǎng)殖實驗后，發(fā)現(xiàn)有利于克氏原螯蝦的生長。

菜籽粕是一種重要的植物蛋白源，其具有蛋白含量高(32%以上)，氨基酸組成相對平衡等優(yōu)點，在我國來源廣泛，在水產(chǎn)飼料中具有極大的應(yīng)用潛力。目前，對菜籽粕對水產(chǎn)動物生長、生理生化的影響以及替代魚粉等方面，已有一定的研究，發(fā)現(xiàn)菜籽粕可以替代部分魚粉，而對水產(chǎn)動物生長性能影響不大[20-21]。本試驗發(fā)現(xiàn)菜籽粕替代50%魚粉，降低了克氏原螯蝦的生長?？赡苁怯捎诓俗哑珊卸喾N毒素、抗營養(yǎng)因子和較高粗纖維含量，導致克氏原螯蝦消化減弱，進而影響了生長。

雞肉粉和肉骨粉作為動物蛋白源，廣泛應(yīng)用于魚飼料中以部分替代魚粉，目前已有許多研究。雞肉粉可替代黑海菱鲆(Scophthalmusmaeoticus)25%的飼料魚粉，生長性能沒有顯著降低[22]。大黃魚(Pseudosciaenacrocea)飼料中，肉骨粉替代45%的魚粉，對大黃魚生長的影響不顯著[23]。本試驗結(jié)果顯示雞肉粉或肉骨粉替代50%魚粉，克氏原螯蝦的生長性能沒有顯著性降低。

隨著配合飼料的推廣應(yīng)用，在實際生產(chǎn)中經(jīng)常會遇到的克氏原螯蝦生長速度快但尾部肌肉不飽滿的問題。推測應(yīng)該是小龍蝦的脫殼周期變短，蛋白質(zhì)沉積不夠的問題造成的。本實驗中，在對克氏原螯蝦肌肉營養(yǎng)成分分析后，發(fā)現(xiàn)水分和粗脂肪沒有差異；而粗蛋白有顯著性差異，都低于對照組。這可能由于魚粉相比于其他動物性或植物性蛋白源，它的蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成平衡及抗營養(yǎng)因子少，更有利于魚類的營養(yǎng)需求。敬婷等[24]在研究羅非魚(Oreochromisniloticus)飼料中肉骨粉替代魚粉實驗中發(fā)現(xiàn)，通過添加包膜賴氨酸、蛋氨酸來平衡肉骨粉替代組中的賴氨酸、蛋氨酸含量，可能是替代后沒有影響羅非魚生長性能的一個重要因素。

消化酶活力的高低決定了魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，影響其生長速度。而餌料是引起消化酶變化的一個重要因素，其種類和質(zhì)量不僅影響消化酶的活性、種類、分布，而且還可影響酶的分泌，魚類能適應(yīng)于不同的飼料而調(diào)整消化酶的分泌。例如，孫盛明等[25]研究發(fā)現(xiàn)青魚專用配合飼料中豆粕和菜粕蛋白替代魚粉蛋白超過50%對青魚腸和肝胰臟的蛋白酶活力有顯著的影響，而豆粕和菜籽粕替代魚粉25%、替代魚粉50%和對照組差異不顯著。而本試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕替代50%魚粉組的肝胰臟蛋白酶活性略高于對照組，但差異不顯著，這可能與豆粕發(fā)酵處理后，去除一些抗營養(yǎng)因子后更有利于蝦體對蛋白質(zhì)的吸收與利用；菜籽粕替代50%魚粉組顯著低于對照組，可能由于菜籽粕中含有多種毒素和抗營養(yǎng)因子如硫代葡萄糖甙、芥酸、植酸、單寧等，魚類食用后隨時會分解為硫氰酸鹽、異硫氰酸鹽(ITC)、惡唑烷硫酮(OZT)、腈等有毒物，其中腈化物主要損害肝臟和腎臟[26]，可能由此損害了肝胰臟導致蛋白酶活性分泌的減弱。試驗還發(fā)現(xiàn)雞肉粉和肉骨粉替代50%魚粉后，蛋白酶活性影響不顯著，這與動物性蛋白相比植物性蛋白更利于蝦體的吸收有關(guān)。

飼料中蛋白質(zhì)種類及含量、脂肪種類及含量對魚類腸道淀粉酶活性影響不顯著[27]，而飼料中淀粉含量對其影響顯著。由于本試驗淀粉酶活性存在差異，主要是由于飼料中淀粉含量不同而導致的。對于脂肪酶的活性，其主要受飼料脂肪含量的影響，而本試驗中各組飼料脂肪水平保持一致，所以脂肪酶活性沒有顯著性差異。

本試驗在對胰島素生長因子受體基因IGF1R進行克隆后，對其在肌肉和肝臟中的表達情況進行了檢測。胰島素樣生長因子1(IGF1)是一種多功能細胞調(diào)控因子，它的結(jié)構(gòu)特征為其促生長和物質(zhì)代謝功能提供依據(jù)[28]。而胰島素生長因子受體基因起著介導胰島素樣生長因子的作用，在調(diào)節(jié)細胞的增殖和機體的正常發(fā)育中具有重要作用。Gricourt等[29]運用人類重組蛋白IGFR研究了長牡蠣(Crassostreagigas)IGF通路，認為在長牡蠣體內(nèi)也具有一條IGF-IGFR通路，在該通路中，IGF發(fā)揮了促進生長的功能。宋姍姍等[30]闡述了胰島素樣生長因子Ⅰ受體結(jié)構(gòu)、功能及其與生長發(fā)育的關(guān)系。本研究中結(jié)果顯示該基因在小腸和肝臟中均有表達，且在肝臟中表達量較高。發(fā)酵豆粕組在小腸和肝臟中都出現(xiàn)比較高的表達，而此組的克氏原螯蝦生長最好，說明該基因的表達量與克氏原螯蝦的生長有密切的聯(lián)系。