張苗苗 倪永清

摘要[目的]對新疆哈密地區(qū)原駝乳中乳酸菌的多樣性進行分析。[方法]采用菌落培養(yǎng)及Rep-PCR指紋圖譜、16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相結(jié)合的方法研究原駝乳內(nèi)乳酸菌的菌群分布。[結(jié)果]從9份原駝乳中分離出65株乳酸菌，分別歸屬于Lactococcus、Streptococcus、Enterococcus、Lactobacillus和Leuconostoc 5個屬，其中Leuconostoc所占比例最大，達到26%。[結(jié)論]新疆哈密地區(qū)原駝乳中蘊含豐富的乳酸菌菌種資源，為開發(fā)新疆地區(qū)益生乳酸菌提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞 原駝乳;乳酸菌;16S rRNA基因測序

中圖分類號 TS207.3文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0163-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.046

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract[Objective]To analyze the diversity of lactic acid bacteria in raw camel milk in Hami area of Xinjiang.[Method]The diversity of lactic acid bacteria was analyzed by using pure culture，repetitive genomic fingerprinting （RepPCR） analysis patterns and 16S rRNA gene sequence and phylogenetic relationship in the raw camel milk.[Result]A total of 65 strains of lactic acid bacteria were obtained from nine raw camel milk samples.The results showed that the isolated lactic acid bacteria mainly comprised five genera：Lactobacillus，Enterococcus，Streptococcus， Lactococcus， and Leuconostoc.The dominant genus was Leuconostoc，which is up to 26%.[Conclusion]The abundant diversity of lactic acid bacteria in the raw camel milk of Hami area in Xinjiang provided rich resources for exploiting probiotic lactic acid bacteria products.

Key words Raw camel milk;Lactic acid bacteria;16S rRNA gene sequence

作者簡介 張苗苗（1988—），女，新疆石河子人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者，博士，教授，從事食品微生物、生物技術(shù)研究。

收稿日期 2019-03-22;修回日期 2019-05-07

隨著經(jīng)濟水平的不斷提高，人們更加關(guān)注健康問題。乳制品不再僅限于牛乳，營養(yǎng)豐富的羊乳和駱駝乳等也漸漸進入人們的視野[1]。駱駝，早在幾千年以前就被馴化，作為一種交通工具，它為物品的運輸和文化的傳播做出了不可磨滅的貢獻[2]。當(dāng)前我國有25萬峰的駱駝存欄數(shù)，新疆作為一個畜牧大區(qū)，駱駝存欄數(shù)就達到了16萬峰，居全國之首[3]。

駱駝奶有“沙漠軟白金”和“長壽奶”的美譽[4]，其味道微甜，而且與人奶中的營養(yǎng)成分很接近，比牛奶的營養(yǎng)價值還高[5]。駱駝乳中的乳蛋白、乳脂肪、乳糖、干物質(zhì)含量比牛乳略高，與牛乳相比含有豐富的礦物質(zhì)元素，鈣、磷、鉀的含量更高，鎂的含量相對較低[1]。據(jù)現(xiàn)代藥理研究表明，駝乳具有抗氧化、保肝、消炎、抗菌的作用[6]，常喝駝乳可以滋養(yǎng)美容，增強抵抗力[7]，也可用于治療糖尿病、結(jié)核病和女性疾病，防止兒童佝僂病等[8]。駝奶作為新疆的主要特色乳，其研究和利用價值極其重要。目前，隨著我國駱駝數(shù)量的逐漸下降，國家出臺了一系列鼓勵和支持特種乳發(fā)展的產(chǎn)業(yè)政策，新疆具有得天獨厚的自然環(huán)境以及豐富的飼草資源[9]，一些少數(shù)民族自古就有飼養(yǎng)駱駝的傳統(tǒng)，飲用駝乳及加工駝乳制品也有非常悠久的歷史。在長期的自然演變中[10]，對人類有益的微生物群落在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中被大量保留下來，特別是乳酸菌[11]。這些乳酸菌資源是探索未知有益乳酸菌的絕佳寶庫[12]。新疆原奶資源豐富，采用古老、傳統(tǒng)的方法，將發(fā)酵性能好、生命力強、傳代好、具有地方特色的乳酸菌菌株從當(dāng)?shù)啬撩裆a(chǎn)的發(fā)酵奶制品中分離出來具有重要意義。這為今后研發(fā)和加工駝乳積累了經(jīng)驗[13]。目前，國內(nèi)外對于駝奶的研究主要集中于成分、微生態(tài)、醫(yī)藥價值等方面[14]，在我國有關(guān)駝奶和酸駝奶的報道極少[15]。為此，筆者對新疆哈密地區(qū)原駱駝奶乳酸菌進行初步分離、鑒定和遺傳多樣性分析，以促進原料駱駝奶和酸駱駝奶的開發(fā)和研究并篩選出具有良好發(fā)酵性能的菌株，旨在為生產(chǎn)乳酸菌發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器。

用于PCR擴增的全套試劑及擴增引物購自TaKaRa公司;PCR 儀為德國Biometra公司Tprofessional;電泳儀為美國BioRad公司PowerPac Universal;凝膠成像系統(tǒng)為法國Vilber多功能成像系統(tǒng);生物顯微鏡為徠卡DM3000;高速冷凍離心機為Fresco21型（德國Thermo公司）。

1.1.2 樣品和培養(yǎng)基。

該研究9份原駝奶于2017年9月采自哈密地區(qū)（HMT）各草原牧民家里。無菌收集約40 mL樣品于50 mL無菌離心管中，置于4 ℃的車載冰箱，24 h內(nèi)運回實驗室，在無菌操作臺上立即處理。實驗人員在無菌條件下收集樣品，后由實驗人員立即將裝有25 mL奶樣的無菌離心管放置在4 ℃的車載冰箱內(nèi)，24 h內(nèi)運回實驗室，-20 ℃保存，并盡快進行乳酸菌的分離。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母提取物5.0 g，K2HPO4 2.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 025 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4。

M17培養(yǎng)基和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化。

參考Lee等[16]的方法，在無菌條件下吸1 mL 樣品于9 mL的無菌生理鹽水中，振蕩混勻，采用梯度稀釋液涂板法在MRS固體培養(yǎng)基、乳桿菌選擇培養(yǎng)基、M17瓊脂培養(yǎng)基上37 °C倒置培養(yǎng)48 h。從3種選擇性培養(yǎng)基中挑取菌落顏色、大小、形態(tài)等不同的單菌落，接種于 MRS 瓊脂培養(yǎng)基上，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次后，觀察記錄菌落形態(tài)并進行接觸酶試驗。挑取過氧化氫酶試驗為陰性菌落接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)24 h培養(yǎng)后進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞形態(tài)及排列方式，最終將革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株確定為疑似乳酸菌，在新鮮培養(yǎng)基中補充25% 的甘油重懸菌體置于-80 ℃ 保藏。

1.2.2 乳酸菌Rep-PCR指紋圖譜分析。參考Justé等[17]的方法提取菌株DNA，選用（GTG）5（5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′）對疑似乳酸菌菌株進行Rep-PCR的擴增。將PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行檢測，在1×TAE Buffer中100 V電泳1.5 h。用凝膠成像系統(tǒng)觀察并進行拍照分析[18]。以（GTG）5（5′-GTGGTGGTGGTGGTG-3′）為引物，以篩選出乳酸菌的DNA為模板，進行Rep-PCR的擴增。將PCR的擴增產(chǎn)物在1.5%（W/V）的瓊脂糖凝膠上上樣，電泳液為1×TBE Buffer，電壓100 V，電泳30～60 min，待樣品移至3/4位置時停止電泳。在紫外凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果并進行拍照，用軟件Gel Compar Ⅱ 對DNA圖譜進行聚類分析，電泳后條帶完全一致的菌株通常被認(rèn)為是屬于同一個屬或者同一物種，因此可將分離篩選到的菌株對照指紋圖譜歸為若干組種系型，然后從每組中選取至少1～2株代表菌株進行測序分析。

1.2.3 16S rRNA 基因的系統(tǒng)進化。

選取1～2株指紋圖譜帶型相同菌株

作為代表，采用通用引物27f/1492r進行16S rRNA擴增[19]。擴增產(chǎn)物送至上海生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序得到的16S rRNA序列與GEN-BANK數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)菌株進行BLAST同源性比對分析。從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)屬、種的16S rRNA基因序列，運用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化

依據(jù)菌落特征、細(xì)胞形態(tài)特征從9份樣品中初步分離純化得到176株純培養(yǎng)物，經(jīng)革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗得到69株疑似乳酸菌（表1）。其中大部分菌株菌落顏色為白色、灰白色，邊緣整齊的圓形凸起，表面較濕潤，易挑起，直徑大部分在0.5～1.0 mm。

2.2 菌株Rep-PCR指紋圖譜

根據(jù)指紋圖譜條帶大小和數(shù)量差異，從69株疑似乳酸菌中挑出21株代表菌株，指紋圖譜如圖1。

47卷15期張苗苗等 新疆哈密地區(qū)原駝乳中乳酸菌多樣性分析

2.3 16S rRNA 測序結(jié)果

將提取出來的DNA以27F和1492R為引物經(jīng)過PCR擴增，產(chǎn)物可通過電泳檢測是否有DNA，擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以清楚看到，在1 500 bp處有一條明亮的條帶，說明挑選出的菌株16S rRNA基因擴增的產(chǎn)物可以滿足送去測序的基本要求。筆者將出現(xiàn)彌漫現(xiàn)象和不滿足測序的菌株剔除，最終將21株滿足測序要求的菌株低溫保存運往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序分析。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和乳酸菌的鑒定結(jié)果 將測序結(jié)果通過BLAST在線分析，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行對比，選取同源性大于98%的序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

由圖3可以看出，21株代表菌株分別被歸屬于Lactococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Streptococcus 和 Enterococcus 5個屬，Lactococcus garvieae （2株）、Leuconostoc lactis（9株）、Lactobacillus helveticus（1株）、 Lactococcus lactis（2株）、Streptococcus orisasini（1株）、Streptococcus sp（2株）、Enterococcus faecium（1株）、Lactobacillus kefiri（1株）、Leuconostoc mesenteroides（1株）、Leuconostoc garlicum（1株）10個種。

2.5 原駝乳中乳酸菌優(yōu)勢菌種的分析

將從新疆哈密地區(qū)采集回來的9份駝奶樣品，通過生理生化鑒定以及Rep-PCR指紋圖譜分析并結(jié)合16S rRNA 基因序列鑒定分析，確定的乳酸菌有65株。

[12]王一迪.新疆伊犁地區(qū)原牛乳中乳酸菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育研究[D].石河子：石河子大學(xué)，2017.

[13]徐敏，陸東林，羅曉紅，等.新疆雙峰駝駝乳成分及特性分析[J].中國奶牛，2014（15）：49-52.

[14]孫天松，王俊國，張列兵，等.中國新疆地區(qū)酸馬奶中乳酸菌生物多樣性研究[J].微生物學(xué)通報，2007，34（3）：451-454.

[15]馬兆瑞，秦立虎.現(xiàn)代乳制品加工技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2010.

[16]LEE S，LEE J，JIN Y I，et al.Probiotic characteristics of Bacillus strains isolated from Korean traditional soy sauce[J].LWTFood Science and Technology，2017，79：518-524.

[17]JUST A，THOMMA B P H J，LIEVENS B.Recent advances in molecular techniques to study microbial communities in foodassociated matrices and processes[J].Food microbiology，2008，25（6）：745-761.

[18]GEVERS D，HUYS G，SWINGS J.Applicability of repPCR fingerprinting for identification of Lactobacillus species[J].FEMS Microbiology Letters，2001，205（1）：31-36.

[19]倪亞雯，蘭國偉，楊尚嬌，等. 新疆不同地域發(fā)酵乳品中 Lactobacillus 多樣性的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2016，32（6）：104-109.

[20]TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology and evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[21]李偉程，侯強川，于潔，等.傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中微生物多樣性研究[J].食品工業(yè)科技，2018，39（1）：131-136.

[22]李遠，巴吐爾，張小燕，等.新疆哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳中乳酸菌的分離鑒定[J].中國食物與營養(yǎng)，2011，17（1）：54-58.

[23] ERCOLINI D，RUSSO F，F(xiàn)ERROCINO I，et al.Molecular identification of mesophilic and psychrotrophic bacteria from raw cow's milk[J].Food microbiology，2009，26（2）：228-231.

[24]TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular biology &evolution，2011，28（10）：2731-2739.