王海候，孟祥國，金梅娟，施林林，周新偉，陸長嬰，沈明星

(江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)部蘇州水稻土生態(tài)環(huán)境重點野外科學(xué)觀測試驗站，江蘇 蘇州 215155)

蚯蚓是一種以腐敗有機物料為食的雜食性動物，在常溫有氧條件下吞食有機物，通過腸道物理破碎及微生物的協(xié)同作用對有機固體廢棄物進行生物氧化和轉(zhuǎn)化，形成富含腐殖質(zhì)和營養(yǎng)元素的蚓糞有機肥[1-2]。目前，利用蚯蚓處理有機廢棄物已是一種新型的生態(tài)處理技術(shù)，蚯蚓生物消解技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜禽糞便、城市污泥等有機固體廢棄物的生物處置工程，有效實現(xiàn)了有機固體廢棄物的資源化、減量化、無害化利用[3-7]。

現(xiàn)階段我國蚯蚓處理生物有機廢棄物技術(shù)比較成熟[8-12]，但是蚯蚓活體與蚓糞分離一直是蚯蚓處理廢棄物能力提高的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，在一定程度上影響了蚯蚓處理有機廢棄物潛力的發(fā)揮。分離蚯蚓活體與蚓糞的方法主要有人工法、光刺激法、滾輪振動法、誘捕法等[13-16]，但上述非人工輔助性方法成熟應(yīng)用于生產(chǎn)實際的實例幾乎沒有。目前，蚯蚓處理有機廢棄物的后期，蚯蚓活體與蚯蚓糞分離采收工作仍然以手工操作為主，效率低、勞動力成本高。作者所在項目組研究發(fā)現(xiàn)，采用電刺激的方法可以實現(xiàn)蚯蚓活體與蚓糞的快速分離(正申請專利保護)，并且可以顯著提高勞動效率，降低勞動力投入成本，極大緩解了蚯蚓分離效率低下與有機廢棄物處置壓力大的矛盾。電刺激是否會造成蚯蚓生物機體組織損傷和功能障礙，也尚未可知。因此，本文擬研究應(yīng)用電刺激方法分離蚯蚓與蚓糞過程中蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的變化，旨在為一種利用電刺激分離蚯蚓活體與蚓糞的技術(shù)可行性提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試蚯蚓

選擇具有成熟環(huán)、健康活潑的赤子愛勝蚓作為供試蚓種。蚯蚓鮮質(zhì)量0.25～0.30 g·條-1、長約5 cm。

1.1.2 供試物料

選擇蔬菜廢棄物、牛糞、秸稈作為供試有機物料。蔬菜廢棄物取自蘇州市相城區(qū)望亭鎮(zhèn)御亭現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園，主要為廢棄的果、葉、根莖、藤蔓等混合鮮樣，進行1～3 cm破碎(含水率84.7%、有機碳含量38.71%、全氮含量2.09%)；牛糞取自附近奶牛養(yǎng)殖場(含水率55.16%、有機碳含量34.07%、全氮含量1.12%)；秸稈取自附近農(nóng)場的水稻秸稈，進行0.2～0.5 cm粉碎(含水率20.19%、有機碳含量44.51%、全氮含量0.71%)。試驗首先堆制總重約1 000 kg，碳氮比約為25的蔬菜廢棄物混合堆肥體，將800 kg新鮮蔬菜廢棄物與100 kg牛糞、100 kg秸稈粉末充分混合，控制水分65%～75%，堆成垛狀并覆蓋薄膜，進行好氧堆制腐解10～14 d，備用。

1.2 處理設(shè)計

試驗于2018年10月在江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實驗室內(nèi)進行。圍繞蚯蚓與蚯蚓糞快速分離的目標(biāo)，項目組研發(fā)了一種利用電刺激分離蚯蚓的方法及裝置(正申請專利保護)。本試驗主要應(yīng)用電刺激分離蚯蚓的方法及裝置，進行蚯蚓分離效果比較，以及蚯蚓生理生化指標(biāo)對電刺激的響應(yīng)。

1.2.1 電刺激分離蚯蚓、蚓糞的效果

以人工分離蚯蚓為對照，以電刺激分離蚯蚓為處理，每個處理各5次重復(fù)。取半腐解處理的有機物料100 kg，分別裝入2個相同大小的塑料整理箱(120 cm×50 cm×28 cm)中，每個整理箱的有機物料為50 kg，每箱投入蚯蚓2.5 kg，控制水分60%左右，置于避光陰涼處，培養(yǎng)21 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將蚯蚓連同蚯蚓糞一起取出，分成10份，每份5 kg。其中5份分別裝入蚯蚓電刺激分離裝置，進行電刺激分離作業(yè)，另外5份分別置于塑料紙上，選用熟練工進行人工分離蚯蚓作業(yè)。每個處理的分離作業(yè)時間均為30 min，記錄第30 min時蚯蚓的分離數(shù)量，其余的蚯蚓均采用人工分離，記錄剩余的蚯蚓數(shù)量(包括成蚓、幼蚓及蚓繭數(shù)量)。

1.2.2 電刺激對蚯蚓生理生化指標(biāo)的影響

以試驗1為基礎(chǔ)，共設(shè)3個處理，分別采集未電刺激分離的蚯蚓、電刺激分離的蚯蚓、電刺激分離后再恢復(fù)培養(yǎng)5 d的蚯蚓。其中，未電刺激分離的蚯蚓取試驗1中人工分離處理的蚯蚓，每個重復(fù)取50 g，待測；電刺激分離的蚯蚓取試驗1中經(jīng)歷電刺激(電流10 mA、刺激時間30 min)的蚯蚓，每個重復(fù)取100 g，平均分成2份，1份待測，1份置于有機物料中繼續(xù)進行恢復(fù)性培養(yǎng)5 d，再通過人工分離待測。每個處理重復(fù)5次，上述待測樣品先用超純水洗凈表面有機物料后，放入底部鋪有濕潤濾紙的2 L燒杯中，用無紡布封口，置于25 ℃人工氣候箱中，避光培養(yǎng)8 h，用于除盡蚯蚓腸道內(nèi)雜物等。最后置于-86 ℃超低溫冰箱保存待測。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 蚯蚓分離效率

蚯蚓數(shù)包括了成蚓、幼蚓及蚓繭數(shù)量，指30 min內(nèi)分離的蚯蚓數(shù)占蚯蚓總數(shù)的比例。

1.3.2 蛋白含量及酶活力或含量的測定

蚯蚓樣品的蛋白含量及酶活力或含量測定，由南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司測定完成?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍比色法測定，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、纖維素酶的活性、丙二醛(MDA)含量采用試劑盒法測定[17-18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

蚯蚓分離效率、蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)由5組蚯蚓試驗樣本的平均值得到。數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理與畫圖，SPSS 23.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電刺激對蚯蚓、蚓糞分離效果的影響

電刺激分離蚯蚓過程主要是將蚯蚓連同消解物料一起裝入生物反應(yīng)器內(nèi)，待物料消解結(jié)束后，應(yīng)用10 mA弱電流間歇式刺激30 min，蚯蚓在電刺激下逃離生物反應(yīng)器，從而實現(xiàn)蚯蚓與蚓糞的分離。由圖1可知，在相同蚯蚓物料體質(zhì)量、相同分離時間條件下，電刺激分離的蚯蚓分離率顯著大于人工方式，分離率提高了31.9百分點。

柱間無相同小寫字母表示處理間差異顯著(表3～5同)。圖1 不同分離方式對蚯蚓、蚓糞分離率的影響

電刺激處理的蚯蚓分離率隨著電刺激時間的增加呈上升趨勢(圖2)。蚯蚓分離率與電刺激時間呈極顯著性線性正相關(guān)，y=2.596x+10.115(r=0.997**)，說明分離率0～84.6%時，電刺激時間每增加1 min，蚯蚓分離率可提高2.6百分點。與人工分離方式相比，在蚯蚓應(yīng)用于農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)消解工程中，當(dāng)蚯蚓密度較高時，可以通過電刺激方式，實現(xiàn)蚯蚓密度的有效降低。

圖2 不同電刺激時間對蚯蚓、蚓糞分離率的影響

2.2 電刺激對蚯蚓體內(nèi)生化指標(biāo)的影響

2.2.1 可溶性蛋白、MDA含量

蚯蚓在逆境脅迫條件下，機體功能和內(nèi)分泌系統(tǒng)受損，在短期內(nèi)會產(chǎn)生較多的應(yīng)激蛋白去應(yīng)對逆境脅迫負荷，從而引起體內(nèi)蛋白含量的升高[19-20]。如圖3所示，與對照相比，電刺激及電刺激5 d后的蚯蚓體內(nèi)可溶性蛋白含量均無顯著性差異，說明10 mA弱電流間歇式刺激30 min后，對蚯蚓體內(nèi)可溶性蛋白含量無顯著影響。MDA作為膜脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)物，是細胞膜脂質(zhì)過氧化程度及應(yīng)激反應(yīng)強弱的重要指示指標(biāo)，MDA含量與機體損傷呈正比[21]。研究發(fā)現(xiàn)，電刺激顯著提高了蚯蚓體內(nèi)MDA含量，但電刺激后培養(yǎng)5 d，蚯蚓體內(nèi)MDA含量與對照無顯著性差異。

圖3 電刺激對蚯蚓可溶性蛋白及MDA含量的影響

2.2.2 SOD、CAT活性

生物體內(nèi)活性氧的消除主要是由抗氧化防御系統(tǒng)酶來完成，抗氧化防御系統(tǒng)酶主要有SOD、CAT、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、細胞色素過氧化物酶、NADH過氫化酶與氧化酶等，其中研究最多的是SOD、CAT[22]。SOD是消除細胞體內(nèi)生物氧化、產(chǎn)生超氧陰離子自由基的金屬酶類，是生物體內(nèi)重要的氧自由基消除劑[23]。如圖4所示，各處理組蚯蚓體內(nèi)SOD、CAT活性物無顯著性差異。

圖4 電刺激對蚯蚓SOD、CAT活性的影響

2.2.3 纖維素酶、AchE活性

蚯蚓作為一種植食性動物，是有機物質(zhì)的分解者，蚯蚓體內(nèi)的纖維素酶對土壤中有機物質(zhì)的分解起著重要作用，纖維素酶活性越高，消解能力越強[24]。AchE在蚯蚓的神經(jīng)傳遞過程中起著重要作用，AchE活性主要用于評價逆境因子對蚯蚓的脅迫情況，AchE活性越低，則蚯蚓神經(jīng)傳遞受阻，生命力則越差[25]。圖5所示，電刺激后蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性與對照組無顯著性差異；繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，蚯蚓體內(nèi)的纖維素酶活性顯著高于對照組和電刺激組。各處理組蚯蚓AchE活性均無顯著性差異。

圖5 電刺激對蚯蚓纖維素酶、AchE活性的影響

3 討論

與對照處理相比，在相同物料體質(zhì)量、相同分離時間下，電刺激處理的蚯蚓分離率顯著提高了31.9百分點。電刺激處理下蚯蚓分離率可達84.6%，且分離率0～84.6%時，電刺激時間每增加1 min，蚯蚓分離率可提高2.6百分點。蚯蚓在弱電流刺激及間隙式電場作用下分離，可能與蚯蚓在電刺激脅迫下產(chǎn)生不適感而應(yīng)激逃跑，實現(xiàn)蚯蚓與蚓糞的分離，但有關(guān)電刺激措施對蚯蚓的負荷方式、作用機制等均尚不清楚，有待于進一步的研究。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，環(huán)境逆境脅迫對蚯蚓生化指標(biāo)影響的研究已經(jīng)成為蚯蚓生態(tài)毒理學(xué)的研究熱點，利用蚯蚓的分子、生物化學(xué)和生理反應(yīng)，即生物標(biāo)志物指示逆境脅迫對蚯蚓所產(chǎn)生的影響，并作為早期應(yīng)對逆境脅迫的預(yù)警監(jiān)測指標(biāo)[26]。本試驗關(guān)注了蚯蚓經(jīng)電刺激處理后可溶性蛋白、MDA、纖維素酶、CAT、SOD、AchE等生化指標(biāo)的變化情況，發(fā)現(xiàn)蚯蚓對電刺激脅迫具有耐受性，且影響在蚯蚓后期的培養(yǎng)中可以實現(xiàn)自我恢復(fù)[19-20]。另外，電刺激后培養(yǎng)5 d的蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性仍顯著高于對照，說明電刺激對蚯蚓機體功能及內(nèi)分泌的影響只是短暫的，并不影響其持續(xù)的生長與消解能力，有關(guān)電刺激處理后纖維素酶活性的促進作用原因，尚有待進一步研究。