金順順 姚 康 印遇龍 康寶聚 黎育穎 王 鵬

(1. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate, AKG)是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵中間體[1]，也是谷氨酰胺脫氨(谷氨酰胺水解)的產(chǎn)物。其在臨床和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)方面發(fā)揮著有益的作用，能改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能、調(diào)節(jié)能量代謝、提高動(dòng)物免疫力、促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成等[2]。體外研究[3]發(fā)現(xiàn)，AKG能通過(guò)促進(jìn)豬腸道上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成和降低蛋白質(zhì)的分解來(lái)促進(jìn)豬腸道上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。亮氨酸(leucine，LEU)是必須氨基酸，也是支鏈氨基酸之一[4]，還能在動(dòng)物體內(nèi)影響脂質(zhì)代謝，主要是通過(guò)抑制脂肪的合成[5-7]以及促進(jìn)脂肪的分解[8-10]來(lái)發(fā)揮作用。據(jù)報(bào)道[11]，亮氨酸能調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物骨骼肌蛋白質(zhì)的代謝，從而達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用。肖定福等[12]研究表明，在動(dòng)物體內(nèi)谷氨酰胺向AKG轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，首先谷氨酰胺由磷酸鹽活化谷氨酰胺酶反應(yīng)產(chǎn)生谷氨酸，再通過(guò)線粒體中谷氨酸脫氫酶的作用或通過(guò)轉(zhuǎn)胺作用在細(xì)胞溶膠或線粒體中產(chǎn)生AKG，這個(gè)代謝過(guò)程中，亮氨酸是谷氨酸脫氫酶的激活劑，因此，在生物體的代謝過(guò)程中亮氨酸和AKG存在協(xié)同作用。這預(yù)示著亮氨酸和AKG可能對(duì)機(jī)體內(nèi)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成代謝有協(xié)同作用。而加強(qiáng)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成是解決肌肉萎縮的重要一步[13]。骨骼肌蛋白的合成已被證明受到不同營(yíng)養(yǎng)和生理因素的影響，如氨基酸[14]、葡萄糖[15]、運(yùn)動(dòng)[16]、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor -1，IGF-I)和胰島素[17]等。綜上所述，亮氨酸和AKG兩者都對(duì)小鼠的生長(zhǎng)性能和骨骼肌產(chǎn)生影響，且兩者在生物體內(nèi)代謝過(guò)程中存在協(xié)同作用，然而聯(lián)合使用AKG 和亮氨酸對(duì)健康小鼠生長(zhǎng)以及骨骼肌的影響，目前未見(jiàn)報(bào)道。因此試驗(yàn)探討了亮氨酸和AKG聯(lián)合使用對(duì)小鼠的體重，血清生化指標(biāo)、器官指數(shù)和骨骼肌纖維的影響，以期為運(yùn)用亮氨酸和AKG改善蛋白質(zhì)降解引起的肌肉萎縮提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

AKG：有效成分含量為99.5%，武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；

亮氨酸：有效成分含量為98%，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

冷凍型大容量離心機(jī)：4K15型，德國(guó)Sigma公司；

生化分析儀：cobas c311型，瑞士羅氏公司；

電子天平：GL124-1SCN型，深圳市盛美儀器有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物：4周齡的雄性C57BL/6小鼠，體重(12.76±0.67) g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

小鼠專(zhuān)用飼料：主要營(yíng)養(yǎng)水為粗蛋白質(zhì)(CP)20.50%、粗脂肪(EE)4.62%、鈣(Ca)1.23%、磷(P)0.91%、賴(lài)氨酸(Lys)1.30%、蛋氨酸+胱氨酸(Met+Cys)0.68%、亮氨酸(Leu)1.40%，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將40只C57BL/6小鼠于21～25 ℃、相對(duì)濕度60%的飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組10只。對(duì)照組：水瓶中加入正常的飲水；Ⅰ組：水瓶中加入1.0%的AKG(每千克水中加入10 g AKG，并調(diào)節(jié)pH值至7.4)；Ⅱ組：水瓶中加入1.8%的亮氨酸(每千克水中加入18 g亮氨酸)；Ⅲ組：水瓶中加入1.8%的亮氨酸和1.0%的AKG(每千克水中加入18 g亮氨酸和10 g AKG，并調(diào)節(jié)pH值至7.4)。試驗(yàn)期35 d。

1.3 樣品的采集

試驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠禁食(自由飲水)12 h，對(duì)所有小鼠進(jìn)行眼球摘除采血，將采集的血液置于離心管中，低溫(4 ℃)下靜置30 min，離心10 min (4 ℃、3 000 r/min)，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采血后，?duì)小鼠采用脊椎脫臼法處死，迅速取出心臟和肝臟。將心臟和肝臟用預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分后稱(chēng)重；取腹部脂肪、肩周脂肪、腎周脂肪、皮下脂肪、趾伸長(zhǎng)肌、腓腸肌稱(chēng)重并留用。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 體重 在正式試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)利用電子天平對(duì)每只小鼠分別進(jìn)行稱(chēng)重，分析體重變化。

1.4.2 器官指數(shù)的測(cè)定 在試驗(yàn)結(jié)束后屠宰小鼠，取心臟、肝臟、腹部脂肪、腎周脂、皮下脂肪、腓腸肌、趾長(zhǎng)伸肌稱(chēng)重并記錄。心臟、肝臟、腹部脂肪、腎周脂、皮下脂肪指數(shù)的計(jì)算參照丁曉東等[18]的方法，腓腸肌和趾伸長(zhǎng)肌指數(shù)的計(jì)算參照石鶴坤等[19]的方法。

1.4.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定 采用全自動(dòng)血液生化分析儀對(duì)總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、血氨(BA)進(jìn)行分析。每組10個(gè)重復(fù)。

1.4.4 腓腸肌橫截面積的測(cè)定 腓腸肌橫截面積的測(cè)定于腓腸肌統(tǒng)一位置切取組織塊(0.6 cm×0.6 cm×0.6 cm)浸入10%中性福爾馬林溶液中固定，經(jīng)脫水、透蠟、包埋，切片后，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，每個(gè)切面選取10個(gè)圖片，然后用Image-Pro plus 6.0軟件分析肌纖維的橫截面積(Cross Section Area, CSA)。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

試驗(yàn)結(jié)果用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示，采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，模型顯著時(shí)采用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AKG和亮氨酸對(duì)小鼠體重變化的影響

由表1可知，在連續(xù)飼喂35 d中，各組小鼠均未出現(xiàn)任何異常反應(yīng)。在試驗(yàn)結(jié)束第1周，3個(gè)處理對(duì)小鼠的體重均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)；在第14天和第21天時(shí)，Ⅰ組小鼠體重顯著高于Ⅲ組(P<0.05)，其他各組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；試驗(yàn)第28天時(shí)，Ⅲ組小鼠體重顯著低于Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)，其他各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)第35天時(shí)，Ⅲ組小鼠的體重顯著低于Ⅰ組、Ⅱ組和對(duì)照組(P<0.05)，其他各組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。小鼠飲水中添加亮氨酸和AKG較其他3組體重有降低的趨勢(shì)。原因可能是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)由磷酸鹽活化谷氨酰胺酶反應(yīng)所產(chǎn)生的谷氨酸能通過(guò)線粒體中谷氨酸脫氫酶的作用或通過(guò)轉(zhuǎn)胺作用在細(xì)胞溶膠或線粒體中產(chǎn)生AKG，在這個(gè)代謝過(guò)程中，亮氨酸是谷氨酸脫氫酶的激活劑，因此可以強(qiáng)化AKG的作用。另外AKG也可參與脂質(zhì)代謝和肉堿的形成[20]。而肉堿是一種作為脂肪酸載體進(jìn)入細(xì)胞線粒體的分子，在線粒體中可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹痉纸獯x從而起到降低體重的作用。

2.2 AKG和亮氨酸對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，Ⅲ組血清TP、ALB和ALP含量顯著升高(P<0.05)，BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)，Ⅱ組血清BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)，Ⅰ組血清BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組血清ALB含量顯著提高(P<0.05)，Ⅱ組血清UA含量顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組血清ALB含量顯著升高(P<0.05)，BUN和UA含量顯著降低(P<0.05)。各組間其他血清生化指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。血清中TP的含量可直接反映蛋白質(zhì)的吸收情況以及機(jī)體體液免疫的健康狀況，從而間接反映機(jī)體對(duì)外界不良因素的抵抗能力，血清TP含量高說(shuō)明蛋白質(zhì)合成作用、氮沉積及機(jī)體對(duì)外界不良因素的抵抗能力增強(qiáng)[21]。聯(lián)合運(yùn)用亮氨酸和AKG能顯著升高血清ALB和TP的含量，表明兩者可提高機(jī)體的體液免疫能力及肝臟對(duì)蛋白質(zhì)的合成作用。ALP是遺傳標(biāo)記的同工酶，其活性的高低能反映骨組織生長(zhǎng)、鈣磷代謝、脂肪代謝狀況[22]。聯(lián)合運(yùn)用兩者能顯著提高血清ALP的活性，可能與AKG可顯著提高粗蛋白、鈣和磷的表觀消化率有關(guān)[23]。同時(shí)聯(lián)合運(yùn)用兩者有利于氨基酸平衡，促進(jìn)蛋白質(zhì)代謝以及降低血清中尿素和UA的含量[24]。

表1 試驗(yàn)期間各組小鼠體重的變化?Table 1 Change of body weight of mice from different groups during the whole experimental period (n=10) g

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 AKG和亮氨酸對(duì)小鼠器官指數(shù)的影響

由表3可知，Ⅲ組心臟指數(shù)顯著高于對(duì)照組、Ⅰ組和Ⅱ組(P<0.05)。其他各組間器官指數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。聯(lián)合運(yùn)用亮氨酸和AKG能顯著提高心臟指數(shù)，表明兩者聯(lián)合運(yùn)用能減少外界不良因素對(duì)心臟的損傷，促進(jìn)心臟的生長(zhǎng)[25]。

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 AKG和亮氨酸對(duì)小鼠脂肪指數(shù)和肌肉指數(shù)的影響

由表4可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，Ⅱ組和Ⅲ組腹部脂肪指數(shù)顯著降低(P<0.05)，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組腓腸肌指數(shù)顯著增加(P<0.05)，Ⅲ組趾長(zhǎng)伸肌指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組腓腸肌指數(shù)和趾長(zhǎng)伸肌指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組腓腸肌指數(shù)和趾長(zhǎng)伸肌指數(shù)顯著增加(P<0.05)。其他各組間脂肪指數(shù)和肌肉指數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。聯(lián)合運(yùn)用亮氨酸和AKG能顯著提高腓腸肌指數(shù)和趾伸長(zhǎng)肌指數(shù)，說(shuō)明1.0% AKG 和1.8%亮氨酸聯(lián)合添加在促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)方面有協(xié)同作用。

2.5 AKG和亮氨酸對(duì)小鼠腓腸肌橫截面積的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)；與Ⅰ組相比，Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組的小鼠腓腸肌橫截面積顯著增加(P<0.05)。其他各組間小鼠腓腸肌橫截面積均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。具體的原因可能是：① AKG能促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成和抑制骨骼肌蛋白質(zhì)的降解，從而使得肌纖維的橫截面積增大；② 亮氨酸也能促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，從而使得肌纖維的橫截面積增大；③ 在谷氨酰胺、谷氨酸和AKG的相互轉(zhuǎn)化過(guò)程中，亮氨酸促進(jìn)谷氨酸向AKG的轉(zhuǎn)換，而兩者之間存在的協(xié)同作用加速了肌纖維蛋白質(zhì)的合成，從而使得肌纖維的橫截面積增加。

表4 AKG和亮氨酸對(duì)小鼠脂肪指數(shù)和肌肉指數(shù)的影響?Table 4 Effect of AKG and leucine on fat index and muscle index of mice (n=10) %

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表5AKG和亮氨酸對(duì)小鼠腓腸肌橫截面積的影響?

Table5EffectofAKGandleucineoncrosssectionalareaofgastrocnemiusmuscleofmice(n=10)

組別腓腸肌橫截面積/μm2對(duì)照組1 873.08±124.16c試驗(yàn)組Ⅰ2 289.84±101.02b試驗(yàn)組Ⅱ2 151.39±78.89b試驗(yàn)組Ⅲ2 751.94±81.13a

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)C57BL/6 雄性小鼠研究，比較亮氨酸和AKG對(duì)小鼠體重和骨骼肌發(fā)育的影響，結(jié)果表明亮氨酸和AKG聯(lián)合運(yùn)用具有抑制小鼠體重增加，促進(jìn)心臟生長(zhǎng)，加強(qiáng)器官對(duì)脂肪的利用和增加腓腸肌纖維的重量和橫截面積的作用。研究為提高肌纖維橫截面積預(yù)防肌肉萎縮提供了新的思路，然而其調(diào)節(jié)骨骼肌代謝的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。