張 雯，宋俊科，朱曉瑜，楊海光，王海港，許啟泰，杜冠華

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050；2.海南綠檳榔科技發(fā)展有限公司，海南 定安 571200)

阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種與年齡相關(guān)的，隱匿發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。AD的特征性病理變化為胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)，胞外β淀粉樣(amyloid β protein，Aβ)沉積，神經(jīng)元損傷及突觸減少。Aβ為AD病理進(jìn)程的關(guān)鍵因素，Aβ的神經(jīng)毒性及其誘導(dǎo)的蛋白級聯(lián)反應(yīng)對AD的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[2]。

研究表明，多酚類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化能力，能夠清除細(xì)胞內(nèi)自由基，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3-5]。此外，多酚類化合物中的某些成分還能夠減少Aβ生成、促進(jìn)Aβ消除，保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ神經(jīng)毒性[6-8]。以往的文獻(xiàn)中，對表沒食子兒茶素沒食子酸酯的研究較多，但對表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)研究較少。EGC作為一種多酚類化合物，廣泛存在于茶葉、檳榔等植物中，其是否能夠減輕Aβ對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，未見報道。因此，本實驗選擇SH-SY5Y細(xì)胞為研究對象，研究EGC對Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 EGC(HPLC>98%)， 購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，均購自Thermo Scientific公司；Aβ25-35、Hoechst 33258、MTT、氮乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，均購自Sigma公司；蛋白裂解液、β-actin抗體，均購自Cell Signaling Technology公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH )細(xì)胞毒性檢測試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)公司；核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2，Nrf2)、血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化還原酶1(NADPH：quinone oxidoreductase 1，NQO1)、過氧化物還原酶6(peroxiredoxin 6，Prdx6)、硫氧還蛋白-1(thioredoxin-1，Trx1)、Lamin B1抗體，均購自Santa Cruz；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.2儀器 蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、成像儀(Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices)；高內(nèi)涵分析儀(Thermo Scientific)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 Aβ25-35模型建立及分組細(xì)胞分為正常對照組、Aβ25-35損傷模型組、EGC低劑量組(Aβ25-35+5 μmol·L-1EGC)、EGC中劑量組(Aβ25-35+10 μmol·L-1EGC)、EGC高劑量組(Aβ25-35+20 μmol·L-1EGC)和陽性對照組(Aβ25-35+5 mmol·L-1NAC)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率實驗終點，吸除原有培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 0.5 g·L-1MTT溶液，培養(yǎng)4 h后吸除MTT，加入100 μL DMSO振蕩5 min，490 nm測定吸光度，計算細(xì)胞存活率。

1.5 LDH釋放率考察細(xì)胞活力實驗終點，取細(xì)胞上清，采用試劑盒檢測LDH，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的檢測實驗終點，傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，每孔加入50 μL終濃度為10 μmol·L-1DCFH-DA和10 μg·mL-1Hoechst 33258的DMEM/F12培養(yǎng)基。30 min后PBS洗滌3次，之后用高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測ROS水平。

1.7 氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測實驗終點，取細(xì)胞上清，采用試劑盒檢測SOD、MDA和GSH-Px，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 Western blot法檢測蛋白表達(dá)變化實驗終點，用胞核胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒，分別提取核蛋白和細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，置于5% BSA室溫封閉2 h。然后用稀釋的Nrf2、NQO-1、HO-1、Prdx6、Trx1抗體，于4 ℃孵育過夜。之后，TBST洗滌3次，再加入稀釋后二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后顯色成像。

1.9 免疫熒光法檢測Nrf2的核轉(zhuǎn)位實驗終點，吸除原培養(yǎng)液，PBS洗滌1次后，每孔加入50 μL多聚甲醛溶液固定15 min；PBS洗滌1次，每孔加入50 μL 0.3% Triton-100孵育10 min；PBS洗滌1次，每孔加入50 μL 5% BSA室溫封閉2 h；之后每孔加入50 μL Nrf2抗體稀釋液孵育過夜；回收一抗后，用PBS洗滌3次，然后加入熒光二抗稀釋液，37 ℃孵育1.5 h；PBS洗滌3次后，加入Hoechst 33258避光孵育30 min；最后PBS洗滌1次，置于高內(nèi)涵分析儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 EGC對Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響如Fig 1A所示，與正常對照組相比，3 μmol·L-1Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)。EGC(10、20 μmol·L-1)和抗氧化陽性藥NAC(5 mmol·L-1)能夠逆轉(zhuǎn)Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞造成的損傷，明顯提高細(xì)胞存活率(P<0.05，P<0.01)。如Fig 1B所示，Aβ25-35明顯提高SH-SY5Y細(xì)胞LDH的釋放(P<0.01)，EGC(5、10、20 μmol·L-1)和NAC(5 mmol·L-1)能夠明顯降低Aβ25-35誘導(dǎo)的LDH釋放(P<0.05，P<0.01)。

2.2 EGC抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS的產(chǎn)生如Fig 2所示，3 μmol·L-1Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞后，細(xì)胞中ROS釋放量明顯增加(P<0.01)，10、20 μmol·L-1EGC均能明顯抑制Aβ25-35損傷導(dǎo)致的ROS釋放(P<0.01)。

2.3 EGC調(diào)節(jié)Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的釋放如Tab 1所示，與正常對照組相比，Aβ25-35損傷導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.01)。EGC能夠明顯提高SOD和GSH-Px活性，減少MDA含量，抑制氧化應(yīng)激損傷。

Fig 1 Effects of EGC on Aβ25-35-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells

Fig 2 Effects of EGC on Aβ25-35-induced ROS accumulation in SH-SY5Y cells

Tab 1 Effects of EGC on SOD, GSH-Px, MDA in Aβ25-35-induced SH-SY5Y cells

2.4 EGC對Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響采用Western blot和免疫熒光檢測SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位情況，結(jié)果如Fig 3所示，正常SH-SY5Y細(xì)胞核中Nrf2水平較低，Aβ25-35損傷后SH-SY5Y細(xì)胞核中Nrf2蛋白水平略有增加。EGC干預(yù)能夠明顯增強(qiáng)Aβ25-35損傷后Nrf2的核轉(zhuǎn)位。

2.5 EGC對Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞Nrf2下游抗氧化蛋白表達(dá)的影響采用Western blot檢測SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Nrf2下游抗氧化蛋白的表達(dá)情況，如Fig 4所示，EGC干預(yù)后能夠明顯增強(qiáng)Aβ25-35損傷后Nrf2誘導(dǎo)的II相輔酶HO-1、NQO1、Prdx6和Trx1的表達(dá)，提高細(xì)胞的抗氧化能力。

Fig 3 Effects of EGC on Nrf2 levels in Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells

Fig 4 Effects of EGC on HO-1, NQO1, Prdx6, Trx1 levels in Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells

3 討論

本實驗采用Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞模型，探討EGC對Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。3 μmol·L-1Aβ25-35損傷SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率明顯降低，LDH釋放明顯增加。EGC能夠減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率，降低LDH釋放。

氧化應(yīng)激損傷是指機(jī)體抗氧化水平低于氧化水平，氧化中間產(chǎn)物在體內(nèi)聚積，打破抗氧化與氧化平衡，造成機(jī)體損傷，誘發(fā)多種疾病[9-10]。研究表明，氧化應(yīng)激在AD病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[11-12]。Nrf2是細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平至關(guān)重要[14-15]。本文實驗結(jié)果表明，Aβ25-35損傷能夠明顯增加SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平，而EGC可以明顯降低Aβ25-35誘增的細(xì)胞內(nèi)ROS。正常生理狀態(tài)下，Nrf2-Keap1處于抑制狀態(tài)，Aβ25-35損傷后SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平明顯增加，Nrf2-Keap1被激活發(fā)生解離，解離后的Nrf2蛋白在細(xì)胞核中聚集，促進(jìn)SOD、GSH-Px及HO-1等下游產(chǎn)物增多[16-17]。

SOD在新陳代謝中起重要作用，能夠特異性清除氧自由基，使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。GSH-Px也可以減少過氧化物在細(xì)胞內(nèi)堆積，維持細(xì)胞正常生理功能。對抗氧化酶水平，Aβ25-35損傷后明顯降低SH-SY5Y細(xì)胞中SOD和GST-Px的活性，而EGC可以明顯升高SOD和GSH-Px活性。MDA是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，可影響線粒體呼吸鏈中關(guān)鍵酶的活性，常用于評估氧化應(yīng)激反應(yīng)程度和自由基水平[13]。本實驗結(jié)果表明，與對照組相比，Aβ25-35損傷導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA積累，而EGC可以明顯降低Aβ25-35誘增的MDA含量。采用Western blot和免疫熒光檢測了SH-SY5Y細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)。正常SH-SY5Y細(xì)胞核中Nrf2呈弱陽性表達(dá)，Aβ25-35損傷使細(xì)胞核中Nrf2蛋白水平略有增加，但與正常對照組相比差異不明顯。EGC干預(yù)能夠明顯增強(qiáng)Aβ25-35損傷后Nrf2核轉(zhuǎn)位。檢測Nrf2-Keap1通路下游II相輔酶的表達(dá)水平表明，EGC處理能夠明顯增強(qiáng)Aβ25-35損傷后Nrf2誘導(dǎo)的II相輔酶HO-1、NQO1、Prdx6和Trx1的表達(dá)。SOD、GSH-Px、HO-1、NQO1、Prdx6和Trx1協(xié)同清除ROS，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，表沒食子兒茶素能夠激活Nrf2-Keap1通路，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中相關(guān)酶的活性，阻斷Aβ25-35導(dǎo)致的ROS產(chǎn)生，提高SOD和GSH-Px活性，減少MDA含量，提高機(jī)體抗氧化水平，改善氧化損傷，降低Aβ25-35的神經(jīng)毒性。