孫樹平 劉志偉 李 京 何麗麗

(1. 武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023；2. 湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點實驗室，湖北 武漢 430023；3. 武漢輕工大學大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，湖北 武漢 430023；4. 武漢華康臣生物科技有限公司，湖北 武漢 430023)

辣椒又名海椒、番椒、秦椒等，屬一年生草本植物[1]，是β-胡蘿卜素、辣椒素、玉米黃質(zhì)、葉黃素和VC等營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源[2]。此外，它還富含酚類和黃酮類化合物[3]。新鮮紅辣椒含有高水平的抗壞血酸，其含量居各類蔬菜含量之首[4]，100 g紅辣椒VC的供應量相當于目前推薦日攝入量(RDA)的100%(60 mg/100 g)[5]。紅辣椒中總類胡蘿卜素含量(30.37 mg/100 g鮮重)是胡蘿卜和西紅柿的4倍左右[6]。紅辣椒除了作為蔬菜和香料被世界上大部分的人口食用外，還是用于治療各種人類疾病的傳統(tǒng)草藥的重要組成部分。因此，為了能夠進一步開發(fā)紅辣椒的功能性成分，需要對其加工手段進行研究[7]。

酵素(Fermented plant extract，F(xiàn)PE)是以一種或多種植物為原料[8]，經(jīng)多種益生菌發(fā)酵而產(chǎn)生的一種功能性食品。FPE含有脂肪酶、超氧化物歧化酶、香氣成分、乳酸、醋酸及少量乙醇等多種活性物質(zhì)[9-11]，具有清理腸道[12]、抗炎癥、解毒[13]、抗菌[14]、止血[15]等保健功效。Mi等[16]研究發(fā)現(xiàn)在紅辣椒中接種類布式乳桿菌能夠顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中醇、酯、烴類、內(nèi)酯、吡嗪和萜類等物質(zhì)的含量，使所得的產(chǎn)品具有很好的感官評價；邵偉等[17]的研究表明酵母菌和醋酸菌的加入能夠顯著提高辣椒醬的醇香和綿酸味；王微[18]60-65研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌的加入使辣椒產(chǎn)品產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)。

從以上研究來看，目前用于辣椒發(fā)酵的多為乳酸菌，酵母菌和醋酸菌。但是未見用植物乳桿菌和釀酒酵母；植物乳桿菌和醋酸菌；植物乳桿菌、釀酒酵母和醋酸菌等混菌發(fā)酵劑來發(fā)酵辣椒的。在發(fā)酵過程中，適量酵母菌的存在可產(chǎn)生醇類物質(zhì)，該類物質(zhì)與乳酸菌、醋酸菌的發(fā)酵產(chǎn)物有機酸結(jié)合可促進多種風味物質(zhì)的形成。因此研究擬以恩施富硒辣椒為原料，以前期試驗篩選出的植物乳桿菌、釀酒酵母和醋酸菌為研究對象，從中選擇2組發(fā)酵劑L1(植物乳桿菌、釀酒酵母)和L2(植物乳桿菌、釀酒酵母和醋酸菌)與自然發(fā)酵L0來制作辣椒酵素，通過比較30 d內(nèi)3組辣椒酵素SOD酶活力、脂肪酶活力、總酸、酒精度等主要質(zhì)量指標的變化規(guī)律，篩選出一組最適合辣椒酵素發(fā)酵的益生菌復合發(fā)酵劑。為后期辣椒酵素最佳發(fā)酵工藝參數(shù)的確立，辣椒酵素的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒：湖北省恩施市建始縣；

植物乳桿菌、釀酒酵母、醋酸桿菌：廣東省微生物菌種保藏中心；

MRS瓊脂、MRS肉湯、麥芽汁瓊脂、YPDA培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；

超氧化物歧化酶測試盒、脂肪酶測試盒：南京建成研究所。

1.2 主要儀器設備

恒溫磁力攪拌器：524G型，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；

生物傳感器分析儀：S-10型，深圳市西爾曼科技有限公司；

超純水機：PCR-B-SF-10型，成都品成科技有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，上?？茽杻x器設備有限公司；

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GHP-9050型，上海齊欣科學儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-70A型，上海博訊實業(yè)有限公司；

單人凈化工作臺：SW-CJ-1G型，蘇州凈化設備有限公司；

多功能酶標儀：EnSpire?2300型，珀金埃爾默股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 活化菌株 在無菌條件下，用無菌槍頭吸取200～300 μL的無菌水,滴入安瓿瓶中,并用無菌槍頭反復吹打，使菌粉呈懸浮狀。用無菌接種環(huán)挑取一定量的菌懸液，以劃線法接種于指定固體培養(yǎng)基中，重復幾個平板[19]。最后將平板分別置于指定恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌種活化24 h后挑長勢良好的菌落分別接種于指定液體培養(yǎng)基中，進行第2代活化。24 h后將活化好的菌懸液按照10%的接種量接種于新的液體培養(yǎng)基中，實時監(jiān)測3種菌種的生長曲線，確定各菌種最佳接種時間。

1.3.2 辣椒酵素樣品的制備 選用色澤鮮亮、表皮完整且無病蟲害的新鮮辣椒作為材料。將洗凈表皮污漬以及殘留農(nóng)藥的辣椒瀝干后切成0.5 cm長的辣椒塊，放置于超凈工作臺上紫外殺菌30 min后備用。取殺菌后的辣椒塊300 g均分于L0、L1、L2 3個發(fā)酵罐中。L0按照料液比1∶1(g/mL)的比例加入濃度為5%的鹽水；L1在L0的基礎上以107CFU/mL水平接種1.5 mL/100 g的植物乳桿菌和0.5 mL/100 g的釀酒酵母；L2在L1的基礎上也同樣以107CFU/mL水平再接種0.6 mL/100 g的醋酸菌。接種處理后，將L0、L1、L2 3個發(fā)酵罐均置于28 ℃恒溫條件下發(fā)酵，每隔5 d取一次樣，取至第30天。所有樣品都保存在-80 ℃左右冰箱中，在分析之前，樣品在冰箱中融化，所有試驗均一式3份進行。

1.3.3 總酸和pH值的測定 參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》對樣品進行總酸含量的測定；pH值采用pH計法進行測定。

1.3.4 酒精度的測定 選擇乙醇酶膜為活性材料[20-21]，采用生物傳感分析儀對辣椒酵素進行酒精含量的測定。試驗過程中用微量移液槍吸取0.5 g/L的乙醇標準液25 μL 進行定標，根據(jù)儀器提示決定定標次數(shù)，待儀器提示進樣時方可進樣。酵素液中的乙醇在乙醇酶膜的作用下會迅速產(chǎn)生過氧化氫[22]。H2O2通過氧化還原反應產(chǎn)生電流，進而產(chǎn)生電壓，乙醇的濃度可以通過電壓值的大小來衡量。進而得出樣品中酒精度含量。

1.3.5 感官評定 請10位有感官評價經(jīng)驗的人按照感官評分標準對辣椒酵素進行感官評分，并取10人平均分作為最終得分。感官評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory Scoring Criteria

1.3.6 超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定 采用WST-1法。吸取WST-1[2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt]母液20 μL和緩沖液4 mL混勻制成WST-1工作液，另取15 μL酶貯備液與150 μL酶稀釋液混勻制成酶工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。然后取WST-1工作液200 μL加入96孔板中，對照孔中加入20 μL雙蒸水和20 μL酶工作液；對照空白孔中加入20 μL雙蒸水和20 μL酶稀釋液；測定孔中加入20 μL不同濃度的酵素液和20 μL酶工作液；測定空白孔中加入20 μL不同濃度的酵素液和20 μL酶稀釋液。輕輕混勻，37 ℃孵育20 min 后立即用酶標儀測定各孔在450 nm下的吸光值。對照、對照空白、測定空白孔只需做1～2孔，樣品測定孔設置3～6孔。最后選取抑制率在50%左右的濃度進行批量試驗。按式(1)、(2)計算樣品SOD抑制率和SOD酶活力。

(1)

式中：

IC——SOD抑制率，%；

A0——200 μL工作液，20 μL雙蒸水與20 μL酶工作液的吸光值；

A1——200 μL工作液，20 μL雙蒸水與20 μL酶稀釋液的吸光值；

A2——200 μL工作液，20 μL酵素液與20 μL酶工作液的吸光值；

A3——200 μL工作液，20 μL酵素液與20 μL酶稀釋液的吸光值；

(2)

式中：

EA——SOD酶活力，U/mL；

0.24——反應液總體積，mL；

0.02——加樣體積，mL；

n——樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.3.7 脂肪酶(LPS)酶活力的測定 采用酶比色法。LPS在共脂肪酶和?；敲撗跄懰岬拇嬖谙履軌蛩?,2-鄰-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6′-甲基試鹵靈)-酯生成1,2-鄰-二月桂宗甘油、戊二酸和6′-甲基試鹵靈。當6′-甲基試鹵靈酯降解為6′-甲基試鹵靈時，此紅色染料引起的吸光度的上升速率與樣品中LPS活力呈正比。因此在570 nm 波長下，通過連續(xù)監(jiān)測1～2 min吸光值的變化，按式(3)計算酵素液中LPS的活力。

(3)

式中：

EA——LPS活力，U/L；

Δ樣本/min——單位時間內(nèi)酵素液測定孔吸光值的變化率；

Δ空白/min——單位時間內(nèi)空白測定孔吸光值的變化率；

Δ校準品/min——單位時間內(nèi)校準品測定孔吸光值的變化率；

45.8——校準品活力，U/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel和SPSS Statistics 17.0顯著性方差分析后(P<0.05)，用Origin 2018 64Bit 軟件進行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種活化

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，3種菌種的生長曲線均呈先增加后平穩(wěn)的趨勢。而且在3～7 h，3種菌種均處于指數(shù)生長中后期，此時菌體活力好且數(shù)量多，適合作為接種物；圖1顯示3種菌種最佳培養(yǎng)時間分別為植物乳桿菌7 h，釀酒酵母6 h，醋酸菌5 h。因此，將第2代活化后的3種菌種分別活化7，6，5 h后接種于辣椒酵素中。

2.2 辣椒酵素發(fā)酵過程中總酸含量的變化趨勢

食品中的總酸主要包括乙酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸等[23]，是評價產(chǎn)品品質(zhì)及風味的一項重要指標。圖2是3組辣椒酵素發(fā)酵過程中總酸含量的變化情況。由圖2可知，在發(fā)酵過程中，3組辣椒酵素的總酸含量的變化趨勢一致，但在不同的時間段，總酸含量有所差異。發(fā)酵前10 d，L1、L2產(chǎn)酸速度快且產(chǎn)酸量多；發(fā)酵10～15 d時，微生物利用有機酸使總酸含量部分減少；發(fā)酵15 d后，L1、L2的總酸含量分別為34.88，33.57 g/L，較L0分別提高了36.53%，31.42%；發(fā)酵15～30 d時，由于發(fā)酵底物與發(fā)酵環(huán)境的影響，大部分微生物的生長受到抑制，3組辣椒酵素的總酸含量不再變化。因此，從產(chǎn)酸量來看，L1更適合辣椒酵素的發(fā)酵。

圖1 3種菌種的生長曲線Figure 1 Growth curves of three strains

圖2 辣椒酵素發(fā)酵過程中總酸含量的變化Figure 2 Changes of total acid content in capsicum fermentation

2.3 辣椒酵素發(fā)酵過程中pH的變化趨勢

如圖3所示，隨著發(fā)酵時間的延長，3組辣椒酵素的pH值呈現(xiàn)先下降后上升而后穩(wěn)定的趨勢。且L1、L2的pH值明顯低于L0。發(fā)酵初期，釀酒酵母和植物乳桿菌占優(yōu)勢，菌種生長較快且產(chǎn)酸量較多，pH值迅速下降；而后菌種濃度增加且利用部分有機酸，使得pH值緩緩上升[24]。發(fā)酵15 d后，L1、L2的pH值分別為3.81，3.78，大部分雜菌的生長受到抑制[25]。因此，從產(chǎn)酸及食品安全角度來看，L1、L2均適宜辣椒酵素的發(fā)酵。

2.4 辣椒酵素發(fā)酵過程中酒精含量的變化

如圖4所示，3組辣椒酵素酒精含量的變化趨勢大致相同，均在發(fā)酵第10天時酒精含量達到最大值。在整個發(fā)酵過程中，L0的酒精含量始終高于L1、L2。辣椒發(fā)酵第10天，L0的酒精含量達到最大值0.110 g/L，而L1、L2酒精含量分別為0.042，0.028 g/L。這可能是L0在發(fā)酵初期酵母菌處于優(yōu)勢，產(chǎn)生酒精的速度相對較快；而L1、L2由于乳酸菌占主體，對酵母菌的生長有所抑制，使得L1、L2的酒精含量低于L0。發(fā)酵第15天時，L0、L1、L2 3組辣椒酵素的酒精含量分別為0.079，0.023，0.022 g/L。其中L1、L2的酒精含量適中，使發(fā)酵體系有微微的酒香味，也不失辣椒酵素的風味。

圖3 辣椒酵素發(fā)酵過程中pH值的變化趨勢Figure 3 Change trend of pH value in capsicum fermentation

圖4 辣椒酵素發(fā)酵過程中酒精含量的變化Figure 4 Changes of alcohol content in capsicum fermentation

2.5 辣椒酵素樣品的感官評價

由表2可知，在整個發(fā)酵過程中，3組辣椒酵素的感官評分均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。L0、L1、L2分別在發(fā)酵20，15，15 d時達到最高分(81.76±1.93，88.75±0.88，88.71±1.45)。由此可知，菌種的添加不僅可以縮短辣椒酵素的發(fā)酵時間，而且可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)。其中，發(fā)酵相同時間后的辣椒酵素在外觀色澤方面并無顯著差異(P<0.05)，這可能是所用原料以及前期處理方式均相同[18]37-38。結(jié)合圖2、4可知，發(fā)酵第10天，3組辣椒酵素的產(chǎn)酸量和酒精含量均達到最高，但仍具有較淡的辣椒生腥味；辣椒酵素特有的風味還未形成。在風味和口感上都還屬于未發(fā)酵好的產(chǎn)品，其感官評分也相對較低。發(fā)酵第15天，L1、L2的總酸含量分別為34.82，33.59 g/L，酒精度分別為0.23，0.22 g/L。其總酸含量及酒精度相較于第10 天雖然有所降低，但在風味上已無辣椒的生腥味；且具有辣椒酵素特有的醬香氣和酸辣昧，同時還帶有淡淡的醇香。此時L1、L2感官評分均達到發(fā)酵周期的最高分[(88.75±0.88)，(88.71±1.45)]。因此，結(jié)合產(chǎn)酸量、酒精度和感官評分來看，L1、L2均適合辣椒酵素的發(fā)酵。

表2 辣椒酵素樣品的感官評價?Table 2 Sensory evaluation of pepper enzyme samples

? 字母不同表示同一時間點同一項目之間差異顯著。

2.6 辣椒酵素發(fā)酵過程中SOD活力的變化

3種發(fā)酵方式所得的辣椒酵素在發(fā)酵過程中SOD活力的變化見圖5。由圖5可知，在發(fā)酵過程中，3組辣椒酵素SOD活力隨著發(fā)酵時間的延長呈先升高后下降的趨勢。發(fā)酵第5天，3組辣椒酵素SOD活力均達到最高，但是從感官角度來看，辣椒酵素還未發(fā)酵完成。發(fā)酵15 d 后，L1的SOD活力為88.71 U/mL，顯著高于L0(81.31 U/mL)和L2(5.25 U/mL)。這可能是L0與L2發(fā)酵過程中菌種之間或菌種與發(fā)酵底物之間存在著競爭關(guān)系；也有可能是L0、L2的發(fā)酵環(huán)境使得產(chǎn)生的SOD有部分失活。

2.7 辣椒酵素發(fā)酵過程中LPS活力的變化

圖6是3種發(fā)酵方式的辣椒酵素在發(fā)酵過程中LPS活力的變化趨勢。由圖6可知，隨著發(fā)酵時間的延長，3組辣椒酵素LPS活力呈先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵10 d后，L1、L2的LPS活力顯著高于L0(P<0.05)，且L1、L2在發(fā)酵前15 d，LPS活力呈上升趨勢。發(fā)酵第15天時，L1的LPS活力最高為45.75 U/L，L1、L2的LPS活力相較于L0分別提高了99.22%，96.27%，而且此時L1的感官評分也達到最高值(88.75±0.88)。因此，從脂肪酶活力角度來看，L1更適合辣椒酵素的發(fā)酵。

字母不同表示同一時間點3組辣椒酵素之間的SOD活力差異顯著，P<0.05

圖5 辣椒酵素發(fā)酵過程中SOD活力的變化

Figure 5 Changes of superoxide dismutase activity in capsicum fermentation

字母不同表示同一時間點3組辣椒酵素之間的脂肪酶活力差異顯著，P<0.05

圖6 辣椒酵素發(fā)酵過程中脂肪酶活力的變化

Figure 6 Changes of lipase activity in capsicum fermentation

3 結(jié)論

試驗通過觀察辣椒酵素發(fā)酵過程中總酸、酒精度、pH、感官、酶活力指標的變化規(guī)律，篩選出適宜辣椒酵素發(fā)酵的益生菌復合發(fā)酵劑。綜合以上結(jié)果可知：在以辣椒為原料，采用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)辣椒酵素時，選用植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵得到的辣椒酵素品質(zhì)較好。將植物乳桿菌和釀酒酵母以3∶1(體積比)的比例、2 mL/100 g 的接種量接入發(fā)酵罐中，28 ℃條件下發(fā)酵15 d，得到的辣椒酵素的感官評分最高為(88.75±0.88)。此時LPS活力最高為45.75 U/L，SOD活力為88.71 U/mL，顯著高于L0、L2。因此，選用植物乳桿菌和釀酒酵母來發(fā)酵生產(chǎn)辣椒酵素，可有效改善辣椒酵素的色澤、香氣、功效以及口感。

試驗僅完成了FPE生產(chǎn)中的一個重要環(huán)節(jié)—微生物的篩選，但是針對其發(fā)酵條件以及風味物質(zhì)方面還未進行研究。發(fā)酵條件的優(yōu)化主要以感官評分和生物活性物質(zhì)為評價指標，并用頂空固相微萃取，GC-MS對發(fā)酵成熟的辣椒酵素進行風味物質(zhì)的進行測定分析，以期能得到一個發(fā)酵成熟的辣椒酵素產(chǎn)品，為后期辣椒酵素產(chǎn)品企業(yè)標準的建立提供一些數(shù)據(jù)和理論支持。