李佳洋 田澤 李威濤 劉學(xué)群 王春臺(tái) 譚艷平

摘要[目的]驗(yàn)證新型細(xì)胞質(zhì)不育系L-orfH79與其同核異質(zhì)的近等基因系HL-CMS YTA的區(qū)別。[方法]用orfH79和orf290這2種分子標(biāo)記對(duì)L-orfH79和YTA進(jìn)行分子鑒定，并比較其花粉染色特性、花粉育性、結(jié)實(shí)率及orfH79表達(dá)量。[結(jié)果]分子標(biāo)記鑒定結(jié)果顯示L-orfH79只含有不育基因orfH79、不含有orf290，YTA同時(shí)含有orfH79和orf290。L-orfH79花粉的淀粉沉積比YTA更少，L-orfH79花粉大小均勻，而YTA的花粉形態(tài)不一。L-orfH79花粉育性、套袋結(jié)實(shí)率及自然結(jié)實(shí)率（都低于10%）略高于YTA（都低于5%）。當(dāng)L-orfH79中引入恢復(fù)基因Rf5或者Rf6后花粉形態(tài)和顏色都恢復(fù)正常。抽穗期L-orfH79劍葉中的 orfH79表達(dá)量低于YTA，在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后會(huì)減少orfH79的表達(dá)量。[結(jié)論]L-orfH79是不同于YTA的新型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，L-Rf5、L-Rf6可作為其恢復(fù)系。

關(guān)鍵詞 水稻;細(xì)胞質(zhì)雄性不育系;L-orfH79;育性

中圖分類號(hào) S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）15-0097-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract[Objective]In order to verify the difference between the new cytoplasmic male sterile line LorfH79 and its isonuclear alloplasmic sterile lines HLCMS YTA.[Method]LorfH79 and YTA were identified by molecular markers orfH79 and orf290， of which pollen dyeing characteristics， pollen fertility， seed setting rate and expression level of orfH79 were compared.[Result]It showed that both orfH79 and orf290 in YTA， while LorfH79 only contained orfH79 but not orf290 by molecular marker identification. The starch deposition of LorfH79 pollen was less than that of YTA. The size of LorfH79 pollen was uniform， but the morphology of YTA pollen was different. The pollen fertility， bagging seed setting rate and natural seed setting rate of LorfH79（all below 10%） were slightly higher than YTA （all below 5%）. Pollen morphology and color returned to normal when the restorer gene Rf5 or Rf6 was introduced into LorfH79. The expression of orfH79 in flag leaves of LorfH79 was lower than that of YTA. The expression of orfH79 reduced in sterile line LorfH79 after introducing Rf5 or Rf6.[Conclusion]LorfH79 is a new cytoplasmic male sterile line that different from YTA. LRf5 and LRf6 can be used as restorer lines.

Key words Rice;Cytoplasmic male sterility;LorfH79;Fertility

基金項(xiàng)目 湖北省技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2018BFC360）;湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018CFB481）;中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（CZY18029，CZP17017）。

作者簡(jiǎn)介 李佳洋（1992—），男，湖北來鳳人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。*通信作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事分子遺傳學(xué)研究。

收稿日期 2019-03-16

水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育是在發(fā)育過程中雌蕊正常而花粉敗育的現(xiàn)象，屬于母性遺傳，而特定的基因可以使其育性得到恢復(fù)。根據(jù)雜種F1代所產(chǎn)生的攜帶S（rf）基因型的雄配子的育性表型，可將CMS細(xì)胞質(zhì)劃分為孢子體細(xì)胞質(zhì)雄性不育（sporophytic type）和配子體細(xì)胞質(zhì)雄性不育（gametophytic type）2種類型[1-2]。孢子體細(xì)胞質(zhì)雄性不育其雄配子（花粉）的育性受孢子體（植侏）的基因型控制，而與雄配子本身所攜帶的核基因無關(guān)。配子體細(xì)胞質(zhì)雄性不育其雄配子的育性直接由雄配子（花粉）本身的基因型所決定，與孢子體（植株）基因型無關(guān)[3]。水稻花粉敗育分典敗、圓敗和染敗，用I2-KI染色后分別呈現(xiàn)出皺縮不著色，圓形不著色，圓形著色淺且大小不一。1972年，朱英國院士利用紅芒野生稻作母本、蓮塘早栽培稻作父本雜交，后代得到雄性不育株連續(xù)回交多代得到穩(wěn)定的紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系HL-CMS YTA，屬配子體不育，YTB是YTA的同核異質(zhì)保持系[4]。orfH79是YTA中atp6下游200 bp處的可編碼79個(gè)氨基酸的嵌合片段，ORFH79通過與紅蓮雄性不育水稻細(xì)胞質(zhì)電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅲ亞基相互作用而損害線粒體功能最終導(dǎo)致不育[5]。orfH79與BT-CMS中的不育基因orf79有96%的同源性[6-7]。HL-sp1是從YTA克隆的與orfH79沒有序列同源性的HL-CMS不育相關(guān)的候選基因片段[8]，通過Tail-PCR 將該片段擴(kuò)大至6.7 kb[9]，在HL-sp1中預(yù)測(cè)到一個(gè)新的不育候選基因orf290，因此YTA中包含至少2種不育基因orfH79和orf290[10]。利用orfH79和orf290這2個(gè)分子標(biāo)記，從102份AA基因型野生稻中篩選得到了6個(gè)只含有orfH79而不含有orf290的品種，經(jīng)與YTB反復(fù)回交并結(jié)合分子標(biāo)記篩選，獲得了與紅蓮水稻不育系YTA同核異質(zhì)的近等基因不育系，命名為L-orfH79[11]。前期實(shí)驗(yàn)室還以YTA作母本構(gòu)建了YTA的同質(zhì)異核近等基因恢復(fù)系L-Rf5和L-Rf6[12]，它們可以穩(wěn)定地恢復(fù)L-orfH79的育性。該研究擬通過DNA水平、RNA表達(dá)水平及花粉形態(tài)及育性幾個(gè)方面比較具有相同的核背景但是細(xì)胞質(zhì)不一樣的L-orfH79和YTA的區(qū)別與聯(lián)系，為該不育系的科研價(jià)值和應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型胞質(zhì)不育系L-orfH79不育基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

用orfH79和orf290 2個(gè)分子標(biāo)記在L-orfH79材料和YTA、YTB中擴(kuò)增，結(jié)果表明YTA和L-orfH79材料都含有orfH79，同時(shí)YTA還含有orf290，但L-orfH79材料不含orf290（圖1）。

2.2 新型胞質(zhì)不育系L-orfH79花粉形態(tài)特征

對(duì)新型胞質(zhì)不育系L-orfH79花粉用1% I2-KI染色，相同觀測(cè)條件下L-orfH79的淀粉沉積比YTA更少（圖2）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示L-orfH79花粉幾乎全為不育，85%屬于圓敗，8%屬于典敗，L-orfH79花粉大小十分均勻。而YTA的花粉84%屬于圓敗，13%屬于典敗，形態(tài)不一。當(dāng)L-orfH79中引入恢復(fù)基因Rf5或者Rf6后花粉形態(tài)和顏色都恢復(fù)正常。

2.3 新型胞質(zhì)不育系L-orfH79育性特征

分別統(tǒng)計(jì)8株

L-orfH79與YTA的育性，結(jié)果如表2。就花粉育性而言，L-orfH79為8.0%，略高于YTA的3.5%;L-orfH79的套袋結(jié)實(shí)率為6.9%，比YTA的3.1%略高;自然結(jié)實(shí)率L-orfH79為85%，略高于YTA的4.7%。綜上所述，從花粉育性、套袋結(jié)實(shí)率、自然結(jié)實(shí)率3個(gè)方面都說明L-orfH79不同于YTA，YTA的育性更低且更穩(wěn)定，但是 L-orfH79的育性也十分接近一個(gè)成熟不育系的育性。

2.4 不育基因orfH79相對(duì)表達(dá)量的比較分析

為了分析YTA和L-orfH79在不育基因orfH79表達(dá)量上的區(qū)別以及恢復(fù)基因Rf5、Rf6對(duì)orfH79表達(dá)量的影響，提取YTA、L-orfH79、L-orfH79/L-Rf5、L-orfH79/L-Rf6抽穗期劍葉中RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA后用內(nèi)參基因cob檢測(cè)其質(zhì)量，檢測(cè)結(jié)果顯示質(zhì)量很好（圖3），可以進(jìn)行后續(xù)表達(dá)量分析。不同材料中orfH79的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果表明L-orfH79抽穗期劍葉中orfH79的表達(dá)量低于YTA中，在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后會(huì)減少orfH79的表達(dá)量（圖4）。

3 討論

通過與YTB反復(fù)回交多代，并用分子標(biāo)記orfH79和orf290篩選得到只含有orfH79的不育系 L-orfH79和同時(shí)含有 orfH79和orf290的不育系YTA。有研究表明這種構(gòu)建不育系的方式可以得到核背景一樣但細(xì)胞質(zhì)不同的不育系[13-14]。該研究從DNA水平、RNA水平和花粉鏡檢以及結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)等方面對(duì)L-orfH79和YTA進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)它們有本質(zhì)的區(qū)別，L-orfH79比YTA少了不育基因orf290，且YTA中的orf290在不同部位都有一定的表達(dá)量[15]。L-orfH79中orfH79的相對(duì)表達(dá)量低于YTA，但是卻有著和YTA相近的不育特征，這都說明了L-orfH79是一種不同于YTA的不育系，且育性可以被恢復(fù)基因Rf5或Rf6通過下調(diào)orfH79的表達(dá)量而恢復(fù)。這為紅蓮型水稻胞質(zhì)雄性不育的核質(zhì)互作機(jī)理研究提供了種質(zhì)資源。豐富了三系雜交水稻的多樣性，將為不育基因后期理論研究和應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。但是L-orfH79和YTA主要不育機(jī)理的區(qū)別還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]LAUGHNAN J R，GABAYLAUGHNAN S.Cytoplasmic male sterility in maize[J].Ann Rev Genet，1983，17：27-48.

[2]SCHNABLE P S，WISE R P.The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration[J].Trends Plant Sci，1998，3（5）：175-180.

[3]朱英國.水稻雄性不育生物學(xué)[M].武漢：武漢大學(xué)出版社，2000：111-112，115

[4]武漢大學(xué)遺傳研究室.紅芒野稻—蓮塘早不育系花粉敗育過程的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[J].武漢力學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1977（1）：5-12.

[5]WANG K，GAO F，JI Y X，et al.ORFH79 impairs mitochondrial function via interaction with a subunit of electron transport chain complex III in Honglian cytoplasmic male sterile rice[J].New phytologist，2013，198（2）：408-118.

[6]龍偉雄，廖佛才，鄭卓，等.水稻配子體細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因orf79/orfH79的變異多態(tài)性研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，35（5）：101-106.

[7]易平，汪莉，孫清萍，等.紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育線粒體相關(guān)嵌合基因的發(fā)現(xiàn)[J].科學(xué)通報(bào)，2002，47（2）：130-133.

[8]劉學(xué)群.水稻紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育候選基因的篩選與恢復(fù)基因的精細(xì)定位[D].武漢：武漢大學(xué)，2004.

[9]李丕順，劉學(xué)群，王春臺(tái)，等.TAIL-PCR對(duì)紅蓮型水稻不育系特異片段HL-sp1側(cè)翼序列的分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47（2）：123-126.

[10]楊夢(mèng)醒，姜慧，田澤，等.水稻線粒體基因orf290功能的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，37（6）：1-6.

[11]劉京.水稻兩種新型胞質(zhì)不育系及其恢復(fù)系的篩選[D].武漢：中南民族大學(xué)，2015.

[12]華宇峰.紅蓮型CMS近等基因恢復(fù)系及同核異質(zhì)不育系的構(gòu)建[D].武漢：中南民族大學(xué)，2014.

[13]李陽生，李紹清，朱仁山，等.生物技術(shù)在水稻超高產(chǎn)育種中的應(yīng)用[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（5）：701-706.

[14]劉京，劉杰，喻博倫，等.新型不育胞質(zhì)在栽培稻中的分布與鑒定[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（23）：43-46.

[15]陳為，周杰，譚艷平，等.水稻HL-CMS中2個(gè)雄性不育候選基因表達(dá)模式的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（4）：394-397.