蔣 卉，袁 欣，馮乃馨，張 晶，李艷敏，符真珠，高 杰，董曉宇，王慧娟，王利民，張和臣

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所,河南 鄭州 450002)

多倍體化普遍存在于被子植物中，是植物物種形成、多樣化和進化的重要方式[1-2]，能產(chǎn)生巨大的表型變異，也是人類生產(chǎn)活動以來進行植物育種的重要方法[3]。多倍體通常在植株形態(tài)和植物生理生化方面與二倍體植株存在較大差異，例如根、節(jié)結(jié)、葉、果實、花和種子等，表現(xiàn)為整株增大、生長緩慢、花期滯后和生長周期延長，對干旱、鹽堿、溫度和病蟲害等逆境的適應(yīng)能力增強等[4-5]，與人工選育方向高度契合。

人工誘導(dǎo)多倍體的方法有多種，包括物理法、化學(xué)法和生物學(xué)法。其中，物理誘導(dǎo)法包括溫度激變、超聲波和射線照射等[6]，但誘導(dǎo)率較低?；瘜W(xué)誘導(dǎo)劑主要有秋水仙素、甲基氨草磷(APM)、吲哚乙酸、鬼臼樹脂、富民隆、甲基氨草磷、安磺靈、氟樂靈等[7-8]。目前秋水仙素處理效果最佳[9]，主要通過真空處理花、浸泡植株、滴沾頂端分生組織，棉球敷葉腋，浸泡胚、種子或花粉母細胞，混合培養(yǎng)葉片、葉柄外植體等方法誘導(dǎo)[10]，秋水仙素特異性地與微管蛋白質(zhì)原件結(jié)合，阻止分裂細胞中紡錘絲的合成，中斷有絲分裂，形成染色體加倍的核。秋水仙素處理效果因植物種類、處理材料、誘導(dǎo)方式或試劑、處理劑量和處理時間而不同，掌握最佳的誘導(dǎo)劑、處理劑量和處理時間是提高誘導(dǎo)效率的關(guān)鍵。

矮牽牛是茄科矮牽牛屬多年生草本植物?；ㄐ?、花色豐富艷麗，溫室栽培可四季開花，是重要的裝飾性花卉。矮牽牛的育種方法主要有雜交育種、基因工程育種、體細胞雜交育種和倍性育種等，多倍體育種是倍性育種的重要方式。國外對矮牽牛多倍體研究具有一定歷史，因涉及商業(yè)機密，缺乏相關(guān)報道資料，國內(nèi)矮牽牛多倍體育種報道也較少，主要內(nèi)容是通過調(diào)節(jié)秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、選擇合適的處理材料誘導(dǎo)多倍體。早期國外培育的多倍體具有花徑大、花色豐富、開花周期長等特點。張敩方等[11]采用0.05%秋水仙素處理矮牽牛種子24 h后,獲得較佳的誘導(dǎo)效果和變異植株存活率。矮牽牛B3種子經(jīng)0.1%秋水仙素處理48 h后，獲得了26.7%的誘導(dǎo)率[12]。此外，對一葉一心期的矮牽牛采用0.2%秋水仙素處理3 d后，也獲得較高的多倍體誘導(dǎo)率[13]。矮牽牛組培苗莖尖經(jīng)0.1%秋水仙素處理36 h后，獲得20%的多倍體誘導(dǎo)效率[14]。但以上研究均存在較高頻率的混倍體。鑒于此，擬在無菌條件下，使用秋水仙素處理矮牽牛種子，獲得更高純合度和更高倍性的誘導(dǎo)植株，提高誘導(dǎo)植株存活率，并分析變異植株的表型數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

矮牽牛野生品種(Petuniaaxillaris)種子由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所園林花卉研究室提供。

1.2 秋水仙素誘導(dǎo)矮牽牛種子

處理方法為無菌種子浸漬法。將矮牽牛種子用5%NaClO浸泡4～5 min后，用無菌水沖洗2～3次，采用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的秋水仙素水溶液(0.05%、0.10%和0.20%)浸泡種子。將每個處理種子分為4份，每份種子數(shù)量為90～120粒，分別于25 ℃暗培養(yǎng)12、24、36、48 h，用無菌水沖洗2～3次后接種到MS固體培養(yǎng)基，每瓶30～40粒，每個處理3瓶，以無菌水浸泡48 h的種子為對照(CK)。所有處理樣品均置于25 ℃、光照/黑暗(16 h/8 h)條件下培養(yǎng)。50 d后依據(jù)是否長出1對真葉，統(tǒng)計存活率。

1.3 流式細胞儀鑒定多倍體

采用流式細胞儀進行鑒定。將誘導(dǎo)存活的幼苗，切取0.5 cm2嫩葉置于培養(yǎng)皿中，加入萃取裂解緩沖液，快速切碎并完全浸泡于萃取液CyStain@ DNA 1 step staining solution(Sysmex,Germany)中，過濾后獲得單細胞懸液，遮光靜置5～8 min。將樣品管插入CyFlow Cube 3分析儀中分析DNA含量，以CK發(fā)芽幼苗為標(biāo)樣，每個處理測定10～15株樣品，重復(fù)2次。根據(jù)流式細胞儀繪制的分離峰，統(tǒng)計矮牽牛2x、4x和8x變異植株的數(shù)量，統(tǒng)計4x誘導(dǎo)率和8x誘導(dǎo)率。

1.4 變異植株形態(tài)觀察和葉綠素、類胡蘿卜素含量測定

觀察無菌苗時期變異植株形態(tài)特征，包含葉色、株高、節(jié)間距(葉)和氣孔等。

取無菌苗葉片，撕取下表皮置于載玻片上，經(jīng)I2-KI染色后，加蓋玻片，在顯微鏡下選擇2～3個視野記錄氣孔數(shù)目、保衛(wèi)細胞長度和寬度及葉綠體數(shù)等，計算氣孔密度、細胞長度/寬度，并拍照。

取組培苗葉片，稱取0.02 g左右剪碎并用95%乙醇浸泡后，遮光過夜保存，得到其浸泡液，采用分光光度計測定浸泡液在649、665、470 nm處的吸光度，計算葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，重復(fù)3次，取其平均值。

葉綠素a含量(mg/g)=(13.95×A665-6.88×A649)×V/1 000W

葉綠素b含量(mg/g)=(24.96×A649-7.32×A665)×V/1 000W

葉綠素總含量(mg/g)=葉綠素a含量+葉綠素b含量

類胡蘿卜素含量(mg/g)=(100×A470-2.05×葉綠素a含量-114.8×葉綠素b含量)×V/1 000W/245

式中，A665、A649、A470分別為相應(yīng)波長下的吸光度，V為提取液體積，W為葉片質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 矮牽牛多倍體誘導(dǎo)及流式細胞儀檢測結(jié)果

對矮牽牛種子進行消毒處理后，使用滅菌秋水仙素(0.05%～0.20%)浸泡12～48 h，轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基進行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得變異植株，通過流式細胞儀檢測正常植株和突變植株單片葉。檢測結(jié)果表明，單片葉測定的分離峰均為單峰(圖1)，說明單片葉倍性一致、未有嵌合體情況發(fā)生。抽樣測定發(fā)現(xiàn)，單株變異植株不同葉片分離峰的位置均相同，也均為單峰，表明誘導(dǎo)植株的倍性較為穩(wěn)定。但發(fā)現(xiàn)有個別變異植株雖然倍性一致，不同區(qū)段表型差異較大，分株培養(yǎng)后依然維持差異表型，后續(xù)將對其進行進一步研究(未提供圖片)。此外，抽樣檢測的變異植株的分離峰均在2x、4x和8x處，表明秋水仙素處理矮牽牛種子加倍獲得的變異植株，大部分為染色體整體加倍。

2.2 不同倍性矮牽牛變異植株形態(tài)特征比較

未經(jīng)秋水仙素處理的矮牽牛種子，其植株正常生長，葉微發(fā)黃，葉呈橢圓形或細長，葉尖較尖(圖1A、表1)。誘導(dǎo)加倍為4x的變異植株，子葉較2x厚，多毛但不明顯；第1～2片真葉卵圓，葉色偏綠或葉脈中心深綠，葉片厚度稍增加而不明顯，葉毛稍增加不明顯；>第3片真葉后葉片形態(tài)逐漸與CK葉片形態(tài)相似；節(jié)間距與CK類似或變短，節(jié)間距為2～3 cm或1～2 cm；40 d后株高為8～10 cm、5～6 cm或3～4 cm不等；植株的生長速度與CK類似或稍慢(圖1C、表1)。誘導(dǎo)加倍為8x的變異植株，下胚軸較粗，近根尖局部膨大加粗，部分根生長受阻，下胚軸附近呈現(xiàn)黃褐色愈傷；子葉相對4x更加肥厚短小、多毛；第1～2片真葉卵圓、深綠，葉片加厚，葉毛增加明顯；節(jié)間距縮短嚴(yán)重，為1～3 mm；植株生長速度很慢，40 d左右變異植株高度1～2 cm或<1 cm、多數(shù)<0.5 cm，較大比例變異植株處于剛長出子葉狀態(tài)(圖1D、表1)。4x倍性變異植株形態(tài)介于2x和8x倍性變異植株中間，可根據(jù)形態(tài)推測，但倍性的確定還需依據(jù)流式細胞儀檢測結(jié)果。

A:CK;B:2x矮牽牛植株形態(tài)；C:4x矮牽牛植株形態(tài)；D1—D4:8x矮牽牛植株形態(tài)；E1—E4:分別為CK、2x、4x和8x矮牽牛變異植株流式細胞儀測定的分離峰

倍性Ploidy子葉厚度Cotyledonthickness第1～2片真葉1stto2ndtrueleaves節(jié)間距Pitchspace株高Plantheight下胚軸直徑Hypocotyldiameter根RootCK1～2mm葉微黃,葉呈橢圓形或細長,葉尖較尖2～3cm40d后株高為8～10cm1～2cm細長,為3～7根4x較2x厚,多毛但不明顯第1～2片真葉卵圓,葉色偏綠或葉脈中心深綠,葉片厚度稍增加而不明顯,葉毛稍增加不明顯與CK類似或變短,節(jié)間距為2～3cm或1～2cm40d后株高為8～10cm、5～6cm或3～4cm不等較2x粗細長,為3～7根8x較4x更加肥厚短小,2～3mm,多毛第1～2片真葉卵圓、深綠,葉片加厚,葉毛增加明顯縮短嚴(yán)重,為1～3mm植株生長速度極慢,40d左右變異植株高度1～2cm或<1cm、多數(shù)<0.5cm;較大比例變異植株處于剛長出子葉狀態(tài)較粗短,<5mm近根尖局部膨大加粗,部分根生長受阻,下胚軸附近呈現(xiàn)黃褐色愈傷

2.3 秋水仙素對矮牽牛種子倍性誘導(dǎo)的影響

結(jié)合流式細胞儀檢測結(jié)果，由表2可知，隨著秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)或處理時間的增加，矮牽牛種子的存活率逐漸降低，秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～0.10%時，隨著秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，4x和8x的誘導(dǎo)率增加；當(dāng)秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%～0.20%時，隨著秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，4x誘導(dǎo)率降低，8x誘導(dǎo)率增加；0.20%處理時間>24 h時誘導(dǎo)的均為8x突變體植株。秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%時，48 h時的4x和8x倍性誘導(dǎo)率合計為44.44%，存活率為44.44%。秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%時，隨著誘導(dǎo)時間的增長，誘導(dǎo)率逐漸增加，至24 h時4x誘導(dǎo)率達到47.37%，8x誘導(dǎo)率達到21.05%；誘導(dǎo)時間進一步增長時，誘導(dǎo)率繼續(xù)增加，但種子存活率快速下降，48 h時僅為8.33%。秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%時，最高存活率僅為8.00%。綜上表明，0.10%秋水仙素處理24 h后的矮牽牛種子，在保證一定存活量同時，倍性誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)的大部分為4x和8x突變植株，并可根據(jù)植株形態(tài)和生長狀況進行初步的推測。如需定向誘導(dǎo)8x變異植株，可將0.10%秋水仙素處理時間延長至36 h左右。同時也表明，通過秋水仙素處理矮牽牛種子獲得的倍性變異植株具有一定的規(guī)律，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時誘導(dǎo)率也較低，突變植株以4x為主，隨著秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時間的增加8x變異植株的比例增加。

表2 秋水仙素對矮牽牛種子多倍體誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of colchicine on polyploidy induction of Petunia axillaris seeds

注:鑒定數(shù)為通過流式細胞儀鑒定的植株數(shù)；誘導(dǎo)數(shù)為通過流式細胞儀鑒定的倍性植株數(shù)；誘導(dǎo)率=流式細胞儀鑒定倍性植株數(shù)/鑒定總數(shù)×100%。

Note: Identification number is the number of plants identified by flow cytometry; induction number is the number of ploidy plants identified by flow cytometry; induction rate=the number of ploidy plants by flow cytometry identification/total number of identification×100%.

2.4 不同倍性矮牽牛植株葉片氣孔比較

對不同倍性矮牽牛氣孔和保衛(wèi)細胞觀察(圖2、表3)發(fā)現(xiàn)，氣孔密度隨著倍性的增加而快速降低，不同倍性間差異顯著，2x的氣孔密度最高，為137.39個/mm2，是4x的5.4倍，是8x的10.8倍，表明由4x至8x氣孔密度降低了50%。8x保衛(wèi)細胞的長度/寬度較2x和4x增大，2x和4x的長度/寬度為1.07和0.99，均近圓球形，而8x的長度/寬度為1.28，近橢圓形。此外，4x氣孔長寬度和保衛(wèi)細胞長寬度約是CK或2x的2倍，8x氣孔和保衛(wèi)細胞長度約是4x的2倍，表明不同倍性矮牽牛氣孔和保衛(wèi)細胞的長度隨著倍性的增加而成倍增加，但倍性增加為8x時，變異植株的氣孔和保衛(wèi)細胞寬度未成倍增加。

2.5 不同倍性矮牽牛葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量比較

由圖3可見，矮牽牛葉片葉綠素a和葉綠素b含量因秋水仙素的處理而表現(xiàn)降低，且差異顯著；加倍后植株(4x或8x)較未加倍植株葉綠素a和葉綠素b含量低，且差異顯著；但8x較4x變異植株的葉綠素a和葉綠素b含量有所增加，8x變異植株間標(biāo)準(zhǔn)差值增加，表明8x變異植株間葉綠素a和葉綠素b含量差異變化幅度較大。秋水仙素處理后，植株的類胡蘿卜素含量升高，且差異顯著，8x變異植株類胡蘿卜含量較4x植株稍降低，差異不顯著。

A.2x葉片氣孔形態(tài)；B.4x葉片氣孔形態(tài)；C.8x葉片氣孔形態(tài)

倍性Ploidy氣孔Stoma密度/(個/mm2)Density長度/μmLength寬度/μmDiameter長度/寬度Length/Diameter保衛(wèi)細胞Guardcell長度/μmLength寬度/μmDiameter長度/寬度Length/Diameter葉綠體數(shù)/個ChloronlastnumberCK137.39a10.00±6.60c3.87±4.62c2.5821.75±0.48c20.35±0.90c1.0713～164x25.36b21.43±6.57b6.19±3.70b3.4638.80±4.76b39.37±2.07b0.9926～308x12.68c44.92±6.60a11.58±3.33a3.8862.54±4.86a49.05±1.92a1.2842～48

CK為未處理二倍體矮牽牛；2x為誘導(dǎo)后未加倍二倍體矮牽牛；4x為四倍體矮牽牛；8x為八倍體矮牽牛。不同小寫字母表示不同倍性間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

本研究采用無菌培養(yǎng)的方法，通過1% NaClO消毒矮牽牛種子后，使用秋水仙素處理不同時長，獲得了4x、8x倍性的變異植株，并獲得4x變異植株的最佳誘導(dǎo)條件為0.10%秋水仙素處理24 h，8x變異植株的最佳誘導(dǎo)條件為0.10%秋水仙素處理36 h。通過本研究方法在獲得較高誘導(dǎo)頻率的同時，也提高了8x變異植株的存活概率，此前未見矮牽牛8x變異植株的報道。雖然染色體數(shù)量檢測和流式細胞儀檢測是目前最有效的方法，但流式細胞儀具有快速、準(zhǔn)確、高效的優(yōu)點[15]。本研究通過流式細胞儀檢測單個變異植株不同部位材料，發(fā)現(xiàn)倍性具有一致性，出現(xiàn)的倍性均為4x和8x，表明本處理方法具有降低嵌合體和促進加倍的效果，獲得的變異植株嵌合率較低，這可能與消毒后表皮的損傷導(dǎo)致加倍效果增強有關(guān)。此外消毒后即時進行秋水仙素處理，與種子萌發(fā)時期一致，在細胞快速分裂時期可能更有利于多倍體的誘導(dǎo)。

通過流式細胞儀鑒定獲得的4x變異植株除第1～2片真葉葉尖變圓、葉寬增加外，其他表型不明顯，但8x變異植株與CK、2x和4x表型差異較大，表現(xiàn)為節(jié)間變短、葉肥厚深綠、生長緩慢，可以作為鑒別矮牽牛相應(yīng)倍性的重要依據(jù)[16]。多倍體植株通常具有氣孔變大、氣孔密度降低、保衛(wèi)細胞中葉綠體數(shù)量增加的特點，這些特征可以高效地辨別多倍體[17]。本研究中下表皮氣孔密度、氣孔的大小和形態(tài)特征也可以作為相應(yīng)倍性的鑒定條件，2x氣孔密度為137.39個/mm2，為4x的5.4倍，是8x的10.8倍；2x氣孔長度為10.00 μm， 4x是2x的2倍，8x是2x的4倍，因此，可以通過觀察變異植株下表皮氣孔特征快速進行倍性的鑒定。此外，本研究對不同倍性變異植株的葉綠素含量進行了檢測，表明倍性的增加導(dǎo)致葉綠素含量降低，倍性繼續(xù)加倍使葉綠素含量稍回升，與李柯[14]的研究結(jié)果一致，但與LI等[18]的結(jié)果相反，可能與檢測時間為無菌苗時期，高倍體生長相對緩慢有關(guān)。

本研究通過處理方法的改進，更高效地獲得了4x和8x矮牽牛，同時具有低嵌合率，對于觀賞園藝植物倍性育種研究具有重要意義。此外，通過流式細胞儀和氣孔觀察方法進行倍性的鑒定準(zhǔn)確性高，對于快速鑒定矮牽牛倍性植株具有重要指導(dǎo)意義。