沈文俊 趙吉強

摘要[目的]探究9個品系小麥分蘗相關(guān)基因TaSPL17基因表達與單株分蘗力強弱的關(guān)系。[方法]通過實時熒光定量PCR技術(shù)，從基因表達水平角度，分析9個品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量與不同品系小麥分蘗力強弱的關(guān)系。[結(jié)果]不同品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因表達存在顯著差異，單株分蘗力較強的多穗型品系煙農(nóng)19、瑞豐1號、Bonito-32，TaSPL17基因表達處于相對較低水平;分蘗力中等的中大穗型品系濟麥22、石優(yōu)17、衡06-6632、濟寧936098，TaSPL17基因表達處于相對中等水平;分蘗數(shù)較少的大穗型品系蘭考906、泰山021，TaSPL17基因表達處于相對較高水平，TaSPL17基因?qū)π←渾沃攴痔Y力具有調(diào)控作用。[結(jié)論]為研究小麥分蘗力強弱能力提供了基因表達水平上的理論依據(jù)，為選育理想株型提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 小麥;分蘗;TaSPL17;理想株型

中圖分類號 S188文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0101-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.028

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract[Objective]To explore the relationship between the expression of TaSPL17 gene related to wheat tillering in 9 wheat lines and the tiller ability of individual plants.[Method]From the perspective of gene expression， the relationship between the relative expression of TaSPL17 gene in the stem of 9 wheat lines at the tillering stage and the tillering ability of different lines wheat lines were analyzed by the quantitative realtime PCR.[Result]There were significant differences in the expression of TaSPL17 gene in the stem of different wheat lines at tillering stage. TaSPL17 gene expression level was relatively low in multispike lines with strong tillering ability， such as Yannong 19， Ruifeng 1 and Bonito32; the TaSPL17 gene expression was at a relatively moderate level in mediumlarge spike lines with medium tillering ability， such as Jimai 22， Shiyou 17， Heng 06-6632 and Jining 936098;TaSPL17 gene expression was relatively high in large spike lines with few tillering ability， such as Lankao 906 and Taishan 021， TaSPL17 gene had regulation effect on tillering ability of wheat.[Conclusion]The results provide a theoretical basis for the gene expression of tiller ability and the breeding of ideotype.

Key words Wheat;Tiller;TaSPL17;Ideotype

作者簡介 沈文?。?993—），女，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向：植物分子發(fā)育生物學。*通信作者，副教授，博士，從事植物分子發(fā)育生物學研究。

收稿日期 2019-05-06

小麥（Triticum aestivum L.）作為世界上最重要的糧食作物之一，為全球超過1/3的人口提供主要食糧。提升糧食產(chǎn)量是育種工作者的主要目標，同時挖掘糧食產(chǎn)量潛力也是我國小麥品種改良的長期任務。隨著分子生物學的發(fā)展，挖掘和利用提升產(chǎn)量的基因資源，將會為高產(chǎn)、高抗小麥新品種的培育提供科學的資源保障。小麥在完成植物生活史的過程中會經(jīng)歷種子萌發(fā)、營養(yǎng)生長、生殖生長和衰老凋亡等一系列的發(fā)育階段，每個階段都表現(xiàn)出獨有的形態(tài)學和生理學上的特征。從拔節(jié)期到孕穗期，小麥經(jīng)歷了從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變。莖尖分生組織由產(chǎn)生新葉轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)生幼穗。從穗的形成、花的發(fā)育再到開花，各個發(fā)育階段都會影響籽粒的最終產(chǎn)量[1]。

小麥從營養(yǎng)生長到生殖生長的各個階段都會有新的植物器官形成，這些器官發(fā)育程度、形成時期、過渡時機都會對小麥的最終產(chǎn)量造成較大的影響。例如，花從營養(yǎng)生長到開花的正確時機對于確保結(jié)實成功至關(guān)重要，一個小的開花時間延遲會導致生物量和產(chǎn)量增加，過早開花則會導致生物量和種子量減少[2]。植物株型同樣是決定產(chǎn)量的主要因素之一。株型包括植株的高度，莖稈的粗壯程度，分蘗力的強弱，葉片的寬度、厚度以及夾角等。農(nóng)作物產(chǎn)量與農(nóng)作物單株形態(tài)建成有著必然的聯(lián)系，植物理想株型應具備莖稈粗壯抗倒伏，分蘗數(shù)、葉片寬厚及夾角合理，耐受生物脅迫和非生物脅迫的能力等要素。隨著農(nóng)作物分子育種的快速發(fā)展，育種工作者有望在小麥中實現(xiàn)理想株型的概念。

SPL（SQUAMOSA-promoter binding proteinlike）基因是編碼植物蛋白的一類轉(zhuǎn)錄因子，在基因結(jié)合位點處富含GTAC序列，該序列是SBP結(jié)構(gòu)域的核心基序，具高度保守性，SBP-box轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物營養(yǎng)生長和生殖生長階段轉(zhuǎn)變、花器官和果實發(fā)育、光信號轉(zhuǎn)導及植株形態(tài)建成等諸多發(fā)育階段中起到至關(guān)重要的作用[3]。迄今為止僅在高等綠色植物中發(fā)現(xiàn)此類家族基因，最初從金魚草花序cDNA文庫中篩選得到，因其具有SQUAMOSA啟動子結(jié)合活性且能夠結(jié)合花器官分生組織決定基因而命名。SPL家族基因是調(diào)控植物株型的重要基因，近年來在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)17個SPL家族基因，農(nóng)作物水稻中發(fā)現(xiàn)19個SPL家族基因以及小麥中發(fā)現(xiàn)58個SPL家族基因[4-6]。對這些植物SPL家族基因的研究發(fā)現(xiàn)，它們大多數(shù)都具有miR156/157識別位點，其轉(zhuǎn)錄翻譯受到miR156/157的調(diào)控，參與了植物生長發(fā)育的各個階段，包括在植物形態(tài)建成與器官發(fā)育的整個過程中，例如在植物根系生長、植物葉片發(fā)育、植物分蘗形成、植物花器官發(fā)育和果實成熟、生物脅迫與非生物脅迫的應答以及植物激素信號轉(zhuǎn)導等多個方面都發(fā)揮了重要的作用[7]。

在農(nóng)作物形態(tài)建成方面，分蘗是水稻、小麥等主要禾本科植物的重要農(nóng)學性狀，小麥產(chǎn)量的構(gòu)成因素包括單位面積上小麥穗數(shù)、穗粒數(shù)以及千粒重3個重要因素，分蘗力的強弱又與農(nóng)作物成穗率直接相關(guān)，從而間接地影響農(nóng)作物單位面積的產(chǎn)量[1]。分蘗不僅受到植物激素的調(diào)控，而且受到分蘗相關(guān)基因的調(diào)控。在水稻理想株型研究中，SPL家族基因在其形態(tài)建成中的作用至關(guān)重要，例如OsSPL8在葉耳的發(fā)育方面起作用;OsSPL14具有減少分蘗、增加產(chǎn)量的作用;OsSPL16具有減少分蘗，控制籽粒大小、形狀的作用等。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，將水稻OsSPL14基因過量表達會使植株分蘗數(shù)降低、莖稈粗壯抗倒伏，增加植株產(chǎn)量[8-10]。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)IPA1基因可以直接綁定到水稻控分蘗基因OsTB1的啟動子上，激活OsTB1的表達，抑制水稻分蘗芽的生長，減少植株分蘗數(shù)[11]。結(jié)合水稻研究成果，在小麥中克隆得到OsIPA1/OsSPL14的直系同源基因TaIPA1/TaSPL17，研究發(fā)現(xiàn)TaSPL17基因在小麥穗部和莖基部表達量較高[12-13]，表明TaSPL17基因可能與小麥的分蘗有關(guān)，并且可能會使小麥增產(chǎn)[14]。筆者通過對9個品系小麥分蘗期莖基部組織材料分蘗相關(guān)基因TaSPL17基因相對表達量進行分析，結(jié)合不同品系小麥單株分蘗力強弱，探究不同品系小麥分蘗相關(guān)基因TaSPL17基因表達與單株分蘗力強弱的關(guān)系，為選育理想株型提供分子生物學理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用單株分蘗力較強的多穗型品系煙農(nóng)19、瑞豐1號、Bonito-32，分蘗力中等的中大穗型品系濟麥22、石優(yōu)17、衡06-6632、濟寧936098，以及分蘗數(shù)較少的大穗型品系蘭考906、泰山021。高純度種子由煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取。在小麥分蘗期分別取得9個品系小麥莖基部組織材料，采用艾德萊生物（Aidlab）公司生產(chǎn)的EASY spin植物RNA快速提取試劑盒，按照說明書中步驟提取小麥材料的總RNA，并對提取的RNA進行質(zhì)量檢測。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄。取1 μg左右的總RNA，將提取的9種樣品采用兩步法進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應體系及程序為：第一步（10.0 μL體系：總RNA 1.0 μg，Oligo dT 1.0 μL，RNase Free ddH2O補齊至10.0 μL;程序：72 ℃，30 min，放置于冰上保存），第二步（20.0 μL體系：第一步產(chǎn)物10.0 μL，5×Buffer 4.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，RNA Inhibitor 0.2 μL，M-MLV 1.0 μL，RNase Free ddH2O補齊至20.0 μL;程序：42 ℃，90 min;70 ℃，15 min）。反應結(jié)束后將cDNA稀釋20倍后于-20 ℃保存，作為熒光定量PCR的模板。

1.2.3 實時熒光定量PCR。通過對實時熒光定量PCR引物進行優(yōu)化，設(shè)計并篩選出TaIPA1基因定量分析引物，使用德國生產(chǎn)的Rotor Gene Q儀器及Vazyme公司生產(chǎn)的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR反應，檢測TaSPL17基因相對表達量，分析小麥分蘗相關(guān)基因TaSPL17的表達結(jié)果，結(jié)合不同品系小麥分蘗力的強弱，探究兩者之間的關(guān)系。

1.3 數(shù)據(jù)分析

定量結(jié)果、熔解曲線分析用Rotor-Gene Q series software完成。利用Excel 2016軟件作圖、作表及誤差處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系小麥分蘗期莖基部總RNA提取

將9個品系的小麥分蘗期莖基部組織材料使用RNA快速提取試劑盒提取總RNA。經(jīng)超微量分光光度計檢測RNA樣品濃度和純度，結(jié)果顯示：所有樣品A260/A280的比值均在1.988～2021，A260/A230的比值均在2.038～2.324，濃度值均在1 780～2 760 ng/μL，說明所提取的RNA均濃度高、純度好、無雜質(zhì)或小分子物質(zhì)污染。將RNA樣品在1%瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，樣品均呈現(xiàn)出比較清晰的18S和28S這2條主帶（圖1），表明所提取的樣品RNA具有較好的完整性，樣品質(zhì)量較高，可以用于反轉(zhuǎn)錄反應。

2.2 不同品系小麥分蘗期TaSPL17基因相對表達量分析

以提取的9個品系小麥分蘗期莖基部總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，對實時熒光定量PCR引物進行優(yōu)化，設(shè)計并篩選出TaIPA1基因定量分析引物，選擇TaGAPDH和TaeEF作為內(nèi)標基因（表1），經(jīng)PCR驗證后得出3對引物共同的最佳退火溫度為60 ℃。使用Vazyme公司生產(chǎn)的含有SYBR Green I染料的熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR反應，反應程序設(shè)定為預變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃30 s進行40個循環(huán)。每個樣品都做重復對照，反應結(jié)束后對所有樣品的熔解曲線（圖2）進行分析，確?；蛱禺愋詳U增，并采用雙內(nèi)參計算法計算TaSPL17基因相對表達量（圖3）。從熔解曲線可以看出，利用不同內(nèi)參引物及目標基因引物進行PCR擴增時，擴增產(chǎn)物均為單峰，說明基因?qū)崿F(xiàn)特異性擴增，且不同引物的熔解溫度之間存在差異。使用雙內(nèi)參法計算基因相對表達量可進一步對試驗數(shù)據(jù)進行校正，減小試驗誤差。

從定量分析作圖結(jié)果來看，不同品系小麥分蘗期分蘗相關(guān)基因TaSPL17基因表達存在明顯差異，所選材料瑞豐1號、煙農(nóng)19和Bonito-32品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量處于較低水平;衡06-6632、石優(yōu)17、濟寧936098、濟麥22品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量處于中等水平;泰山021、蘭考906品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量處于較高水平。

3 結(jié)論與討論

結(jié)合水稻方面的研究成果，與水稻OsIPA1/OsSPL14基因直系同源的小麥TaIPA1/TaSPL17基因可能具有相同的生物學功能，即該基因表達上調(diào)會使植株分蘗數(shù)降低、莖稈粗壯抗倒伏，增加植株產(chǎn)量。由此，根據(jù)所選材料定量分析結(jié)果可以看出瑞豐1號、煙農(nóng)19和Bonito-32品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量與其他6個品系相比表達較低，結(jié)合這3個品系具有單株分蘗力較強、多穗的特點可以得出TaSPL17基因表達下調(diào)會使小麥單株分蘗力增強;衡06-6632、石優(yōu)17、濟寧936098和濟麥22品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量與其他5個品系相比表達中等，結(jié)合這4個品系具有分蘗力中等，穗型中、大的特點可以得出TaSPL17基因表達處于中等水平時，小麥的形態(tài)建成有利于提升產(chǎn)量，符合理想株型的概念[15];泰山021、蘭考906品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量與其他7個品系相比較高，結(jié)合這2個品系具有分蘗數(shù)較少、穗大的特點可以得出TaSPL17基因表達上調(diào)會使小麥單株分蘗力減弱。結(jié)合不同品系小麥分蘗能力及穗型等特點可以得出，與水稻理想株型形態(tài)建成相關(guān)基因水稻OsIPA1/OsSPL14的直系同源基因TaIPA1/TaSPL17在小麥中具有相同的生物學功能，并且結(jié)果表明，小麥TaIPA1/TaSPL17基因在不同品系的小麥分蘗期都具有調(diào)控分蘗能力的作用，對于分蘗數(shù)多少、穗型大小造成不同的影響。由此得知，小麥TaIPA1/TaSPL17基因在小麥單株形態(tài)建成及單株產(chǎn)量方面具有重要作用。

通過對小麥分蘗期莖基部組織材料TaSPL17基因定量表達分析，從基因表達水平角度初步探究9個品系小麥分蘗力強弱與分蘗相關(guān)基因TaSPL17基因表達之間的關(guān)系，為選育理想株型小麥、提升作物產(chǎn)量提供分子生物學理論基礎(chǔ)。對于小麥TaSPL17基因拓展研究應用以及在農(nóng)作物分子育種上應用，有望使農(nóng)作物提升產(chǎn)量，但是農(nóng)作物產(chǎn)量不僅受植株形態(tài)建成的影響，而且受氣候條件、溫度條件、土壤條件、種植模式等因素的影響。

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